全 文 ：新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性研究
李翠芳1 ,王 芳1 ,麻 浩2 ,于月华1 ,王永军1
(1.新疆农业大学农学院 ,乌鲁木齐　830052;2.南京农业大学农学院 ,南京　210095)
摘　要:【目的】研究新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性。【方法】采用平行提取法提取紫草色素(LEP), 测
定了 LEP对 DPPH·体系 、Fenton 体系 、亚油酸脂质过氧化体系和还原体系的抗氧化作用。【结果】新疆紫草毛
状根四种不同溶剂提取物在 DPPH·体系 、Fenton 体系 、亚油酸脂质过氧化体系和还原体系中均具有较强的清
除作用。新疆紫草毛状根粗多糖也具有抗氧化活性。【结论】新疆紫草毛状根提取物具有抗氧化作用 , 可作为
原料进行开发利用。毛状根的抗氧化活性属国内首次报道。
关键词:新疆紫草;毛状根;抗氧化活性
中图分类号:S567.048　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2010)02-0291-05
Study on Antioxidant Activity of Arnebia euchroma (Royle)
Johnst Hairy Roots
LI Cui -fang1 ,WANG Fang1 ,MA Hao2 ,YU Yue-hua1 ,WANG Yong-jun1
(1.College of Agronomy ,Xinjiang Agricultural University ,Urumqi 830052 , China;2.College of Agronomy ,
Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095 , China)
Abstract:【Objective】Study on antioxidant activity of Arnebia euchroma (Royle)Johnst Hairy Roots extract.
【Methods】The assays of DPPH·radical , reducing power , hydroxyl radical and lipid peroxidation of linoleic acid
(LA)were chosen for antioxidantex experiments.【Results】The results showed that different solvent extracts of hairy
roots have a strong effect on free radical scavenging.Meanwhile , crude polysaccharide of hairy roots also has
antioxidant activity .【Conclusion】The different solvent extracts of antioxidant activity on Arnebia euchroma(Royle)
Johnst hairy roots has good development value and it is first reported.
Key words:Arnebia euchroma (Royle)Johnst;hairy roots;antioxidant activity
0　引 言
【研究意义】新疆紫草提取物对果蝇有延缓衰老的作用 ,作为抗氧化药物有可能会阻止糖尿病慢性
并发症的发生和发展 。因此 ,以紫草作为抗衰老的药物或保健品必将对医药 、营养和食品工程产生极其
重要的影响 。【前人研究进展】紫草具有止血 、抗炎 、抗菌 、抗肿瘤 、抗癌 、免疫调节 、抗病毒等作用[ 1～ 3] ,
同时还可作为食品及化妆品的着色剂 ,用途十分广泛。紫草的化学成分主要有三大类 ,包括脂溶性很强
的萘醌类色素 、水溶性成分多糖及脂肪酸[ 4 , 5] 。紫草素在食品中的应用目前仅见作为果汁 、饮料类 、雪
糕 、冰棍 、果酒的着色剂。为了延长食品的保质期 ,目前生产上主要采用添加人工合成的抗氧化剂
TBHQ的办法防止食品的氧化酸败 。但合成抗氧化剂具有致癌作用 ,长期食用含有这种物质对人体健
康不利 。研究表明 ,紫草中的萘醌类色素及多糖具有较强的抗氧化能力 ,与人工合成的抗氧化剂 TBHQ
相比抗氧化效果相当[ 6 , 7] 。【本研究切入点】有关新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性的研究目前国内
外尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用 4种化学模拟体系研究了新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活
性 ,为确定新疆紫草毛状根的药用价值及在医药保健 、食品 、饲料等方面应用的可能性提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材 料
新疆紫草液体毛状根 、固体毛状根由课题组提供 ,野生根采自新疆温泉县。
收稿日期:2009-03-05
基金项目:国家自然科学基金项目(30560059);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200821170)
作者简介:李翠芳(1980-),女 ,河北邢台人 ,硕士研究生 ,研究方向为细胞工程, (E-mai l)474273990@qq.com
通讯作者:王芳(1962-),女 ,甘肃兰州人 ,教授 ,硕士生导师 ,研究方向为植物细胞工程 ,(E-mail)wangfang1hao@126.com
新疆农业科学　2010 ,47(2):291-295
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1.2　主要仪器
紫外-可见分光光度计 、旋转薄膜蒸发仪 、数显恒温水浴锅 、电子天平(感应量 0.000 1 g)等 。
1.3　主要试剂
1 ,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)、抗坏血酸(VC)、β-胡萝卜素 、亚油酸 、Tween-20 、铁氰
化钾([K3Fe(CN)6])和三氯乙酸(TCA)购自美国 Sigma公司;二丁基羟基甲苯(BHT)、氮蓝四唑(NBT)、吩
嗪硫酸甲脂(PMS)、还原型辅酶(NADH)购自德国Applichem 公司;邻二氮菲 、甲醇 、三氯化铁(FeCl3)、双
氧水 、硫酸亚铁及无水乙醇均为国产分析纯。
1.4　方 法
1.4.1　新疆紫草毛状根粗提物的提取
称取 30 g毛状根粉末 4份 ,置于 500 mL 锥形瓶中 ,分别加入乙醇 、丙酮 、乙酸乙酯 、石油醚四种不同
的提取溶剂 150 mL。将锥形瓶置于室温摇床上 ,每振荡 2 h更换一次溶剂 ,如此反复 ,直至溶剂无色为
止 ,过滤 ,将滤液旋转蒸发回收溶剂 ,干燥即得乙醇提取物 、丙酮提取物 、乙酸乙酯提取物 、石油醚提取
物。做抗氧化活性研究时各提取物用相应溶剂配制成所需浓度的待测液 ,待用 。
1.4.2　新疆紫草毛状根粗多糖的提取
参照李芳等[ 8]的超声提取法。称取干燥毛状根粉末 30 g ,分成3份 ,各10 g ,置于 500 mL 烧杯中 ,分
别加蒸馏水 150 mL ,于 80℃超声处理25 min ,间歇 10 min ,再超声处理25 min后室温静置30 min ,使用双
层纱布过滤除去滤渣 ,取滤液离心 10 min(3 000 r/min)。取上清液分别减压浓缩至原液体积的 1/3 ,过
滤除去滤渣 ,滤液分别加入无水乙醇208.0 、228.0和 280.0mL ,使溶液中乙醇含量达 80%,置 4℃冰箱静
置过夜 ,然后过滤 ,滤渣用无水乙醇反复洗涤得多糖 ,用真空干燥器干燥 ,即得毛状根多糖粗粉 。
1.4.3　DPPH·体系
参照Kumaran等[ 9]的方法 ,具体步骤如下:精确称取 4 mg DPPH·,用 95%的甲醇溶解并定容到 100
mL。将 1mL 不同浓度的待测液与3 mL DPPH·溶液分别加入试管中 ,摇匀 ,室温静置 20min后于 517 nm
处测定吸光度 Ai(分别以 1 mL 不同浓度的待测液与3 mL 95%甲醇溶液调零)。测定 1 mL95%乙醇与 3
mL DPPH·溶液混合后的吸光度 Aj作为阴性对照 ,以VC 和BHT作阳性对照 ,每个浓度平行做3次重复 ,
根据下列公式计算清除率:
SR(%)=[ 1-Ai/Aj] ×100%.
1.4.4　Fenton体系
参照 Shiow 等[ 10]的方法 ,具体步骤如下:取0.75 mol/L 邻二氮菲溶液 1 mL于 10 mL 比色皿中 ,加入
pH 7.4的 0.2mol/L磷酸缓冲液2 mL ,与 1mL 蒸馏水充分混匀后 ,加入7.5×10-3mol/L硫酸亚铁溶液 1
mL ,混匀 ,再加入0.1%H2O2溶液 1 mL , 37℃下保温 60 min ,于 536 nm 处测定吸光度 A1 。用 1 mL 蒸馏
水代替 1mL H2O2 ,测定吸光度 A2 。用样液 1 mL代替1 mL蒸馏水 ,测定吸光度 A3。按下列公式计算清
除率 。
S2(%)=[(A3-A1)/(A2-A1)] ×100%.
式中:S2 为待测液在Fenton体系中的自由基清除率(%);A1 为未加待测液时的吸光度;A2 为未加
反应剂时的吸光度;A3为加入待测液后的吸光度 。
1.4.5　亚油酸脂质过氧化体系
参照 Siddhuraju等[ 11]的方法 ,具体步骤如下:采用亚油酸体系测定样品的抗氧化能力 。反应液的配
制:将 5 mg的 β-胡萝卜素溶于 10 mL 氯仿中 ,再加入 0.25 mL 的亚油酸和 2mL的Tween-20 ,将此混合
物移入圆底瓶中于 50℃旋转蒸发 4 min ,之后加入500 mL 蒸馏水。向各试管中加入 1 mL 不同浓度的待
测液和 4mL反应液 ,置于 50℃水浴中每隔25 min测其在470 nm处的吸光度(分别在不同浓度待测液构
成的体系中 ,以蒸馏水代替 β-胡萝卜素作为空白调零),共测量 150 min。按下列公式计算:
相当于对照的抗氧化力=(A0-At)/(A0′-At′)×100%.
A0和 At 分别为加入样品后 0和 150 min时的吸光度 , A0′和At′分别为不加样品时 0和150 min时的
吸光度。
1.4.6　还原体系
参照 Kumaran等[ 12]的方法 ,具体步骤如下:取 1 mL不同浓度的待测液与 2.5 mL 磷酸盐缓冲液(0.2
mol/L ,Na2HPO4/NaH2PO4 ,pH 6.6)及 2.5 mL 铁氰化钾(1%)混合 ,混合物在 50℃水浴中保温 20 min ,然
·292·　　　　　　　　　　　　　　　新疆农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　47卷
后加入2.5 mL的 TCA(10%,W/ V),3 000 r/min离心 10 min ,取上清液 2.5 mL ,分别加入 2.5 mL无水乙
醇和 0.5 mL FeCl3(0.1%),于 700 nm处测定吸光度(分别在不同浓度待测液构成的反应体系中 ,以蒸馏
水代替FeCl3溶液作为空白调零),以VC和 BHT 作阳性对照 ,每个浓度平行做 3次重复 。
1.4.7　新疆紫草毛状根粗多糖抗氧化测定
分别将固体毛状根 、液体毛状根和野生根的多糖粗粉配制成浓度为 100 μg/mL的待测样液 ,采用上
述四种体系测定粗多糖的抗氧化活性。
2　结果与分析
2.1　毛状根紫草素提取物对 DPPH·的清除作用
DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基 ,它的乙醇溶液呈紫色 ,在 517 nm 处有强吸收峰。
DPPH·通常被用来检测抗氧化剂的抗氧化活性的强弱。当 DPPH·溶液中加入自由基清除剂时 , DPPH·
会和清除剂提供的质子结合形成 DPPH-H ,从而使溶液颜色变浅 ,5l7 nm处的吸光度变小 ,而吸光度变
小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系 。因此 ,可用来检测自由基的清除情况 ,从而评价某物质的
抗氧化能力 ,其能力用清除率(Scavenglng Rate ,SR)来表示 ,清除率越大 ,抗氧化能力越强[ 13] 。随紫草素
浓度的增加 ,4种溶剂提取物均表现对 DPPH·自由基的清除作用呈加强趋势 ,当色素浓度为 100 μg/mL
时 ,乙醇提取物的清除率达最高为 91.3%,是 VC清除率的 94.81%。表明毛状根紫草素具有很强的清
除DPPH·的能力 ,可作为一种抗氧化剂。表 1
表 1　毛状根 、BHT 和VC对 DPPH·自由基的清除作用
Table 1　Eliminating effects of hairy roots ,BHT and VC on DPPH·radical scavenging
紫草素浓度(μg/mL) 乙醇(%) 乙酸乙酯(%) 丙酮(%) 石油醚(%) VC(%)
100 91.3 22.8 51.2 54.3 96.3
50 69.2 13.2 24.8 53.7 95.8
25 39.2 8.6 19.8 51.2 93.3
　　注:表中数据均为 3次重复的平均值 ,下同
2.2　毛状根紫草素提取物对羟自由基的清除作用
邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂 ,其显色变化可反映溶液中氧化还原状态的改变。Fenton
体系利用 H2O2 与Fe2+混合产生-OH ,可以使邻二氮菲-Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+ ,从而使邻
二氮菲-Fe2+在 536 nm 处的最大吸收峰消失 ,据此可以推知系统中-OH数量的变化 。
4种不同溶剂提取的紫草素对邻二氮菲-铁离子-H2O2 产生的羟自由基均有一定的清除作用 ,且
随紫草素浓度的增加清除率上升。当紫草素为 20 μg/mL ,乙醇提取物与芦丁对羟基自由基的清除作用
相当 。相同浓度下乙醇提取物对羟自由基的清除率最高(76.7%),其余依次为丙酮提取物(74.2%)、石
油醚提取物(65.3%)、乙酸乙酯提取物(63.6%)。表2
表 2　新疆紫草毛状根不同溶剂提取物 Fenton体系的抗氧化作用
Table 2　Antioxidation of Arnebia euchroma(Royle)Johnst hairy roots
extracts Fenton system using different solvents by hydroxyl radical
紫草素浓度(μg/mL) 乙醇(%) 乙酸乙酯(%) 丙酮(%) 石油醚(%) 芦丁(%)
20 76.7 63.6 74.2 65.3 75.9
10 70.4 42.6 68.5 56.7 70.1
5 69.5 31.8 59.0 36.9 67.8
2.3　毛状根紫草素提取物的抗氧化能力
在亚油酸脂质过氧化体系中 ,当没有加入抗氧化剂时 , β-胡萝卜素的颜色会迅速褪去 ,这是因为 β
-胡萝卜素和亚油酸被双重氧化产生自由基的结果。亚油酸自由基会攻击不饱和 β -胡萝卜素分子 ,
结果使 β-胡萝卜素分子失去双键而被氧化 ,体系失去发色团 ,橙色消失。抗氧化剂的加入会中和亚油
酸自由基以及其他自由基 ,从而阻止其对 β-胡萝卜素分子的氧化[ 14] 。结果表明 , 4种容积提取物的抑
·293·2期　　　　　　　李翠芳等:新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性研究　　　　　　　　　　　
制率随紫草素浓度的增加而提高。当紫草素浓度为 100 μg/mL时 ,尤以乙醇提取物对亚油酸过氧化作
用的抑制率最大 ,达 90.2%,其次是石油醚提取物抑制率为86.6%,表明新疆紫草毛状根乙醇提取物具
有较强的抗脂质过氧化功能 ,是一种优良的天然抗氧化剂。表 3
表 3　新疆紫草毛状根不同溶剂提取物亚油酸脂质过氧化体系的抗氧化作用
Table 3　Antioxidation of Arnebia euchroma(Royle)Johnst hairy roots
extracts using different solvents by lipid peroxidation of linoleic acid
紫草素浓度(μg/mL) 乙醇(%) 乙酸乙酯(%) 丙酮(%) 石油醚(%)
100 90.2 68.3 79.3 86.6
50 75.0 46.2 53.8 67.3
25 34.9 30.2 31.7 33.3
2.4　毛状根紫草素提取物的还原能力
物质的还原能力可以反映其潜在抗氧化性能 。具有还原能力的物质通常是电子供体 ,能够还原脂
质过氧化过程中的中间氧化产物 ,因此具有初级或次级抗氧化性能[ 11] 。结果表明 ,随紫草素浓度的增
加 ,4种溶剂提取物的吸光度值呈增加趋势 ,表明其还原力增强 ,并且还原力与浓度呈正相关 。然而 4
种溶剂提取物抗氧化活性均较对照 BHT 和 VC 低 , 乙醇提取物分别是 BHT 的 54.47%、61.27%、
112.5%,是VC的 39%、62.66%和 66.5%。表 4
表 4　新疆紫草毛状根不同溶剂提取物还原体系的抗氧化作用(吸光度)
Table 4　Antioxidation of Arnebia euchroma(Royle)Johnst hairy roots
extracts using different solvents by reducing power
紫草素浓度(μg/mL) 乙醇 乙酸乙酯 丙酮 石油醚 BHT VC
100 0.481 0.156 0.227 0.129 0.883 1.225
50 0.416 0.089 0.208 0.063 0.679 0.665
25 0.243 0.064 0.127 0.054 0.216 0.365
2.5　毛状根多糖的抗氧化活性
新疆紫草毛状根多糖对 DPPH·自由基和羟自由基的清除率分别是对照的 96.1%和 83.4%,具有明
显的抗氧化作用 。在脂质过氧化体系(抑制率是对照的 52.77%)和还原体系(是对照的 30.69%)中新
疆紫草毛状根多糖的抗氧化活性低于对照。此外 ,毛状根的抗氧化活性除 Fenton体系外均较野生根强。
表5
表 5　毛状根多糖的抗氧化活性
Table 5　Antibacterial activity of hairy roots polysaccharides
多糖浓度
(100μg/mL)
DPPH·的
清除率(%)
Fenton的
清除率(%)
脂质过氧化
体系的清除率(%)
还原体系
(吸光度)
固体毛状根 57.3 80.3 47.6 0.376
液体毛状根 59.1 77.5 39.0 0.271
野生根　　 32.5 88.2 30.5 0.137
对照　　　 59.6(BHT) 96.3(VC) 90.2(BHT) 1.225(VC)
3　讨论
目前在医疗和食品领域使用较多的是合成抗氧化剂 ,如 BHT(二丁基羟基甲苯)、BHA(丁基羟基茴
香醚)、TBHQ(叔丁基对苯二酚)等 ,但研究表明 ,大量的 BHT 、BHA 、TBHQ 会引起动物肝脏肿大 , BHT 还
可增加微粒体酶的活性 ,具有一定的毒副作用 。因此寻找延缓衰老 、防治疾病 、延缓食品氧化腐败的抗
氧化物 ,替代化学合成的抗氧化剂 ,已成为当前开发研究的重要课题 。关于紫草的抗氧化活性研究有许
·294·　　　　　　　　　　　　　　　新疆农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　47卷
多报道 ,王威[ 13] 、于海洋等[ 15]研究认为紫草色素具有抗氧化活性 ,其抗氧化能力相当于 BHT的 20%～
42%,相当于VC的 30%。研究对新疆紫草毛状根 4种不同溶剂提取物的抗氧化活性研究表明 ,乙醇提
取物三种浓度的抗氧化能力分别相当于 BHT 的 54.47%、61.27%和 112.5%,相当于 VC抗氧化能力的
39%、62.66%和 66.5%,表明新疆紫草毛状根具有较强的抗氧化能力 ,可以作为制备抗氧化剂的原料。
夏金虹等[ 16] 、潘英明等[ 17]认为紫草的乙酸乙酯提取物对花生油具有显著的抗氧化活性 。刘玉鹏
等[ 18]认为新疆紫草石油醚提取物和三氯甲烷提取物有明显的抗氧化活性 。张改平等[ 6]认为新疆紫草
色素(LEP)对 DPPH·和超氧自由基均有较强的清除能力 ,并且对 β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系有明
显的抑制作用。采用 DPPH·自由基 、羟自由基 、脂质过氧化体系和还原体系等 4种体系研究新疆紫草毛
状根的抗氧化能力 ,结果表明 ,新疆紫草毛状根同一溶剂提取物在不同体系中的抗氧化效果不完全相
同 ,不同溶剂提取物在同一体系中的抗氧化效果也存在差异 ,这可能是石油醚 、乙酸乙酯 、丙酮 、乙醇本
身存在极性差异 ,当将它们作为溶剂进行新疆紫草毛状根提取时 ,得到的提取物的极性也可能存在差
异 ,因而它们对同一自由基体系的抗氧化能力也就可能存在差异 。
4　结 论
关于紫草多糖的抗氧化研究少有报道。马厉芳等[ 19]研究认为 ,黄花软紫草中粗多糖具有清除羟自
由基的能力 ,并且与其浓度呈线性关系 ,在 6 mg/mL时自由基清除率为 30%左右 。研究结果表明 ,新疆
紫草毛状根多糖为 0.1 mg/mL时对DPPH·自由基的清除率是 96.1%,对羟自由基的清除率是 83.4%,
具有明显的抗氧化作用 ,并且毛状根的清除率较野生根强。因此 ,新疆紫草毛状根具有作为天然抗氧化
剂和功能性食品的开发价值。至于新疆紫草毛状根多糖的组分及其含量等 ,还有待今后进一步研究。
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