全 文 ：RP-HPLC法同时测定新疆紫草毛状根中乙酰紫草素
和 β, β′-二甲基丙烯酰紫草色素的含量＊
贺金华 1 ,芦韦华 2 ,王芳 2＊＊ ,毛艳1 ,严欢1
(1.新疆维吾尔自治区药物研究所 , 乌鲁木齐 830004;2.新疆农业大学农学院 ,乌鲁木齐 830052)
摘要　目的:建立高效液相色谱法(HPLC)测定新疆紫草毛状根中乙酰紫草素和 β, β′-二甲基丙烯酰紫草色素含量的方法。
方法:采用 YMCODS-AC18色谱柱(4.6 mm×150mm, 5μm), 流动相为乙腈 -水 -甲酸(700∶300∶0.5);检测波长为 275nm;
流速为 1.0 mL· min-1;柱温为 35℃。结果:β, β′-二甲基丙烯酰紫草素对照品浓度在 10.32 ～ 206.4μg· mL-1范围内与峰
面积线性关系良好 , r=0.9999;平均回收率为 99.6%, RSD为 1.7%(n=9)。 乙酰紫草素对照品浓度在 51.55 ～ 1031.0 μg·
mL-1范围内 , 与峰面积线性关系良好 , r=0.9999;平均回收率为 99.8%, RSD为 2.0%(n=9)。优化培养的毛状根中不含从
新疆紫草根中分离得到的紫草素;乙酰紫草素的含量明显高于 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素的含量。结论:高效液相色谱法操
作简单快速 , 重复性好 ,可用于新疆紫草毛状根中乙酰紫草素和 β, β′-二甲基丙烯酰紫草色素含量的测定。
关键词:新疆紫草;毛状根;紫草素;高效液相色谱法
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)10-1849-03
RP-HPLCdeterminationofβ, β′-dimethyacryshikoninand
acetylshikonininhairyrootsofArnebiaeuchromafromXinjiang＊
HEJin-hua1 , LUWei-hua2 , WANGFang2＊＊ , MAOYan1 , YANHuan1
(1.XinjiangInstituteofMateriaMedica, Urumqi830004, China;
2.ColegeofAgronomy, XinjiangAgriculturalUniversity, Urumqi830052, China)
Abstract　Objective:Toestablishamethodforthedeterminationofβ, β′-dimethyacryshikoninandacetylshiko-
ninthehairyrootsofArnebiaeuchroma(Royle)Johnst.Methods:TheRP-HPLCsystemconsistingofYMC-
PackODS-AC18 column(150mm×4.6mm, 5μm)andamixtureofacetonitrilesolutionandwatersolutionand
formicacidsolution(700∶300∶0.5)asthemobilephasewasadopted;thedetectionwavelengthwas275nm;theflow
ratewassetat1.0 mL· min-1andthecolumntemperaturewas35℃.Results:Thelinearresponserangesofβ, β′
-dimethyacryshikoninandacetylshikoninwere10.32-206.4 μg· mL-1(r=0.9999)and51.55-1031.0 μg
· mL-1(r=0.9999), repectively.Theaveragerecoveries(n=9)were99.6% and99.8%, respectively.There
wasnoshikonininthehairyroots, whichwasobstainedfromtherootsofArnebiaeuchroma(Royle)Johnst.The
contentofacetylshikoninishigherthanthecontentofβ, β′-dimethyacryshikonininhairyrootsobviously.Conclu-
sion:Themethodisquick, simpleandreproducibleforthedeterminationofβ, β′-dimethyacryshikoninandace-
tylshikonininhairyrootsofArnebiaeuchromasimultaneously.
Keywords:Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.;hairyroots;shikonin;HPLC
　　紫草 Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.是我国
民间常用的中草药 ,以根入药 ,富含萘醌类化合物 。
此类化合物具有显著的抗菌 、抗炎 、抗肿瘤等多种药
理活性 ,在传统的中药处方中用做抗炎药 ,退热药和
抗菌药 [ 1-4] 。但由于大量采挖使这一天然资源日
益贫乏 ,加之化学合成工艺繁杂 、收率低 、成本高 ,采
用毛状根培养获得有用的化合物是解决资源匮乏 、
克服化学合成困难的重要途径之一。查阅国内文
—1849—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(10)
＊
＊＊
国家自然科学基金资助项目(30560059);新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(200821170)
通讯作者　Tel:(0991)8762261;E-mail:wangfang1hao@126.com
DOI :10.16155/j.0254-1793.2010.10.013
献 ,未见新疆紫草毛状根定量分析的报道 ,本文采用
HPLC法测定了新疆紫草毛状根化学成分的含量 ,
表明新疆紫草毛状根具有与原植物相近的药用价
值 ,可以作为原料用于医药 、化妆品等领域 ,同时为
新疆紫草毛状根规模化生产紫草素提供了理论依
据 。
1　仪器与试剂
Shimadzu-LC2010C全自动液相色谱仪;Shi-
madzuCLASS-VPV6.14SP1数据工作站。新疆紫
草干燥根及毛状根株系 Aehrf07由新疆农业大学农
学院王芳教授提供 。对照品 β, β′-二甲基丙烯酰
紫草素购自中国药品生物制品检验鉴定所(批号:
11689-200501);紫草素和乙酰紫草素由新疆维吾
尔自治区药物研究所自制 , 采用 UV、IR、1H-
NMR、13C-NMR和 MS法鉴定结构 ,经 HPLC法检
查 ,纯度大于 98%。乙腈为色谱纯 ,甲酸 、甲醇均为
分析纯 ,水为纯蒸水。
2　方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱:YMC-Pack　ODS-AC18
柱(150×4.6mm, 5μm);流动相为乙腈 -水 -甲酸
(700∶300∶0.5);检测波长为 275nm;流速为 1.0mL
· min-1;柱温为 35 ℃。此色谱条件下 ,对照品和
毛状根样品的色谱图如图 1所示 。
图 1　对照品(A)、毛状根(B)和新疆紫草根(C)色谱图
Fig1　HPLCChromatogramsofreferencesubstance(A), hairyroots
(B)andArnebiaeuchroma(C)
1.乙酰紫草素(acetylshikonin)　2.β, β′-二甲基丙烯酰紫草素(β,
β′-dimethyacryshikonin)　 3.紫草素(shikonin)
2.2　紫草素 M9液体培养基悬浮培养　100 mL玻
璃三角烧瓶中添加 50 mLM9液体培养基 ,在超净
工作台中添加经过继代培养的新疆紫草毛状根 3 g
·瓶 -1 ,培养温度 25℃,转速 120 r· min-1 ,培养 30
d后 , 50℃烘干毛状根待测。
2.3　溶液制备
2.3.1　对照品溶液　称取 β, β′-二甲基丙烯酰紫
草色素约 5 mg,精密称定 ,置于 10 mL量瓶中 ,加甲
醇溶解并定容至刻度 ,摇匀 ,即得 516 μg· mL-1的
β, β′-二甲基丙烯酰紫草色素对照品溶液;称取乙
酰紫草素对照品约 25mg,精密称定 ,置于 25 mL量
瓶中 ,加甲醇溶解并定容至刻度 ,摇匀 ,即得 1030
μg· mL-1的乙酰紫草素对照品溶液。
2.3.2　供试品溶液　称取新疆紫草原植物干燥根
和毛状根各 10 g,精密称定 ,分别用石油醚回流提
取 ,共提取 3次 ,每次的溶剂用量 100 mL,提取液合
并 ,减压浓缩干燥 ,得原植物根提取物和毛状根提取
物。原植物根提取物用甲醇溶解 ,置 100 mL量瓶
中 ,并加甲醇定容至刻度 ,摇匀 ,精密移取 1.2 mL,
置 10mL量瓶中 ,加甲醇定容至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,取
续滤液 ,即得 。毛状根提取物用甲醇溶解 ,置 25 mL
量瓶中 ,并加甲醇定容至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤
液 ,即得。
2.4　线性关系考察
2.4.1　β, β′-二甲基丙烯酰紫草素　精密吸取 β,
β′-二甲基丙烯酰紫草素对照品(516 μg· mL-1)
溶液 2.5mL置 25mL棕色量瓶中 ,加甲醇定容至刻
度 ,摇匀 ,精密移取 0.5, 0.7 , 1.2, 1.7, 2.4, 3.6, 4.8
mL置 10 mL棕色量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀。分
别精密吸取上述溶液各 10 μL注入液相色谱仪 ,以
对照品浓度为横坐标 ,峰面积为纵坐标进行线性回
归 ,得回归方程为:
Y=9.707×106X+5.096×103　r=0.9999
结果表明 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素对照品浓度
在 10.32 ～ 206.4μg· mL-1范围内 ,与峰面积线性
关系良好 。
2.4.2　乙酰紫草素　精密吸取乙酰紫草素对照品
(1031.25μg· mL-1)溶液 3.0mL置 10mL棕色量
瓶中 ,加甲醇定容至刻度 ,摇匀 ,精密移取 0.1, 0.3,
0.5, 0.7, 1.0 , 1.5 mL置 10 mL棕色量瓶中 ,加甲醇
至刻度 ,摇匀。分别精密吸取上述溶液各 10 μL注
入液相色谱仪 ,以对照品浓度为横坐标 ,峰面积为纵
坐标进行线性回归 ,得回归方程为:
Y=9.766×106X+1.674×104　r=0.9999
结果表明乙酰紫草素对照品浓度在 51.55 ～ 1031.0
μg· mL-1范围内 ,与峰面积线性关系良好。
2.5　回收率试验　称取已知含量的毛状根供试品
—1850— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(10)
约 5 g,精密称定 ,分别加入 β, β′-二甲基丙烯酰紫
草素对照品 0.413, 0.516, 0.619 mg和乙酰紫草素
对照品 2.835 , 3.610, 4.383 mg,依毛状根供试品溶
液的制备方法制备各自的供试品溶液 ,依法测定 ,计
算回收率 。结果平均回收率分别为 99.6%,
99.8%;RSD分别为 1.7%, 2.0%(n=9)。
2.6　精密度试验　称取新疆紫草毛状根约 10g,精
密称定 ,依供试品溶液制备方法制备 ,同一供试品溶
液 ,连续进样 6次 ,每次进样 5 μL,注入液相色谱
仪 ,记录峰面积 ,结果 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素
和乙酰紫草素的 RSD分别为 1.7%和 0.59%,表明
仪器精密度良好 。
2.7　重复性试验　取同一批的新疆紫草毛状根供
试品 6份 ,每份约 10 g,精密称定 ,依供试品溶液制
备方法制备 6份供试品溶液 ,进样 5 μL,注入液相
色谱仪 ,记录峰面积 ,计算含量 ,结果 β, β′-二甲基
丙烯酰紫草素和乙酰紫草素含量的平均值分别为
0.011%, 0.88%;RSD分别为 2.1%, 0.41%。
2.8　供试品溶液稳定性实验　同一批供试品 ,按照
含量测定方法制成供试品溶液 ,室温放置 ,分别在不
同时间进样 ,进样量 5 μL,记录 β, β′-二甲基丙烯
酰紫草素和乙酰紫草素的峰面积 ,结果表明 , 24 h
内样品含量稳定 , RSD(n=7)分别为 1.6%,
0.85%。
2.9　样品含量测定　在前述色谱条件下 ,对新疆紫
草原植物根和不同培养条件的 3批新疆紫草毛状根
中 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素和乙酰紫草素进行
定量测定 ,计算新疆紫草原植物根和毛状根中这 2
个成分的含量。结果毛状根中 β, β′-二甲基丙烯
酰紫草素平均含量分别为 0.005%, 0.011%,
0.010%, 乙酰紫草素平均含量分别为 0.070%,
0.139%, 0.932%;新疆紫草原植物根中 β, β′-二甲
基丙烯酰紫草素的含量为 1.074%,乙酰紫草素的
含量为 1.084%。
3　讨论
3.1　提取溶剂的选择　本实验曾分别用无水乙醇
和石油醚提取新疆紫草毛状根中的紫草素 ,提取 3
次 ,合并提取液 ,滤液浓缩至干 ,残渣用甲醇溶解 ,并
定量转移至 25mL量瓶中 ,以甲醇稀释至刻度 。结
果表明石油醚提取物中 β, β′-二甲基丙烯酰紫草
素和乙酰紫草素的提取率最高 。
3.2　培养条件的优化　本实验采用 M9液体培养
基悬浮培养的培养条件 ,并进行了 3次优化 。第 1
次优化研究了化学因子(酸水解酪蛋白和 L-苯丙
氨酸)对紫草素的含量影响 ,第 2次优化研究了真
菌诱导子(立枯丝核菌和黑曲霉)对紫草素的含量
影响 ,在前 2次优化的基础上添加大孔吸附树脂
NKA-9进行了第 3次优化 ,结果发现 ,第 3次优化
的培养条件下得到的毛状根中乙酰紫草素的含量明
显提高 ,接近原植物根中的含量 ,说明大孔吸附树脂
是提高紫草素含量的主要调控因子。
3.3　原植物根和毛状根化学成分的比较　本实验
发现新疆紫草原植物根中含有化合物紫草素 ,但液
体培养得到的毛状根中无此化学成分。
3.4　本实验采用 RP-HPLC法同时测定了新疆紫
草毛状根中有效成分 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素
和乙酰紫草素的含量 ,结果发现新疆紫草原植物根
中 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素和乙酰紫草素的含
量相差不大;但毛状根中乙酰紫草素的含量明显高
于 β, β′-二甲基丙烯酰紫草素的含量。经过 1个月
液体培养的毛状根中新疆紫草主要成分 ———乙酰紫
草素和 3 ～ 4年野生根中的含量接近。
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5　ChP(中国药典).2005.VolⅠ (一部):238
(本文于 2009年 6月 16日收到)
—1851—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(10)