全 文 ：335※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 08
野生牛肝菌多糖的分离鉴定及其抗氧化性研究
杨立红，刘林德，钟旭生，冯培勇，蔡德华，马崇军
(鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025)
摘 要：野生牛肝菌烘干后经热水浸提，乙醇沉淀得粗多糖。粗多糖经Sevag法除蛋白后上DEAE- 纤维素柱层析，
分离得到四种多糖组分Nb-Ⅰ、Nb-Ⅱ、Nb-Ⅲ 和Nb-Ⅳ 。红外光谱对Nb-Ⅰ分析表明：Nb-Ⅰ为含有葡萄糖醛酸的β-D-
吡喃葡聚糖。 Sepharose CL-4B测得Nb-Ⅰ分子量为4.0×104，总抗氧化能力测定结果表明：牛肝菌粗多糖和Nb-Ⅰ
均具有抗氧化能力，且后者高于前者。
关键词：野生牛肝菌；多糖；分离鉴定；总抗氧化性
Separation and Identification of Polysaccharides from Natural Boletus and Their Ant xidant Activities
YANG Li-hong，LIU Lin-de，ZHONG Xu-sheng，FENG Pei-yong，CAI De-hua，MA Chong-jun
(College of Life Sciences, Ludong University,Yantai 264025, China)
Abstract ：The crude polysaccharides of wild Natural Bol tus were extracted by hot water and deposited by ethanol. DEAE
Cellulose column chromatography was used for polysaccharides purification after the protein was removed by Seveg method,
and four kinds of polysaccharides named as Nb-I, Nb-II, Nb-III and Nb-Ⅳ were separated. Infrared spectrum analysis showed
that Nb-Ⅰis β-D- glucopyranose containing glucuronic acid, and Sepharose CL-4B method showed that molecular weight of Nb-
I is 4.0×104 Both crude polysaccharides and Nb-Ⅰhave total antioxidation activity(T-AOC), and that of Nb-Ⅰis higher.
Key words：Natural Bo etus；polysaccharide；separation and identification；total antiox dation activity
中图分类号：Q949.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)08-0335-04
收稿日期：2008-04-27
基金项目：山东省教育厅科技计划项目(J06NO2)
作者简介：杨立红(1959-)，女，教授，主要从事生物化学及生物活性开发应用研究。E-mail：yanglihong@263.net
野生牛肝菌(Natural Bo etus sp.)，又名大脚菇，隶
属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，牛肝
菌科，牛肝菌属[1]。是世界珍贵的食用菌，具有很高
的食用价值和药用价值。目前，国内、国际市场上牛
肝菌干品的价值逐年上扬，优质牛肝菌干品供不应求，
销价高达150～240元/kg。我国牛肝菌资源非常丰富，
种类多达390种，其中199种是可食用的[2]，主要分布
在我国西南和华南地区及东北和华东沿海各省。牛肝菌
已成为我国出口创汇的重要菌类产品，仅云南省2002年
就出口5600t牛肝菌制品，创汇近1700万美元。至今，
牛肝菌几乎全部为野生，还不能人工栽培，因而，对
野生牛肝菌的营养及药用价值的研究对进一步深入开发
野生牛肝菌资源具有重要理论意义，目前有关野生食用
牛肝菌的研究主要集中在其营养成分分析和活性物质多
糖的免疫及抗肿瘤作用方面[3-8]，有关野生食用牛肝菌主
要活性物质多糖组分的分离鉴定及抗氧化作用的研究未
见报道。本实验选用野生食用牛肝菌，对其多糖进行
分离鉴定，并测定总抗氧化能力，旨在为进一步研究
野生食用牛肝菌的药理作用及其医疗保健作用提供实验
依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
野生牛肝菌产自山东省昆嵛山。
Sephadex G-200 Sigma公司；Sepharose CL-4B、
蓝色葡聚糖-2000、标准葡聚糖(DextranT-10、T-20、T-
40、T-41、T-70) 瑞典Amersham Biosciences公司；
DEAE-纤维素为进口分装；总抗氧化能力试剂盒 南京
建成生物工程研究所。
1.2仪器与设备
UV9100紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；
IR550红外光谱仪 美国Nicolet公司。
1.3方法
1.3.1粗多糖的提取
取野生牛肝菌子实体于烘箱中60℃烘干，粉碎机粉
碎过筛得子实体粉末。用适量水(水料比=15:1)于 00℃
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水浴提取三次，每次2h，虹吸，将三次虹吸液合并，
5000r/min离心10min，取上清液，浓缩至原体积的1/4，
加4倍体积95%乙醇沉淀三次，静置过夜，5000r/min
离心10min，去上清液，固形物用丙酮洗涤三次，干
燥，得多糖粗品 。
1.3.2粗多糖的分离纯化
取粗多糖3.6g加入700ml蒸馏水，使其溶解，用
Sevag法[9]脱蛋白，按样品液与Sevag试剂(三氯甲烷:
异戊醇=5:1)5:1的比例充分混匀，5000r/min下，离
心10min。将脱蛋白后的上层液置于透析袋中，先用
自来水透析12h，再用蒸馏水(中间换几次蒸馏水)透析
12h。将透析后的溶液定容至200ml，上DEAE-纤维
素柱(400×26mm)。先用蒸馏水洗脱，然后分别用0.05、
0.1、0.25mol/L的NaCl洗脱，流速均为2ml/min。从
进样开始按6ml/L管自动收集，隔4管用硫酸-苯酚法
[10]显色。
1.3.3多糖的纯度鉴定
取Nb-Ⅰ多糖洗脱液用紫外光谱扫描，扫描波段为
200～370nm。
1.3.4红外光谱测定
取Nb-Ⅰ多糖5.0mg，加入适量KBr压片，在红外
光谱仪中测定。
1.3.5分子量测定
将Sepharose CL-4B装填于1.6×30cm层析柱中，
用0.05mol/L NaCl溶液平衡，流速0.2ml/min，将浓度为
4mg/ml的各种不同分子量的标准葡聚糖(Dextran T-10、
T-20、T-40、T-41、T-70)0.5ml分别相继上样，用0.
05mol/L NaCl洗脱，每管2ml分部收集，硫酸-苯酚法
显色，合并洗脱液，求得洗脱体积(Ve)。再用蓝色葡
聚糖测得外水体积(Vo)。以Ve/Vo为纵坐标，分子量的
对数(lgM)为横坐标，绘制标准曲线。Nb-Ⅰ分别按上述
条件上柱得洗脱体积(Ve′)，再根据Ve′/Vo值按标准曲
线，求得Nb-Ⅰ的分子量。
1.3.6总抗氧化能力测定
机体中有许多抗氧化物质，能Fe3+使还原成Fe2+，后
者可与啡啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其
抗氧化能力的高低，吸光度越大总抗氧化能力越强。
按照总抗氧化能力检测试剂盒要求准备各工作液，
分别配制2.0、1.5、1.0和0.5mg/ml的粗多糖和Nb-I溶
液。取0.05ml待测样品液(稀释10倍)分别置对照管和测
试管中(表1)，再按总抗氧化能力检测试剂盒方法操作，
在波长520nm处测定吸光度，每一样品测三次，详细
记录每一测量数据。
在37℃时，每分钟每毫升样品液使反应体系的吸光
度每增加0.01时，为一个抗氧化能力单位。

(A测定管-A对照管)×反应液总体积×样品测试前稀释倍数
总抗氧化能力(U/ml)=———————————————————————

0.01×3×取样量(ml)
试剂盒应用 对照管 测定管
试剂1(ml) 1.0 1.0
待测样品(ml) － a
试剂2(ml) 2.0 2.0
试剂3应用液(ml) 0.5 0.5
操作条件 充分混匀，37℃水浴30min
试剂4(ml) 0.1 0.1
蒸馏水(ml) a －
表1 总抗氧化能力检测试剂盒操作表
Table 1 Operation of test on T-AOC
注：试剂1～4为试剂盒内试剂；－.不加试剂；a.加样品。
2 结果与分析
2.1野生牛肝菌粗多糖的提取
以野生牛肝菌子实体为原料，于烘箱中烘干粉碎过筛
得子实体粉末55.9635g，经热水提取、离心、乙醇沉淀、
丙酮脱水后得子实体多糖粗品4.2845g，得率为7.66%。
2.2野生牛肝菌粗多糖的分离纯化
野生牛肝菌多糖经DEAE-纤维素柱的级分含量及洗
脱曲线见表2和图1。
子实体多糖级分 洗脱液 收集管数 组分管数 最大吸收处管数
Nb-Ⅰ 蒸馏水 101 25～85 66
Nb-Ⅱ 0.05mol/L NaCl128 32～112 40
Nb-Ⅲ 0.10mol/L NaCl106 32～76 40
Nb-Ⅳ 0.25mol/L NaCl80 28～68 36
表2 野生牛肝菌多糖的分级
Table 2 Fractionation of Natural Boletus polysaccharides
图1 野生牛肚菌多糖的DEAE-纤维素洗脱曲线
Fig.1 DEAE-Cellulose elution profile of Natural Boletus
poysaccharides
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
吸
光
度
洗脱体积(ml)
0 6
6
9
6
1
3
2
1
8
2
2
0
7
2
3
0
2
6
2
3
0
6
3
3
0
3
6
4
3
9
6
4
2
2
Ⅰ Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
由图1可以看出，野生牛肝菌多糖的四个组分均为
单一峰，Ⅰ为蒸馏水洗脱曲线，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为
0.05、0.1和0.25mol/L NaCl的洗脱峰。由于DEAE-纤
维素为阴离子交换剂，因此，洗脱液极性逐渐增强，
所得糖组分所含酸性基团也逐渐增多。各组分含量之比
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(峰面积比)依次为：3.63:3.11:1.82:1。
2.3Nb-Ⅰ紫外扫描光谱分析
多糖Nb-Ⅰ的紫外扫描结果(图2)表明，该多糖在波
长260nm和280nm处无明显吸收峰，说明它不含核酸和
蛋白质。
2.4Nb-Ⅰ红外光谱分析
图2 Nb-Ⅰ的紫外光谱
Fig.2 UV-Vis spectrum of Nb-Ⅰfraction
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
波长(nm)
200220240260280300320340360
红外光谱分析(图3)显示，Nb-Ⅰ在4000～500cm-1区
具有多糖物质的一般特征[11]，在3419.56、2935.46、1654.81、
1419.51、1070.42、877.55cm-1处出现强峰。在3419.56
cm-1强宽峰是分子内O-H、N-H伸缩振动所致；2935.46
cm-1处的吸收峰是糖类的C-H键伸缩振动所致，是糖类
的特征吸收；1654.81cm-1吸收峰为C=O非对称伸缩振动
所致，1419.51cm-1吸收峰为C=O的对称伸缩振动所致，说
明有羧酸的存在，因而，Nb-Ⅰ为酸性多糖。877.56cm-1
处为β-D-吡喃葡聚糖的吸收峰，1070.42cm-1吸收峰为β-
D-吡喃葡萄糖苷。由此可见，Nb-Ⅰ为含有葡萄糖醛酸
的β-D-吡喃葡聚糖。
2.5分子量测定
图3 Nb-Ⅰ的红外光谱
Fig.3 IR spectrum of Nb-Ⅰfraction
100
97
94
91
88
85
82
79
76
73
70
透
光
率
(
%
)
波数(cm-1)
3
9
9
6
9
0
9
8
2
1
2
7
3
1
5
6
4
1
8
5
5
2
1
4
7
2
4
3
8
2
7
2
9
3
0
2
0
3
3
1
2
3
6
0
3
3
8
9
4
将各种不同分子量的多糖标准品分别相继上样于
Sepharose CL-4B装填的层析柱中，求得的洗脱体积见表3。
测得外水体积(Vo)为12ml，以Ve/Vo为纵坐标，分
子量的对数(lgM)为横坐标，绘制标准曲线(图4)，得标
准方程为y=－0.8315x+4.984，R2=0.9990。将多糖Nb-Ⅰ
上样得洗脱体积为14ml，根据Ve/Vo查标准曲线可得多
葡聚糖 Mr Ve(ml) Ve/Vo lgM
T-10 10000 20 1.667 4.000
T-20 25000 16 1.333 4.398
T-40 40000 14 1.167 4.602
T-41 410000 4 0.333 5.613
T-70 70000 11 0.917 4.845
表3 标准多糖的洗脱体积
Table 3 Elution volume of dextran
糖Nb-Ⅰ的分子量为4.0×104。
2.6野生牛肝菌多糖的总抗氧化能力
图4 标准葡聚糖的分子量标准曲线
Fig.4 Molecular weigh standard curve of dextran
1.80
1.53
1.27
1.00
0.73
0.47
0.20
y=－0.8315x+4.984
R2=0.9990
Ve
/
Vo
lgM
3.84.24.54.85.15.55.8
如表4所示，野生牛肝菌多糖粗品和纯品在体外均
具有较强的抗氧化能力，并在一定浓度范围内呈现一定
的量效关系，多糖纯品较粗品有较强的抗氧化能力。
3 讨 论
浓度(mg/ml)
粗多糖 Nb-I
吸光度 T-AOC(U/ml)吸光度 T-AOC(Uml)
2.0 0.087 94.472 0.102 128.97
1.5 0.094 109.5 0.113 155.73
1.0 0.084 85.174 0.092 104.63
0.5 0.079 73.00 0.090 99.767
表4 总抗氧化能力测定结果
Table 4 Determination results of total antioxidation activity
本实验从55.9635g野生食用牛肝菌子实体干粉中提
取多糖粗品4.2845g，得率为7.66%。粗多糖经Sevag法
除蛋白后上DEAE-纤维素柱层析，分离得到四种多糖组
份Nb-Ⅰ、Nb-Ⅱ、Nb-Ⅲ和Nb-Ⅳ。 对Nb-Ⅰ红外光谱分
析发现，Nb-Ⅰ是含有葡萄糖醛酸的β-D-吡喃葡聚糖。
研究发现，具有抗肿瘤活性的多糖都具有β-型糖苷键
[11]。有报道认为糖醛酸的存在，是许多酸性多糖具有特
征生理活性的重要原因之一[12]。这为进一步研究野生牛肝
菌多糖的生理和药理功能提供了理论依据。
本实验所得到的牛肝菌多糖Nb-Ⅰ分子量为4.0×
104。分子量对抗肿瘤活性有影响，Adachi Y等[13]研究
认为，多糖分子量大于1×104～4×104时才有较强的
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抗肿瘤活力。但分子量的改变对抑瘤活性的影响还与多
糖的空间结构有关。因此，在多糖提取、分离纯化过
程中，分子量及构象的改变都可能对其抗肿瘤活性产生
影响。
总抗氧化能力测定的是单电子还原剂进行单电子氧
化还原时产生羟自由基(·OH)的能力。羟自由基(·OH)
是已知最强的氧化剂，几乎能和所有的细胞成分发生反
应，在这些单电子过渡金属离子的存在下，使原来反
应性不强的O2·和H2O2转变为·OH。由于·OH不
能扩散，损伤就发生在这些金属离子存在的部位，例
如膜上的铁离子在脂质过氧化中起重要作用。脂质过氧
化作用对机体的损伤主要表现在中间产物自由基导致蛋
白质分子的聚合，及使膜不饱和脂肪酸减少而使膜的流
动性降低，膜蛋白聚合导致膜功能异常。动脉粥样硬
化与脂质过氧化密切相关，在活性氧和过氧化的产物醛
类的作用下，低密度脂蛋白(LDL)脂质过氧化形成蛋白
聚合物沉积在血管内壁产生硬斑。脂质过氧化与衰老有
关，老年斑或老年色素是衰老的重要标志之一，老年
色素主要由脂褐素和黑色素组成，自由基在脂褐素和黑
色素形成中起重要作用，清除自由基的抗氧化剂能明显
的延缓老年色素的出现和增长。本实验研究结果证明，
野生食用牛肝菌多糖粗品和纯品Nb-Ⅰ均具有抗氧化能
力，为食用牛肝菌在保健食品的开发利用上提供了理论
依据，同时也为多糖的药用机理研究提供了新的思路。
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