全 文 ：第 8 卷第 1 期 过 程 工 程 学 报 Vol.8 No.1
2008 年 2 月 The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2008

收稿日期：2006−11−22，修回日期：2007−10−17
基金项目：国家“十五”科技攻关基金资助项目(编号：2001BA701A10)；云南省教育厅基金资助项目(编号：07C40780)
作者简介：葛锋(1979−)，男，云南省昆明市人，博士，副教授，生物化学工程专业，E-mail：gefeng79@yahoo.com.cn.
超声波对新疆紫草悬浮培养细胞生长和紫草素合成的影响
葛 锋 1， 陈朝银 1， 王晓东 2， 赵 兵 2， 王玉春 2
(1. 昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650224；2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080)
摘 要：探讨了超声波功率、超声波处理时间对新疆紫草细胞生长和紫草素合成的影响. 研究结果表明，超声波对悬
浮培养的新疆紫草细胞生长有促进作用，低功率长时间或高功率短时间的超声处理对细胞生长比较有利. 在优化条件
下(200 W 超声处理 1 min)，培养结束时的生物量比对照提高 61%. 超声波也可以提高新疆紫草悬浮培养细胞的紫草素
含量和产量，接种后即进行超声波处理，超声波功率密度为 39.9 mW/cm3、超声时间为 3 min 时，细胞紫草素含量和
产量最高，达到 2.72%和 294 mg/L，分别比对照组提高了 64%和 135%. 超声波是通过提高细胞苯丙氨酸解氨酶的活
力来强化紫草素的生物合成途径.
关键词：超声波；新疆紫草；紫草素；细胞培养
中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2008)01−0115−05
1 前 言
新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst.]为紫草
科(Boraginaceae)多年生草本植物，其根药用，有效药用
成分是紫草素及其衍生物，这些成分不但具有抗菌、抗
炎、抗癌等多种药理作用，而且还作为天然色素广泛用
于医药、化妆品和印染工业中[1]. 《中华人民共和国药
典》收录的中药紫草中，以新疆紫草品质最佳[2]，为主
要的商品药用紫草. 目前，新疆紫草的野生资源破坏严
重，而旺盛的市场需求凸显了供需矛盾. 从长远考虑，
通过细胞的大规模培养直接生产紫草素来满足药用需
求是比较有潜力的途径，但细胞培养过程中由于药用成
分含量低而导致成本过高的问题严重制约着产业化进
程.
超声波在生物学和医学诊断治疗上的应用已有几
十年的历史，前人[3,4]的一些研究结果表明，低强度的超
声波能够影响细胞的生长，使细胞膜和细胞器的形态发
生变化，可导致细胞代谢和膜通透性的改变. 已有许多
研究[5−7]表明，超声波能够提高酶及微生物细胞在反应
器中的生物转化效率，但生物反应过程中超声波的影响
机理仍然不十分清楚，大多数情况下认为是超声波的机
械刺激强化了生物转化过程中的传质和混合，甚至提高
了酶的活性，使细胞内代谢反应更加旺盛[8]. 过去有关
超声波生物学效应的研究大多集中于人和动物细胞及
微生物，应用于植物细胞的研究较少. 曾有研究[8]表明，
超声波能够促进培养的红豆杉细胞释放紫杉醇，另外低
强度的超声波刺激可以提高人参培养细胞中人参皂甙
的含量[9].
目前还未见有关超声波对新疆紫草培养细胞影响
的研究. 本工作以悬浮培养的新疆紫草细胞为材料，在
培养过程中施加不同功率的超声波，考察其对细胞生长
及紫草素合成的影响，并对影响机理作了初步探索.
2 材料与方法
2.1 实验材料和仪器
实验所用材料新疆紫草细胞由中国科学院过程工
程研究所生化工程国家重点实验室诱导并筛选. 主要仪
器为超声波清洗器(频率 40 kHz，功率 80∼200 W 可调，
超声时间可调，温度可控，昆山超声仪器厂，型号
KQ5200DB)，752 型紫外−可见分光光度计(上海光谱仪
器有限公司). 实验所用化学试剂均为分析纯(阿托兹精
细化工有限公司)，植物激素购自 Sigma 公司.
2.2 实验方法
2.2.1 细胞的悬浮培养
由于新疆紫草细胞中紫草素的生物合成属非生长
偶联型，细胞生长和紫草素合成所用的培养基不同，因
此把细胞生长阶段和紫草素合成阶段分开进行二步培
养. 新疆紫草细胞生长的悬浮培养用 N6 培养基[10]，紫
草素合成的悬浮培养采用 M10 培养基(表 1). 将细胞按
3 g鲜重/瓶的量接种在装有40 mL含1 mg/L激动素(KT)
表 1 M10 培养基成分
Table 1 Composition of the culture medium M10 (mg/L)
KNO3 680 NaH2PO4⋅2H2O 19
Na2SO4 2 000 CuCl2⋅2H2O 0.15
CaCl2 500 NaFe−EDTA 2
H3BO3 1.6 Sucrose 50 000
Inositol 100 Kinetin (KT) 1
116 过 程 工 程 学 报 第 8 卷

的 N6 或 M10 液体培养基的 100 mL 三角瓶中培养. 培
养温度为(25±1)℃，摇床转速 110 r/min，暗培养，细胞
培养周期为 12 d.
2.2.2 超声波实验方法
超声实验时，将摇瓶放入超声波清洗仪的水槽中
央，温度控制在(25±1)℃，超声波由清洗槽底部发出，
摇瓶底部距清洗槽底部 8 cm. 每次处理清洗槽中只放
一个摇瓶(图 1). 超声处理后，细胞放入摇床继续培养.
实验过程中考察的参数有超声波功率、超声波处理时间
和施加超声波的时刻. 各超声功率条件下摇瓶中真实的
超声波功率密度采用卟啉法测定[11]，结果见表 2. 培养
结束后测定细胞生物量和紫草素含量.










图 1 新疆紫草在超声波清洗器中进行超声刺激
Fig.1 Illustration of ultrasonic wave treatment on
A. euchroma cells in an ultrasonic cleaning bath
表 2 摇瓶中真实的超声功率密度
Table 2 Ultrasonic power density in the flask
Power level Power (W) Power density in the flask (mW/cm3)
1 80 17.7
2 100 22.4
3 120 26.5
4 140 31.1
5 160 35.6
6 180 39.9
7 200 44.6
2.2.3 细胞生物量的测定
取新疆紫草细胞悬浮培养液，用滤纸过滤，将细胞
置于烘箱中，55℃烘约 48 h 至恒重，称得其干重.
2.2.4 紫草素含量的测定
取培养的新疆紫草细胞培养液，3500 r/min 离心 20
min，回收的沉淀物为鲜细胞. 将鲜细胞转移至三角瓶
中，加入一定量的石油醚(沸点 30∼60℃)，用超声细胞
破碎仪进行破碎，然后在室温下振荡(110 r/min)提取 24
h，提取液用于测定细胞中紫草素的含量.
紫草素呈红棕色，用分光光度计测量，在 520 nm
处有最大吸收峰. 本实验按叶和春等[12]的方法进行标
准曲线的绘制，得到 C=187.85X−2.09, R=0.9995，其中
C 为石油醚溶液中的紫草素浓度(mg/L)，X 为该测定溶
液的吸光度值，R 为相关系数. 紫草素的测定用下式：
S=(CNV/W)×100%, P=1000SW,
其中，S 为紫草素含量(%)，N 为稀释倍数，V 为萃取液
体积(L)，W 为愈伤组织干重(g/L)，P 为紫草素产量(mg/L).
2.2.5 新疆紫草细胞中苯丙氨酸解氨酶含量的测定
苯丙氨酸解氨酶(PAL)的提取：称取 1.0 g(鲜重)组
织样品，加 5 mL 预冷的含 5 mmol/L 巯基乙醇、0.5 g/L
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)的硼酸缓冲液 (0.2 mol/L, pH
8.8)，冰浴中研磨至匀浆. 以 10000 r/min 转速于 4℃离
心 30 min，取上清液 5000 r/min 再离心 10 min，上清液
用于酶活性测定.
PAL 活性的测定：检测反应液总体积 5 mL，其中
0.2 mol/L pH 8.8 的硼酸缓冲液 3 mL，酶提取液 1 mL，
以 0.2 mol/L pH 8.8 的硼酸缓冲液配制的 20 mmol/L 苯
丙氨酸底物 1.0 mL. 对照管不加底物，以 1.0 mL 硼酸缓
冲液代替. 反应管置于 30℃恒温水浴中保温 30 min，于
290 nm 处测光吸收值的变化，以 OD 值变化 0.01 为 1
个酶活力单位[U/(g⋅h)].
2.2.6 数据的统计分析
不同实验处理得出的结果用 t 检验进行显著性分
析，取显著性水平α=0.05.
3 结果与讨论
3.1 超声波对新疆紫草细胞生长的影响
实验采用细胞生长培养基，不进行紫草素的合成，
主要目的是考察超声波刺激对细胞生长、增殖的影响.
实验中采用 7个不同超声波功率(表 2)对在N6培养基中
悬浮培养的新疆紫草细胞进行处理. 从图 2 可以看出，
在相当大的超声波功率和处理时间范围内，采用超声处
理对细胞生长有促进作用，而且不同功率在各自合适的
处理时间下都能达到较好的处理效果，培养结束时的生
物量比对照组都有大幅度提高，存在显著性差异. 随着
超声波功率的加强，获得最大生物量的处理时间逐渐缩
短，不同功率条件下适宜的处理时间为：80 W处理 5 min,
100 W 处理 4 min, 120 W 处理 3 min, 140 W 处理 3 min,
160 W 处理 3 min, 180 W 处理 2 min, 200 W 处理 1 min.
其中以 200 W 处理 1 min 效果最佳，生物量达到 12.3
g/L，比对照提高 61%. 如果超声功率过大，并且超声时
间较长，通过显微镜观察发现部分细胞破碎，细胞的生
物量增长受到抑制. 总的说来，高功率长时间处理会导
致细胞破裂死亡；低功率短时间处理，作用太弱，效果
不显著.
Ultrasonic
第 1 期 葛锋等：超声波对新疆紫草悬浮培养细胞生长和紫草素合成的影响 117










图 2 超声波功率和处理时间对新疆紫草悬浮培养细胞
生长的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic wave power and exposure period
on A. euchroma cell growth in suspension culture
3.2 超声波对新疆紫草细胞合成紫草素的影响
采用紫草素合成培养基 M10 研究超声波对紫草素
合成的影响.
3.2.1 超声波功率和处理时间对新疆紫草悬浮培养细胞
紫草素含量和产量的影响
超声波处理在接种后立刻进行，然后放入摇床避光
培养. 在实验采用的超声波功率和超声作用时间条件
下，悬浮培养的新疆紫草细胞紫草素含量与对照相比均
有提高(见图 3)，存在显著性差异. 当超声波功率为 180
W、超声时间为 3 min 时，细胞紫草素含量达到最大值
2.72%，比对照组提高 64%. 超声功率低于 200 W，超
声时间小于 3 min 时，随着超声功率的增加，紫草素的
含量也提高. 另外，从图 3 可以明显看出，180 和 200 W
超声功率下的结果差异大，180 W 超声波功率在本实验
中获得了较好的效果，说明在 180 W 左右可能存在 1
个功率临界值，超过该临界值，超声波对紫草素合成代
谢的促进作用明显减弱.









图 3 超声波功率和处理时间对新疆紫草悬浮培养细胞紫草素
含量的影响
Fig.3 Effects of ultrasonic wave power and exposure period on
shikonin content of A. euchroma cells in suspension culture
图 4 是不同超声波功率和超声作用时间条件下新
疆紫草细胞紫草素产量的变化，其中除了采用功率 200
W、超声 5 min 时，细胞的紫草素产量低于对照外，其
他条件下紫草素产量都比对照高，存在显著性差异. 说
明只要控制超声功率不太大、超声时间不太长，超声波
可提高新疆紫草细胞紫草素产量. 实验中，当超声波功
率为 180 W、超声时间为 3 min 时，细胞紫草素产量达
到了最大值 294 mg/L，比对照组提高 135%.












图 4 超声波功率和处理时间对新疆紫草悬浮培养细胞紫草素
产量的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic wave power and exposure period on shikonin
production of A. euchroma cells in suspension culture
3.2.2 施加超声波的时刻对新疆紫草悬浮培养细胞紫草
素含量和产量的影响
为了全面研究超声波对新疆紫草细胞合成紫草素
的影响，对施加超声波的时刻进行考察. 由于悬浮培养
的细胞在不同生长阶段对外界刺激的敏感性不同，以致
在细胞培养周期中的不同时间进行超声波处理对细胞
产生的作用效果有明显区别. 本实验采用的超声波功率
为 180 W、超声时间为 3 min. 从图 5 可以看出，不管在
什么时刻施加超声波，细胞在经超声处理后的几天内，
紫草素含量和产量的增加速度与对照相比明显加快，存
在显著性差异，说明新疆紫草细胞合成紫草素的代谢过
程对超声波处理比较敏感，而且这种外界刺激一旦施
加，其影响效果将持续到培养周期结束. 另外，尽管进
行超声处理后紫草素的含量和产量明显提高，但施加超
声较晚的细胞合成紫草素的量始终低于超声施加早的
细胞. 这可能是因为超声波提高了细胞膜的通透性，强
化了细胞内外的物质交换. 因此，培养初期就进行超声
处理可以缩短细胞进行次生代谢物合成的物质准备时
间，使细胞较早进入紫草素合成的旺盛期. 本实验结果
表明，超声刺激进行得越早，提高紫草素含量和产量效
果越明显，因此，接种后就进行超声波处理较为适宜.
0 1 2 3 4 5
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
Sh
ik
on
in
c
on
te
nt
(%
)
Ultrasonic wave exposure period (min)
Power (W)
80 100
120 140
160 180
200
0 1 2 3 4 5
80
120
160
200
240
280
320


Ultrasonic wave exposure period (min)
S
hi
ko
ni
n
pr
od
uc
tio
n
(m
g/
L)
Power (W)
80 100
120 140
160 180
200
0 1 2 3 4 5
6
7
8
9
10
11
12
Bi
om
as
s
(g
/L
)
Ultrasonic wave exposure period (min)
Power (W)
80 100
120 140
160 180
200
118 过 程 工 程 学 报 第 8 卷











图 5 超声波处理时刻对新疆紫草悬浮培养细胞紫草素含量和产量的影响
Fig.5 Effect of moment of ultrasonic wave treatment on shikonin content and production of A. euchroma cells in suspension culture
3.3 超声波对新疆紫草细胞内苯丙氨酸解氨酶(PAL)活
性的影响
为了初步研究超声波处理对新疆紫草细胞紫草素
生物合成途径的影响机制，本实验考察了经超声波处理
后紫草素合成阶段 PAL 活力的变化.
从图 3 可知，当超声波功率为 180 W、超声时间为
3 min 时，培养细胞中紫草素含量最高，因此以该条件
下培养的细胞为材料，研究超声波对紫草素生物合成的
影响机理. 实验结果表明(图 6)，超声波处理后，细胞的
PAL 活力在 2 d 之内迅速升高，并在第 6 d 达到最大值
243 U/(g⋅h)，比对照组的最大酶活高 31.4%. 第 6 d 后，
实验组的 PAL 活力开始快速下降，第 10 d 时降到了较
低值，随后活力下降速度变缓. 而对照组的 PAL 活力达
到最大值的时间为 8 d，比加超声的实验组晚 2 d. 在整
个培养过程中，经超声波处理的细胞 PAL 活力在各时间
点上均比对照组高，说明用超声波进行培养前预处理能
够有效促进细胞 PAL 活力的升高.










图 6 超声波对新疆紫草细胞苯丙氨酸解氨酶活性的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic wave on PAL activity during the
suspension culture period of A. euchroma cells
已有研究[13]表明，超声波刺激能够促进多种植物种
子萌发及幼苗的生长，如小麦、水稻、豌豆等. 但不同
植物对超声波的耐受程度不同，而且同一种植物在不同
生长阶段对超声波的敏感性也有较大差别，加上超声波
的生物学效应常常是超声波本身固有的多种物理或化
学特性的综合体现，这些因素使超声波导致植物组织或
细胞生理功能产生变化的详细机理比较复杂，难以研究
清楚. 目前，大致有两方面的影响机理得到认可：(1) 超
声波的空化作用和微流体作用增加了细胞膜的通透性，
强化了细胞内外的传质过程(包括营养物质、氧气和代
谢产物的传递与交换)[10]；(2) 超声波引起植物细胞启动
自身防御系统，即植物的应激反应，这种防御反应常常
与细胞合成次生代谢物有关[14,15].
PAL 在植物细胞次生代谢过程中起着重要作用，是
植物次生代谢途径开始步骤的关键酶，PAL 活力升高意
味着细胞从基本代谢过程向次级代谢过程的转变. 在紫
草素的合成途径中，PAL 是合成紫草素起始时的一个关
键酶[16]. 细胞刚刚进入紫草素合成阶段，PAL 的活力就
开始快速升高，意味着细胞中合成了较多苯乙烯酸，而
苯乙烯酸是合成紫草素的前体物质. 因此可以初步认为
超声波刺激能够促使新疆紫草细胞合成更多紫草素的
原因在于超声波作用细胞后，提高了细胞 PAL 活力，强
化了紫草素的生物合成途径，从而获得更多的紫草素.
目前普遍认为植物细胞 PAL 活力上升是植物受到外界
刺激后自身启动防御系统的结果，这些外界刺激因素包
括病菌侵染、生物诱导子或一些非生物因素的刺激(重
金属离子作用等). 本实验中，PAL 活力的增加是因为超
声波的作用引起细胞强烈的防御反应，从而导致 PAL
活力短时间内迅速升高，始终比对照组处于较高水平.
4 结 论
本研究结果表明，新疆紫草细胞在 N6 生长培养基
中进行细胞增殖时，如采用合适的超声波功率和处理时
间，对悬浮培养的新疆紫草细胞生长有促进作用. 在优
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0


Culture time (d)
S
hi
ko
ni
n
co
nt
en
t (
%
)
Moment of
ultrasonic wave treatment (d)
0 2
4 6
Without
0 2 4 6 8 10 12 14
0
50
100
150
200
250
300
Moment of
ultrasonic wave treatment (d)
0 2
4 6
Without


Culture time (d)
S
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ko
ni
n
pr
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uc
tio
n
(m
g/
L)
0 2 4 6 8 10 12
120
160
200
240

Culture time (d)
PA
L
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tiv
ity
[U
/g
·h
)]
Without ultrasonic wave treatment
180 W, 3 min
第 1 期 葛锋等：超声波对新疆紫草悬浮培养细胞生长和紫草素合成的影响 119
化条件下(200 W 超声处理 1 min)，培养结束时的生物量
比对照提高 61%. 新疆紫草细胞在紫草素合成培养基
(M10)中进行紫草素的合成，超声波也可以显著提高紫
草素含量和产量，当超声波功率密度为 39.9 mW/cm3、
超声时间为 3 min 时，可获得最高的紫草素含量(2.72%)
和产量(294 mg/L)，比对照组提高 64%和 135%. 超声波
能够引起新疆紫草细胞的应激反应，并且通过提高细胞
PAL 的酶活来强化紫草素的生物合成途径.
参考文献：
[1] 黄志纾，张敏，马林，等. 紫草的化学成分及其药理活性研究概
况 [J]. 天然产物研究与开发, 2000, 12(1): 73−82.
[2] 葛锋，王晓东，王玉春. 药用紫草的研究进展 [J]. 中草药, 2003,
34(9): 5−8.
[3] Miller M W, Miller D L, Brayman A A. A Review of in vitro
Bioeffects of Inertial Ultrasonic Cavitation from a Mechanistic
Perspective [J]. Ultrasound Med. Biol., 1996, 22: 1131−1154.
[4] Sinisterra J V. Application of Ultrasound to Biotechnology: An
Overview [J]. Ultrasonics, 1992, 30: 180−185.
[5] Barton S, Bullock C, Weir D. The Effects of Ultrasound on the
Activities of Some Glycosidase Enzymes of Industrial Importance [J].
Enzyme Microb. Technol., 1996, 18: 190−194.
[6] Sakakibara M, Wang D, Takahashi R, et al. Influence of Ultrasound
Irradiation on Hydrolysis of Sucrose Catalyzed by Invertase [J].
Enzyme Microb. Technol., 1996, 18: 444−448.
[7] Wood B E, Aldrich H C, Ingram L O. Ultrasound Stimulation of Ethanol
Production during the Simultaneous Saccharification and
Fermentation of Mixed Waste Office Paper [J]. Biotechnol. Progr.,
1997, 13: 232−237.
[8] 张姝，余斐，王传贵，等. 超声波对红豆杉悬浮细胞生长及紫杉
醇释放的影响 [J]. 生物技术, 2001, 12(2): 14−17.
[9] Lin L D, Wu J Y, Ho K P, et al. Ultrasound-induced Physiological
Effects and Secondary Metabolite (Saponin) Production in Panax
ginseng Cell Cultures [J]. Ultrasound Med. Biol., 2001, 27:
1147−1152.
[10] 朱至清，王敬驹，孙敬三，等. 通过氮源比较试建立一种较好的
花药培养基 [J]. 中国科学, 1975, (2): 484−490.
[11] Nomura H, Koda S, Yasuda K, et al. Quantification of Ultrasonic
Intensity Based on the Decomposition Reaction of Porphyrin [J].
Ultrason. Sonochem., 1996, 3: S153−S156.
[12] 叶和春，尹作鸿，李国凤，等. 不同理化因子对新疆紫草愈伤组
织生长及紫草宁衍生物合成的影响 [J]. 植物学报, 1991, 33(12):
927−931.
[13] Mason T J, Paniwnyk L, Lorima J P. The Uses of Ultrasound in Food
Technology [J]. Ultrason. Sonochem., 1996, 3: 253−260.
[14] Ebel J, Mithöfer A. Early Events in the Elicitation of Plant Defense
[J]. Planta, 1998, 206: 335−348.
[15] Low P S, Merida J R. The Oxidative Burst in Plant Defense:
Function and Signal Transduction [J]. Physiol. Planta, 1996, 96:
533−542.
[16] Okamoto T, Yazaki K, Tabata M. Biosynthesis of Shikonin
Derivatives from L-Phenylalanine via Deoxyshikonin in
Lithospermum Cell Cultures and Cell-free Extracts [J]. Phytochem.,
1995, 38: 83−88.
Effects of Ultrasonic Wave on Cell Growth and Shikonin Biosynthesis in
Suspension Culture of Arnebia euchroma
GE Feng1, CHEN Chao-yin1, WANG Xiao-dong2, ZHAO Bing2, WANG Yu-chun2
(1. College of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, Yunnan 650224, China;
2. State Key Lab. Biochem. Eng., Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)
Abstract: The effects of ultrasonic wave power and treatment time on the cell growth and shikonin biosynthesis of Arnebia euchroma
were investigated. The results showed that the stimulation of ultrasonic wave promoted A. euchroma cell growth in suspension culture.
Low power density and long time treatment or high power density and short time treatment by ultrasonic wave was favorable to the cell
growth. The cell biomass productivity was 61% higher than that in control by the end of the culture period under the optimal conditions
of 200 W ultrasonic wave treatment for 1 min. The shikonin content and shikonin production in suspension culture of A. euchroma cells
were enhanced by ultrasonic stimulation as well. When the ultrasonic stimulation was carried out after inoculation, the ultrasonic power
density was 39.9 mW/cm3 and the stimulation time was 3 min, the shikonin content and shikonin production gained the highest results
(2.72%, 294 mg/L), which were 64% and 135% higher than those obtained in control, respectively. The strengthening of shikonin
biosynthesis may be due to increasing the activity of phenylalanine ammonia lyase caused by ultrasonic stimulation.
Key words: ultrasonic wave; Arnebia euchroma; shikonin; cell culture