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青藤碱对LPS、IL-4诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的影响



全 文 :doi:10. 3969 / j. issn. 1000-484X. 2015. 01. 012
青藤碱对 LPS、IL- 4 诱导的小鼠 RAW264. 7 巨噬细胞极化的影响
罗进芳 朱瑞丽 易 浪 董 燕 王培训
(广州中医药大学临床药理研究所免疫研究室,广州 510405)
中图分类号 R967 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2015)01-0056-05
作者简介:罗进芳(1989 年 -) ,女,主要从事中药免疫药理与分子生
物学技术方面的研究,E-mail:497880740@ qq. com。
通讯作者及指导教师:董 燕(1969 年 -) ,女,博士,研究员,博士生
导师,主要从事中药免疫药理与分子生物学
技术方面的研究,E-mail:dondy001 @ gzucm.
edu. cn。
[摘 要] 目的:探讨青藤碱(Sinomenine,SIN)对脂多糖(LPS)以及白细胞介素 4(IL-4)诱导的 RAW264. 7 细胞向 M1、
M2 型极化的影响。方法:以 LPS刺激 RAW264. 7 细胞诱导 M1 型极化,IL-4 刺激 RAW264. 7 细胞诱导 M2 型极化;青藤碱作
用于 LPS或 IL-4 诱导的巨噬细胞后:用酶联免疫法(ELISA)检测不同诱导状态下 RAW264. 7 细胞 TNF-α和 IL-10 的分泌量;
荧光定量 PCR检测与巨噬细胞极化相关的精氨酸酶-1(Arg-1)、一氧化氮合酶(iNOS)、细胞因子信号转导抑制蛋白-2(SOCS2)
和细胞因子信号转导抑制蛋白-3(SOCS3)的 mRNA表达水平。结果:青藤碱能抑制 LPS诱导下细胞 TNF-α的分泌量,抑制细
胞 iNOS和 SOCS3 的 mRNA表达水平的升高。青藤碱能抑制 IL-4 诱导下细胞 IL-10 的分泌量和 Arg1 的 mRNA表达水平的升
高,对 IL-4 诱导下细胞 SOCS2 的 mRNA表达水平的升高没有明显影响。结论:青藤碱对 LPS诱导下巨噬细胞向 M1 型极化具
有抑制作用;对 IL-4 诱导下巨噬细胞向 M2 型极化具有抑制作用。青藤碱对 M1 /M2 亚型的失衡具有调节作用,有利于维持其
动态平衡。
[关键词] 青藤碱;脂多糖;白介素 4;巨噬细胞极化;M1 /M2 亚型
Effect of sinomenine on mouse RAW264. 7 macrophage cells line polarization in-
duced by LPS or IL-4
LUO Jin-Fang,ZHU Rui-Li,YI Lang,DONG Yan,WANG Pei-Xun. Department of Immunology ,Institute of Clinical
Pharmacology,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China
[Abstract] Objective:To investigate sinomenine (Sinomenine,SIN)effect on RAW264. 7 cells polarization to M1 or M2 phe-
notype induced by lipopolysaccharide (LPS)or interleukin -4 (IL-4). Methods:RAW264. 7 cells were induced to polarize to M1 by
LPS ,and to M2 by IL-4. Sinomenine effects on LPS or IL-4 induced macrophages:TNF-α and IL-10 secretion induced by different con-
dition were detected by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA);The expression level of mRNA of Arginase1(Arg-1) ,Nitric ox-
ide synthase(iNOS) ,suppressor of cytokine signaling protein-2(SOCS2)and suppressor of cytokine signaling protein-3(SOCS3)of
M1 /M2 phenotypes were detected by real time PCR respectively. Results:Sinomenine inhibited the increase of TNF-α secretion,iNOS
and SOCS3 mRNA expression level induced by LPS. Sinomenine inhibited the increase of IL-10 secretion and Arg-1 mRNA expression
level induced by IL-4,but SOCS2 mRNA expression level was not affected by Sinomenine. Conclusion:Sinomenine can inhibite the
macrophage polarization to M1 and M2 induced by LPS and IL-4. Sinomenine plays a regulatory role on imbalance of M1 /M2,and is
conducive to maintain the dynamic balance.
[Key words] Sinomenine;Lipopolysaccharide;Interleukin-4;Macrophage polarization;M1 /M2 phenotype
青藤碱(Sinomenine,SIN)是从中药青风藤中提
取的一种单体生物碱,具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、
镇痛、镇静等多方面的药理作用,临床用于治疗类风
湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)等自身免疫
性疾病疗效较好,且副作用小。巨噬细胞在 RA 等
自身免疫性疾病的发病中具有重要作用,有研究认
为凡是对 RA 有效的治疗方法或药物均能下调单
核 /巨噬细胞系统的功能[1]。近年有报道青藤碱具
有抗肿瘤作用[2],但其抗肿瘤的机制尚不明确。
巨噬细胞是具有异质性的一类免疫细胞,在体
内外不同环境影响下可极化为不同表型参与生理、
病理反应。从激活方式上分为经典激活的巨噬细胞
(Classically activated macrophages,CAMs 或 M1)和
选择性激活的巨噬细胞(Alternatively activated mac-
rophages,AAMs 或 M2)。细菌和脂多糖(Lipopo-
lysaccharide,LPS)可以诱导巨噬细胞向 M1 型分化,
65 中国免疫学杂志 2015 年第 31 卷
产生促炎症细胞因子,抵抗病原入侵但也造成机体
损伤[3];白细胞介素 4(Interleukin-4,IL-4)可以诱导
巨噬细胞向 M2 型分化,分泌抗炎症细胞因子,并在
组织修复与重建和肿瘤的形成过程中发挥作用[4]。
M1、M2 具有各自特征性标志分子[5,6],iNOS、
TNF-α是常见的 M1 型巨噬细胞的标志分子,IL-10、
Arg-1 是常见的 M2 型巨噬细胞标志分子。SOCS
(Suppressor of cytokine signaling,细胞因子信号抑制
因子)参与巨噬细胞极化的调节,在 SOCS2 敲除小
鼠中 M1 型巨噬细胞增加;SOCS3 敲除可以下调 M1
表型分子,对 IL-4 的反应性增强并表达 M2 表型
分子[7]。
通过调节 M1 和 M2 比例平衡而改善疾病状况
可能是中药免疫调节的作用机制之一。有关青藤碱
对巨噬细胞极化的影响目前尚未见报道,本文拟对
青藤碱对巨噬细胞极化的影响进行研究,通过体外
实验分析青藤碱对巨噬细胞在 LPS 和 IL-4 分别刺
激下的M1 /M2 型相关标志分子 TNF-α、IL-10 、iNOS
、Arg-1 的影响,以及对胞内参与巨噬细胞极化的
SOCS3 和 SOCS2 的 mRNA的影响,初步探讨青藤碱
在巨噬细胞极化过程中的调节作用。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 细胞株 RAW264. 7 细胞株为小鼠来源的
巨噬细胞株,购自武汉大学中国典型培养物保藏
中心。
1. 1. 2 主要试剂及仪器 青藤碱,分析标准品,
HPLC≥97% (阿拉丁)、胎牛血清(Gibco 公司)、
DMEM(Gibco 公司)、脂多糖(LPS)(Sigma 公司) ;
IL-4(Peprotech 公司) ;Mouse TNF-α ELISA Kit、
Mouse IL-10 ELISA Kit(eBioscience 公司) ;Trizol 试
剂(Invitrogen 产品) ,ReverTra Ace Qpcr RT Kit、
SYBR Green qPCR Master Mix 均为 TOYOBO 产品;
Arg-1、iNOS、SOCS2、SOCS3 及内参基因 GAPDH 引
物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
高速冷冻离心机(Eppendorf 5810R,德国);多功能
酶标仪(BioTek Synergy HT,美国) ;紫外-可见分光
光度计(Beckman Du730,美国) ;荧光定量 PCR 仪
(ABI 7500,美国)。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 细胞用 DMEM 完全培养液(含
10%胎牛血清,含青霉素、链霉素各 1 000 U /L)于
5% CO2、37℃培养箱进行传代培养。细胞生长至
90%融合后进行传代。传代培养 3 次后取对数生长
期的细胞用于试验。
1. 2. 2 青藤碱作用于 LPS 诱导的 RAW264. 7 将
处于对数生长期的 RAW264. 7 细胞按 3 × 105 个 /ml
接种于 6 孔板中,2 ml /孔,设正常组、LPS 组、LPS +
SIN组,每组 3 个复孔培养细胞生长至 90%融合状
态时给药组加入青藤碱至终浓度为 300 μmol /L 干
预 1 h,之后 LPS 组与给药组均加 LPS 至终浓度为
100 ng /ml,正常组不做任何处理,继续培养 8 h 后,
收集上清,- 20℃保存,细胞经 Trizol(1 ml /孔)处理
后于 - 70℃保存备用。
1. 2. 3 青藤碱作用于 IL-4 诱导的 RAW264. 7 将
处于对数生长期的 RAW264. 7 细胞按 3 × 105 个 /ml
接种于 6 孔板中,2 ml /孔,设正常组、IL-4 组、IL-4 +
SIN组,每组 3 个复孔。培养细胞生长至 80%融合
状态时给药组加入青藤碱至终浓度为 300 μmol /L
干预 1 h,之后 IL-4 组与给药组加 IL-4 至终浓度为
10 ng /ml,正常组不做任何处理,继续培养 12 h 后,
收集上清,- 20℃保存,细胞经 Trizol(1 ml /孔)处理
后于 - 70℃保存备用。
1. 2. 4 ELISA检测 取细胞上清液,参照 ELISA检
测试剂盒说明书分别检测 TNF-α、IL-10 的分泌量。
1. 2. 5 荧光定量 PCR 检测巨噬细胞 iNOS、
SOCS2、Arg-1、SOCS3 mRNA 的表达 ①细胞总
RNA 的提取及逆转录:取上述实验收集的细胞裂
解液,加入 0. 2 ml氯仿,剧烈震荡 15 s,室温静置 2
min后,12 000 r /min,4℃离心 15 min,吸取上层无
色水相,转移入另一 EP 管中(约 0. 5 ml) ,加入等
体积的异丙醇,颠倒混匀,室温静置 10 min 后,
12 000 r /min,4℃离心 15 min,弃上清,加 75%乙
醇 1 ml洗涤沉淀,12 000 r /min,4℃离心 15 min。
弃上清,风干10 ~ 15 min,每管加入 20 μl DEPC 水
溶解沉淀。紫外分光光度计测定所提 RNA的浓度
和纯度,含量为 1. 5 ~ 2. 0 g /L;OD260 /OD280 在
1. 8 ~ 2. 0 之间。
表 1 荧光定量 PCR引物序列
Tab. 1 Fluorescence quantitative PCR primer sequence
Primer Sequence(5’-3’) Size(bp)
GAPDH F:TGTGTCCGTCGTGGATCTGA
R:TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGGAG 136
iNOS F:CAAGCACATTTGGGAATGGAGA
R:CAGAACTGAGGGTACATGCTGGAG 125
Arg1 F:AGCTCTGGGAATCTGCATGG
R:ATGTACACGATGTCTTTGGCAGATA 72
SOCS3 F:CCTCCAAGTGTTGAACTTAGAACTG
R:TCAAAGCGCAAACAAGTTCC 96 bp
SOCS2 F:CTGCGCGAGCTCAGTCAAAC
R:CAAGAAAGTTCCTTCTGGAGCCTCT 150
75罗进芳等 青藤碱对 LPS、IL-4 诱导的小鼠 RAW264. 7 巨噬细胞极化的影响 第 1 期
然后按逆转录试剂盒说明书操作要求,将 RNA逆转
录成 cDNA。②荧光定量 PCR:按照 SYBR Green
qPCR Master Mix试剂盒说明书进行 PCR反应,95℃
预变性 30 s,95℃变性 5 s,60℃退火 30 s,40 个循
环,每次扩增设置 GAPDH 为内参对照。反应体系
为 SYBR Green 染料 10 μl,上游引物 1 μl,下游引物
1 μl,ddH2O 7 μl,cDNA模板 1 μl。制作标准曲线,
根据标准曲线扩增效率的一致性,选用 2-ΔΔCt法分
析样本中 iNOS、SOCS-3、Arg-1、SOCS-2 mRNA 的相
对表达量。荧光定量 PCR引物序列见表 1。
1. 3 统计学分析 实验数据用 SPSS17. 0 for win-
dows统计软件包处理分析,统计方法使用 One-Way
ANOVA及 LSD检验,数据用 x ± s表示,P < 0. 05 表
示有统计学意义,P < 0. 01 表示有显著统计学意义。
2 结果
2. 1 青藤碱对 LPS 诱导的 RAW264. 7 分泌 TNF-α
的影响 对 TNF-α的影响如图 1 所示,LPS作用 8 h
后,与正常组相比,TNF-α 的分泌量显著增多(P <
0. 01) ;加入青藤碱干预后,TNF-α 的分泌量显著降
低(P < 0. 01)。
2. 2 青藤碱对 IL-4 诱导的 RAW264. 7 分泌 IL-10
的影响 对 IL-10 的影响如图 2 所示,与正常组相
比,IL-4 作用 12 h 后,IL-10 分泌量显著增加(P <
0. 01) ;加入青藤碱干预后,IL-10 的分泌量降低(P
< 0. 05)。
2. 3 青藤碱对 LPS 诱导下细胞 iNOS 和 SOCS3 的
mRNA表达水平的影响 对 iNOS 的影响由图 3 可
见,与正常组相比,LPS 作用 8 h 后 iNOS 的 mRNA
相对表达量显著升高(P < 0. 01) ;LPS + SIN 组与
LPS组相比,iNOS 的 mRNA 相对表达量显著降低
(P < 0. 01) ,数据有统计学差异。
图 1 青藤碱对 LPS 诱导的 RAW264. 7 细胞分泌 TNF-α
的影响
Fig. 1 Effect of Sinomenine on TNF-α secretion in LPS-
induced RAW264. 7 cells
Note:Compared with CON group and LPS + SIN group ,* . P < 0. 01 .
对 SOCS3 的影响由图 4 可见,LPS作用 8 h 后,
与正常组相比,LPS组 SOCS3 的 mRNA 相对表达量
显著升高(P < 0. 01) ;LPS + SIN 组与 LPS 组相比,
SOCS3 的 mRNA表达水平降低(P < 0. 05),数据有
统计学差异。
图 2 青藤碱对 IL-4 诱导的小鼠 RAW264. 7 细胞分泌 IL-
10 的影响
Fig. 2 Effect of Sinomenine on IL-10 synthesis in IL-4-in-
duced RAW264. 7 cells
Note:Compared with CON group,**. P < 0. 01;compared with IL-4
group ,* . P < 0. 05.
图 3 青藤碱对 LPS诱导的 RAW264. 7 细胞 iNOS的mR-
NA表达水平影响
Fig. 3 Effect of Sinomenine on iNOS mRNA expression in
LPS-induced RAW264. 7 cells
Note:Compared with CON group and LPS + SIN group ,* . P < 0. 01 .
图 4 青藤碱对 LPS 诱导的 RAW264. 7 细胞 SOCS3 的
mRNA表达水平影响
Fig. 4 Effect of Sinomenine on SOCS3 mRNA expression
in LPS-induced RAW264. 7 cells
Note:Compared with CON group,**. P < 0. 01;compared with LPS
group,* . P < 0. 05 .
85 中国免疫学杂志 2015 年第 31 卷
图 5 青藤碱对 IL-4 诱导的 RAW264. 7 细胞 Arg-1 的
mRNA表达水平影响
Fig. 5 Effect of Sinomenine on Arg-1 mRNA expression in
IL-4-induced RAW264. 7 cells
Note:Compared with CON group and IL-4 + SIN group,* . P < 0. 01.
图 6 青藤碱对 IL-4 诱导的 RAW264. 7 细胞 SOCS2 的
mRNA表达水平影响
Fig. 6 Effect of Sinomenine on SOCS2 mRNA expression
in IL-4-induced RAW264. 7 cells
Note:Compared with CON group,* . P < 0. 05 .
2. 4 青藤碱对 IL-4 诱导下细胞 Arg-1 和 SOCS2 的
mRNA表达水平的影响 对 Arg-1 的影响由图 5 可
见,IL-4 作用 12 h 后,与正常组相比,IL-4 组 Arg-1
的 mRNA表达水平显著升高(P < 0. 01);IL-4 + SIN
组与 IL-4 组相比,Arg-1 的 mRNA 表达水平显著降
低(P < 0. 01) ,数据有统计学差异。
对 SOCS2 的影响由图 6 可见,IL-4 作用 12 h
后,与正常组相比,IL-4 组 SOCS2 的 mRNA 表达水
平显著升高(P < 0. 01);IL-4 + SIN 组与 IL-4 组相
比,SOCS2 的 mRNA 表达水平无统计学差异(P >
0. 05)。
3 讨论
巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞
群体,在体内不同的微环境影响下,M1 /M2 亚型的
平衡处于动态变化中,局部的 M1 和 M2 的动态失衡
伴随疾病的发生发展。M1 型参与炎症的发生,M2
型参与肿瘤的发生,在肿瘤进展和转移过程中起重
要作用,已被认为是肿瘤治疗的新靶点。在动脉粥
样硬化疾病的发展过程中 M1 和 M2 的比例是变化
的,早期发挥作用的主要是 M1 型,而在晚期发挥作
用的主要是 M2 型。在炎症的推进过程中,由于受
到不同的细胞信号通路和细胞因子的调控和影响,
M1 /M2 亚型的平衡一直处于动态变化中,向任何一
方的倾斜都决定了炎症的最终转归。维持 M1 和
M2 的动态平衡对于疾病的治疗有重要意义。青藤
碱的药理活性广泛,具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降
压、抗心律失常等多种生物活性,近年来还有用于治
疗慢性肾炎、抗氧化、抗肿瘤、戒毒的研究报道。本
研究初步探讨了青藤碱对巨噬细胞极化的影响,为
进一步研究青藤碱多种药理活性的免疫学机制提供
参考。
本实验结果表明,以 LPS 刺激小鼠 RAW264. 7
细胞可致其 M1 型巨噬细胞标志分子 TNF-α分泌量
上升及 iNOS mRNA 表达升高,并且 SOCS3 表达也
升高;青藤碱能抑制 TNF-α 的分泌,抑制 iNOS 和
SOCS3 的 mRNA表达水平,说明青藤碱能抑制 LPS
诱导下小鼠 RAW264. 7 细胞的 M1 型极化。既往的
研究认为在某些炎症性疾病中巨噬细胞通过经典激
活途径极化为 M1 亚型后,促进炎症的进展[8],而
SOCS3 参与 M1 型极化[7]。本研究提示青藤碱阻止
巨噬细胞向 M1 型极化是青藤碱抗炎机制之一。
以 IL-4 刺激小鼠 RAW264. 7 细胞可致其M2 型
巨噬细胞标志分子 IL-10 的分泌量升高和 Arg-1 的
mRNA表达升高,并且 SOCS2 的 mRNA表达水平升
高;青藤碱能抑制 IL-10 的分泌和 Arg-1 的表达。提
示青藤碱能抑制 IL-4 诱导下小鼠 RAW264. 7 细胞
的 M2 型极化。SOCS2 参与 M2 型极化的调节[7],
本研究中青藤碱对 SOCS2 的 mRNA 表达升高无明
显影响,提示青藤碱不是通过影响 SOCS2 的表达水
平来抑制 M2 型极化。
青藤碱对 M1 型巨噬细胞的相关标志物有下调
作用,提示其对 M1 极化有抑制作用,是青藤碱抗炎
免疫机制之一。青藤碱对 M2 型巨噬细胞的相关标
志物有下调作用,提示其对 M2 极化有抑制作用,可
能对 M2 型巨噬细胞参与的疾病发挥治疗作用。体
外实验结果表明青藤碱可能通过调节巨噬细胞的
M1 和 M2 的动态失衡干预疾病的发生发展,相关研
究尚需进一步深入。
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[收稿 2014-07-15 修回 2014-08-27]
(编辑 倪 鹏)
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[收稿 2014-05-15 修回 2014-07-21]
(编辑 倪 鹏)
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06 中国免疫学杂志 2015 年第 31 卷