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收稿日期：2011-05-06
基金项目：陕西省教育厅项目(No. 08JK244)；陕西理工学院项目(No.SLJQD0713)资助。
作者简介：丁小维，女，生于1979年，讲师，主要从事微生物资源的开发与利用方面的研究。E-mail: kaihhui168@yahoo.com.cn。*通讯作
者，E-mail：Dengbw2008@yahoo.com.cn
文章编号：1001-8689(2011)12-0885-04
中国抗生素杂志2011年12月第36卷第12期
两株牛肝菌内生真菌的分离鉴定及活性初步研究
丁小维 刘开辉 邓百万 陈文强
(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西省食药用菌工程技术研究中心，汉中 723001)
摘要：目的 从牛肝菌中分离内生真菌，并对其活性进行初步研究。方法 采用组织培养法从秦巴山区牛肝菌子实体中分
离内生真菌，基于形态特征及ITS系统发育分析对内生真菌进行鉴定，以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌为指示
菌，检测内生真菌发酵产物的抑菌活性，并对其绿豆芽的抑制活性进行了研究。结果 分离获得2株内生真菌L3和L5，L3和黄
瘤孢菌(Hypompces chrysosperums)序列同源性为99%；L5和毛霉属序列同源性为100%；两株菌的形态学特征分别与黄瘤孢菌和
毛霉属形态特征一致。结论 内生真菌L3和L5，分别鉴定为黄孢瘤菌和毛霉属；这两株菌发酵液对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄
球菌具有较强的抑制作用，对绿豆芽生长均具有抑制作用。
关键词：牛肝菌；内生真菌；分离鉴定；活性研究
中图分类号：Q936 文献标识码： A
Isolation, identifi cation and bioactive assays of two endophytic fungi
associated with Boletaceae
Ding Xiao-wei, Liu Kai-hui, Deng Bai-wan and Chen Wen-qiang
(School of Biological Science & Engineering, Shaanxi University of Technology, Shaanxi Provincial Engineering
Research Center of Edible, Medicinal Fungi, Hanzhong 723001)
Abstract Objective To isolate endophytic fungi from Boletus sp., KL-1, and investigate the bioactivity of
the endophytic fungi. Methods The endophytic fungi from Boletus sp., KL-1 was isolated by tissue culture. The
fungal endophytes were identifi ed based on morphological characteristics and ITS sequence analysis. Antibacterial
activities of fermentation supernatant were performed using Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis
as the target bacteria, and growth inhibition of fermentation supernatant for bean sprouts were performed. Results
The endophytic strains, L-3 and L-5, obtained shared ITS sequence homology of 99% and 100% with Hypomyces
chrysospermus and Mucor sp., respectively. Their morphology characteristics were consistent with Hypomyces
chrysospermus and Mucor sp. Conclusion They were classifi ed into Hypomyces chrysospermus and Mucor sp.,
respectively. Fermentation supernatants inhibited the growth of S. aureus, B. subtilis and bean sprouts.
Key words Boletus; Endophytic fungi; Isolation and identifi cation; Bioacitivity assays
内生真菌定殖于健康的生物组织内，种类繁
多，分布广泛[1]。近年来，内生真菌的代谢产物的研
究倍受关注，大量具有抗菌、抗癌、杀虫等活性的
次生代谢产物从内生真菌中分离出来[2-4]，内生真菌
已经成为开发活性物质资源库。目前研究的内生真
菌仅占自然界中内生真菌7%，大量的未开发的内生
微生物药物筛选
DOI:10.13461/j.cnki.cja.004888
. 886 . 两株牛肝菌内生真菌的分离鉴定及活性初步研究 丁小维等
真菌资源已经限制了内生真菌与宿主关系及内生真
菌功能角色方面的研究，发掘未开发内生真菌资源
对菌种资源的保育具有重要意义，并为发掘新化合
物及新基因提供菌种资源。
牛肝菌科(Boletaceae)是担子菌亚门伞菌目的重要
一科。含有多糖、生物碱、甾醇类化合物、酸类化合
物等活性物质，可用于治疗腰腿疼痛、手足麻木、四
肢抽搐，具有抗流感病毒、防治感冒的作用[5]。目前
国内外对大型真菌的内生真菌方面的研究甚少，限
制了大型真菌及其内生真菌的开发利用。本文对牛
肝菌中分离得到的两株内生真菌进行了初步研究，
旨在为牛肝菌内生真菌资源的开发利用抛砖引玉。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料
牛肝菌采至陕西省汉中市。供试菌株：金黄
色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 大肠埃希菌
(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
1.1.2 培养基
分离纯化培养基、发酵培养基为改良马铃薯葡
萄糖琼脂(CPDA)培养基；鉴定培养基为查氏培养
基；指示菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
1.2 内生真菌的分离
用自来水将新鲜牛肝菌冲洗2h左右。在超净工作
台中，无菌水冲洗2~3次，75%乙醇浸泡30s，无菌水
洗3次；0.1%升汞浸泡8min，无菌水冲洗5次。用无菌
解剖刀将牛肝菌切割成0.5cm左右的小块，接于CPDA
培养基中，37℃人工气候箱中培养，待材料周围有菌
长出后，平板划线纯化单菌落，斜面保存备用。
1.3 内生真菌的鉴定
在查氏培养基上，28℃培养菌株(L3，L5)5~10d,
观察菌落形态，在显微镜下观察菌丝、孢子、产孢
等结构特征。
采取CTAB法 [6]提取菌丝体的DNA。利用真菌
ITS通用引物对ITS1、ITS4[12]25μL。反应体系包括：
10×buffer 2.5μL，MgCl2 2μL，dNTP1μL，引物各
1μL，Tag酶0.125μL, DNA模板1μL，无菌去离子水
补足至25μL。扩增程序：94℃ 5min，94℃ 30s，
52℃30s，72℃30s，30个循环；72℃ 7min。PCR扩
增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，用1.0%的琼脂糖凝
胶电泳分析PCR产物，纯化的PCR产物由上海生工生
物技术服务有限公司进行双向测序。将所测序列提
交到 GenBank 数据库中并进行Blast检索，下载同源
性较高的数据，生成 Fasta格式的文件。用Clusta-X
软件对所得序列进行人工校正及比对分析。利用
Mega3.1 软件构建系统发育进化树。
1.4 内生真菌活性研究
1.4.1 发酵液的预处理
两株菌发酵完毕后，发酵液采用4000r/min高速
离心10min，上清液用旋转蒸发仪进行浓缩10倍，浓
缩液用作抑豆芽及抑菌试验。
1.4.2 抑豆芽试验
将健壮新鲜绿豆，用70%酒精进行表面消毒
30s，用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干种子表面
水分。将绿豆分别置于待测发酵滤液中浸泡4h，对
照组(CK)的绿豆用蒸馏水浸泡。往带有双层滤纸的
灭菌平皿中各加入5mL待测发酵滤液，对照组加等
量蒸馏水，将浸泡后的绿豆放入无菌培养皿中，每
皿10粒绿豆。置于28℃暗处培养，60~72h后测量豆
芽长度，计算抑制率。培养期间每24h补充1次5mL
相应的待测样品液。
抑制率%=(对照组豆芽长度－处理组豆芽长度)/
对照组豆芽长度×100%
1.4.3 抑菌法
采用滤纸片扩散法[7]测定其发酵液对大肠埃希
菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用。
在28℃的恒温培养箱中，培养24h后，观察和测量抑
菌圈的大小。
2 结果
2.1 内生真菌的分离鉴定
2.1.1 内生真菌的形态特征
在CPDA培养基上培养10d后，观察L3和L5的
形态特征。L3菌丝匍匐生长，菌落平展，初期为白
色，菌落边缘规则，5d后菌落呈黄色，孢子为黄色球
形。L5菌落絮状呈淡棕色，表面湿润，菌丝向上生
长，无隔，不分枝，孢子为椭圆形孢囊孢子(图1)。
2.1.2 系统发育分析
由上海生工生物技术有限公司对菌株L3和L5的
ITS进行测序，所得序列长度分别为517、552bp，序
列提交GenBank数据库，登录号分别为JF501024、
JF501025。用Clusta-X软件对所测菌株ITS序列进
行人工校正，从GenBank上下载的相应数据，采用
Mega3.1软件，按照N-J法聚类构建系统发育树，经
自举法检验(1000次重复)，得到进化树(图2)，L3和
黄瘤孢菌(Hypompces chrysosperums)聚类于一个分支
上，序列同源性为99%；L5和毛霉属聚类于一个分支
. 887 .中国抗生素杂志2011年12月第36卷第12期
A:L3菌落形态，B:L3孢子形态，C:L5菌落形态，D：L5产孢结构
图1 内生真菌 L3和L5 菌株的形态特征
Fig. 1 Morphological traits of the endophytic fungi, L3 and L5
图2 内生真菌L3和L5的ITS进化树
Fig. 2 Neighbor-joining tree of ITS sequences of the endophytic fungi, L3 and L5
上，序列同源性为100%。基于形态学特征和ITS序列
分析，将L3和L5分别初步定为黄瘤孢菌和毛霉属。
2.2 活性研究
2.2.1 抑豆芽试验
为了测定L3和L5对绿豆芽生长的抑制作用。用
两株菌的发酵浓缩液培养绿豆芽种子，72h后对照组
豆芽长度为7.84cm，用L3菌株发酵浓缩液培养的绿
豆芽平均长度为2.63cm，平均抑制率为66.5%；用L5
菌株发酵浓缩液培养的绿豆芽平均长度为1.53cm，
平均抑制率为80.5%(图3)。结果表明，这两株真菌的
发酵液对绿豆芽具有抑制作用，所产生的抑制作用
可能与其产生的能抑制真核细胞中RNA聚合酶的活
性的物质有关。
2.2.2 抑菌活性
采用滤纸片法对菌株发酵液进行抗菌活性研
究，结果表明，L3和L5的发酵液对金黄色葡萄球菌
和枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用，它们对金黄
色葡萄球菌的抑菌圈分别为17.8mm、16.2mm；对枯
草芽孢杆菌的抑菌圈分别为为19.3mm、17.7mm，抑
制作用可能与所产生的抗菌活性物质有关；对大肠
埃希菌没有抑菌作用(表1)。
3 讨论
目前生物内生环境，特别是植物内生环境，是
内生真菌研究的焦点。已对大量的药用植物内生真
菌进行调查，获得了多样的内生真菌[8]，并分离出具
抗癌、抗菌、杀虫等活性的化合物[9]。但关于大型真
菌的内生真菌报道较少。
内生真菌在和宿主长期协同进化过程中，已形
成了相对稳定的关系，如宿主提供给内生真菌营养
和水分，内生真菌帮助宿主抵抗病原菌的侵袭[10]。
本研究从秦巴山区牛肝菌中分离得到2株内生真菌L3
和L5，分别鉴定为黄瘤孢菌和毛霉，这两株菌对2种
革兰氏阳性细菌具有较强的抑制作用，可能是由于
菌株产生具抗菌活性的物质。
抑芽法是由张志光[11]等根据鹅膏菌的毒肽在低
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参 考 文 献
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A: 对照，B: L3菌株发酵液培养的绿豆芽
图3 L3发酵液对绿豆芽的抑制作用
Fig. 3 The inhibitory action of fermentation supernatants of the
endophytic fungi, L3 on the growth of bean sprouts
表1 L3和L5发酵液对病原菌的抑制作用
Tab. 1 The antimicrobial activities of fermentation supernatants
of L3 and L5 against pathogens
病原菌 菌株L3 菌株L5
大肠埃希菌 - -
金黄色葡萄球菌 +++ +++
枯草芽孢杆菌 +++ +++
注：+：抑菌直径为 8mm，++：8~12mm，+++：13~20mm，−：
无抑菌活性
浓度就能抑制真菌细胞RNA聚合酶Ⅱ的活性，从而
阻止mRNA转录和蛋白质的合成，抑制种子的萌发
和生长设计出的检测毒肽的方法。目前已被应用于
许多毒素的检测。本实验借鉴此方法检测内生真菌
是否产生毒素，实验结果表明，检测菌株的发酵液
对绿豆芽的发芽具有较明显的抑制作用，低于鹅膏
毒肽粗毒液(96.29%)的抑芽率，高于裸盖菇菌株发酵
液的抑芽率[12]，推测L3和L5产生了某种对绿豆芽具
有抑制作用的物质。目前，对于牛肝菌毒素成份几
乎处于未知的状态，仅有一些致幻作用的幻觉诱发
物和毒性蛋白被分离出[13]，有关牛肝菌内生菌方面
的报道更是空白。因此无法判断菌株L3和L5的抑芽
作用是什么所为。有关这两株菌所产生的毒素种类
有待于分离出具有抑芽作用的物质，通过仪器分析
来确定。
两株牛肝菌内生真菌的分离鉴定及活性初步研究 丁小维等