全 文 ：研究论文· A RTICLE
海洋科学/ 2008 年/第 32 卷/第 11 期
铁促进海水小球藻油脂积累的动态过程
刘志媛1 , 2 ,王广策1
(1.中国科学院 海洋研究所 ,山东 青岛 266071;2.中国科学院 研究生院 ,北京 100039)
摘要:许多微藻被认为是制备生物油燃料的理想原料 , 培养液中高浓度的 Fe3+对海水小球藻(Chlorella vul-
garis)的油脂积累有明显的促进作用。采用荧光分光光度法对尼罗红染色后的海水小球藻的油脂积累过程
进行了观测 ,同时测定了铁对小球藻生长和叶绿素含量的影响 。结果表明 ,高铁处理的小球藻出现了两次油
脂积累高峰 ,且第 2 次脂积累的量显著高于第 1 次。
关键词:脂;微藻;FeCl3 ;叶绿素;荧光分光光度法
中图分类号:Q949.21　　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-3096(2008)11-0056-04
　　随着石油储量的日益减少和油价飞涨 ,以动植
物为原料的生物柴油的开发和应用再次受到广泛关
注。大规模培养藻类是开发生物柴油 ,建立可再生
能源基地的重要途径 [ 1 ～ 3] 。同陆生油料植物相比 ,
用微藻生产生物柴油具有一定的优势。首先 ,藻类
生长周期短 ,生长速度快 ,可以连续采收 ,达到较高
的生物产量和油脂产量。全球石油俱乐部(Global
Pet roleum Club)的统计数据表明 ,微藻油脂的单位
面积年产量是油棕的 15倍 ,大豆的 75 倍 ,油菜籽的
200倍[ 3] 。其次是微藻 ,尤其是海水种的 ,培养不与
农业争耕地和淡水 ,不影响食物安全保障 ,如与养殖
废水处理相结合 ,可以充分利用氮 、磷等资源 ,兼收
环境保护之利。此外 ,Scragg 等[ 4] 的试验结果表明 ,
含油量高的小球藻可以直接作为未经改装的内燃机
的燃料 ,而且产生的 SOX等废弃污染物较柴油少 ,省
略油脂提取步骤 ,必将提高微藻作为生物柴油原料
的市场竞争力。
虽然已有许多培养微藻 、制取生物柴油的研究
结果 [ 4 , 6 ～ 11] ,但微藻生物柴油至今尚未实现商业化
生产 。许多研究微藻制备生物柴油的公司都在致力
于降低生产成本 。美国可再生能源实验室(NREL)
认为 ,影响生产成本的关键不是相关的工程技术问
题 ,而主要是微藻的生物质产量和油脂含量[ 10] 。
只有当油脂含量达干物质的 50%～ 60%以上
时 ,微藻生产生物柴油在价格上才具有竞争力[ 12] 。
作者研究发现 ,培养液中高浓度的 FeCl3对海水小球
藻(Chlorel la vulgaris)的油脂积累有明显的促进作
用 ,可使其质量分数高达干质量的 56.6%[ 13] ,具有潜
在的应用价值 ,因此作者进一步研究了加铁促进这种
藻的油脂积累的动态过程以及加铁对其生长的影响。
1　材料与方法
1.1　藻种与培养
海水小球藻 C.vulgaris C7由中国海洋大学藻
种库提供 。用不加 Si 的 f/2 培养基[ 14] (记为 f/2-
Si),单藻种静止培养 。培养温度21℃±2℃,光强为
100μmol/(m2 · s),光暗比为 14h∶10 h。海水取自
青岛汇泉湾 ,经过滤后煮沸消毒 。海水本身 Fe3+浓
度为 6.73×10-6mol/L , f/2-Si培养基初始加 Fe3+
(FeCl3 ·6H2O/EDTA)浓度为 1.2×10-5mol/L。
1.2　分析方法
1.2.1　生长测定
以小球藻活体吸收光谱 500 nm 处的光密度值
代表细胞密度 ,细胞数用血球计数板计数 。光密度
用紫外可见分光光度计(UV757)测定 。
1.2.2　总脂含量测定
自 G reenspan 等[ 15] 提出用尼罗红(9-diethy l-
amino-5H-benzo [ α] phenoxazine-5-one)染色 ,用荧
光法测定细胞内油脂含量以来 ,先后在多种生物中
证明尼罗红染色后细胞荧光强度与细胞内油脂含量
显著相关[ 6 , 15 ～ 21] 。作者的研究结果表明 ,经尼罗红
染色后的小球藻在 480 nm 光激发下 ,位于 580 nm
的荧光峰的强度与称质量法测定的总脂含量呈线性
收稿日期:2008-03-10;修回日期:2008-04-25
基金项目:国家 863 计划项目(2006AA05Z112 , 2007AA09Z110 ,
2007AA09Z406)
作者简介:刘志媛(1974-),女 ,山东淄博人 , 在读博士 , 主要从事藻类
生理与发育调控研究 , 电话:13646486737 , E-mail:liu zhiyuan111@
163.com;王广策 , 通讯作者 , 研究员 , 电话:0532-82898574 , E-mail:
gcw ang@ms.qdio.ac.cn
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研究论文· ARTICLE
Marine Sciences/ Vo l.32 , No.11/ 2008
正相关[ 13] 。因此 ,本实验采用同样荧光分光光度法
直接测定细胞的中性脂含量 ,具体方法为:1 mL 藻
液加 0.01 mL 尼罗红染料(质量浓度为 0.1 g/ L 丙
酮)染色 7 min 后 ,用日立 F-4500型荧光分光光度
计 ,用 480 nm 光激发 ,测定荧光发射光谱 ,以波长为
580 nm 的荧光强度减去藻细胞和尼罗红在该波长处
的荧光值 ,所得相对荧光强度与细胞中总脂含量呈线
性关系。
1.2.3　叶绿素含量测定
80%丙酮:二甲基亚砜溶液(体积比 1/1 ,)提取叶
绿素 ,用 UV757分光光度计测定 663 nm和 645 nm光
密度[ 22] ,Arnon公式计算抽提液中的叶绿素含量[ 23] 。
1.2.4　统计分析
对 3次平行试验结果 ,用 DPS 数据处理系统进
行统计分析[ 24] 。
2　结果
2.1　铁对小球藻脂积累的促进作用
经尼罗红染色的海水小球藻 ,用 480 nm 光激发
时的室温荧光发射光谱如图 1 所示。位于 690 nm
的是叶绿素 a的发射峰 ,位于 580 nm 的是被尼罗红
染色的脂的发射峰 ,由于二者相距约100 nm ,叶绿素
不会影响细胞中脂含量的直接测定。在普通培养条
件下(f/2培养基),已达生长静止期的小球藻没有油
脂积累(曲线 a),向处于指数生长后期的培养液中补
加 2.4×10-5 mol /L Fe3+(FeCl3 ·6H 2O/EDTA)
后 ,580 nm 处出现平缓的荧光峰 ,说明油脂含量增
加(曲线 b)。如将处于指数生长后期的小球藻离心
收集并重新悬浮于补加 1.2×10-5 mol/ L Fe3+的
f/2-Si培养基中 ,580 nm 荧光发射峰升高并超过叶
绿素荧光峰 , 说明小球藻重新接种于新的含较高
Fe
3+浓度的培养基中后 ,能够大量积累油脂(曲线 c)。
　　用尼罗红染色法可以不经抽提 ,直接测定藻类
细胞中的脂含量 ,而所需材料少 ,使分析测定方法明
显简化 。
图 1　以 480 nm 波长激发 ,经尼罗红染色的海水小球藻的室
温荧光发射光谱
Fig.1　F luo rescence emission spectr a o f N ile red-stained C.
vulgaris cells with 480 nm as the excitation wavelength
曲线 a:普通培养条件下的小球藻的荧光发射光谱;曲线
b:指数生长后期补铁的小球藻的荧光发射光谱;曲线 c:重新
接种于高铁培养基中的小球藻的荧光发射光谱
Cu rve a:emission spect rum of C.vulgar is under ordinary grow th
condi tion s;curve b:emis sion spect rum of C.vulgar is supplemented
w ith Fe3+ in the later exponen tial g row th phase;curve c:emission
spectrum of C.vulgar is reinocu lated into medium w ith hig h Fe3+con-
cent ration
2.2　小球藻生长和脂积累的动态过程
处于指数生长后期的小球藻经 4 000 g 离心
5 min后 , 细胞沉淀重悬于不加铁的 f/2-Si 培养液
中 ,用分光光度法测定生长和油脂积累的动态过程 ,
结果如图 2所示 。
图 2　培养基中添加不同浓度的 Fe3+对小球藻(C.vulgaris)生长(a)和油脂积累(b)的影响
F ig.2　Grow th and lipid accumula tion of C.vulgaris in media supplemented with different levels o f Fe3+ concentration
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　　由图 2 可知 ,重新悬浮于不加铁的新 f/2-Si培
养基中 ,小球藻仍可以利用海水中的铁(Fe3+浓度为
6.73×10-6 mol/ L)恢复生长 ,但指数生长期较短。
添加 1.2×10-6 mol / LFe3+ ,则指数生长期延长 ,达
到较高的细胞密度 ,说明适当提高海水中铁的浓度 ,
可以促进小球藻的生长 ,但是对油脂的积累无明显
的促进作用 。当添加的 Fe3+浓度提高 10 倍 ,达到
1.2×10-5 mo l/L 时 ,在第 9天至第 13天时 ,小球藻
细胞数增加很慢 ,以后又恢复 ,最后细胞密度与不加
Fe3+的处理相近 ,说明铁浓度过高对生长有抑制作用 ,
但并不十分严重。另一方面 ,添加高浓度的 Fe3+(1.2×
10-5 mol/ L)对脂的积累可产生显著的影响 ,在加铁
后的第 6天和第 17天分别出现油脂积累的高峰 ,油
脂含量分别为其他处理的 3 倍和 7倍 。而且 ,两个
高峰之间油脂含量的最低点恰好是细胞分裂的延缓
期(加铁后的第 9天至第 11天)。因此 ,油脂积累的
第一个高峰相当于细胞对逆境的响应。油脂的再次
积累不仅时间长 , 含量高 ,而且与藻生长的恢复同
步 ,说明代谢途径和贮存物的类型已经进行了调整 。
2.3　铁对小球藻叶绿素含量的影响
在加铁后重新培养7 ,11 ,19 d时测定小球藻叶绿素a
和b的含量(图 3)。在不添加铁 ,只能利用培养液海水中
铁的情况下 ,叶绿素含量较低 ,除第19天叶绿素b的含量
稍下降外 ,叶绿素 a和 b的含量在培养期间无明显变化。
加铁培养基中小球藻的叶绿素含量均高于不加铁的。随
培养时间延长 ,加铁量高的影响更明显(如第 11天和第
19天)。此外 ,在加Fe3+浓度为1.2×10-5 mol/L时 ,叶绿
素 a和 b的含量均以第 11天为最高 ,恰好与细胞生长减
缓和油脂含量下降至最低点同步(图 2 ,图 3)。
图 3　培养基中添加 Fe3+对小球藻(C.vulgaris)叶绿素 a和
叶绿素 b 含量的影响
Fig.3　Chlo rophy ll a and b contents o f C.vulgaris in media
supplemented Fe3+
3　讨论
加铁使含油量不高的小球藻的脂含量提高了 7
倍 ,高达干物质质量的 50%以上 ,这对于生物柴油开
发具有一定的吸引力 ,特别是海水小球藻可以用海
水培养 ,不与农业争水源和耕地 ,更具有明显的优
势 。
包括小球藻在内的多数绿藻的贮藏物质是淀
粉 ,在叶绿体中以淀粉粒形式存在 ,当遇到逆境时有
些绿藻会大量积累油脂[ 5 , 25] 。
在小球藻中观察到的这种油脂大量积累现象 ,
可能是由于已糖库的代谢途径由合成淀粉为主转变
为合成油脂 ,分叉点在于磷酸已糖的调用方向 。光
合作用所固定的过量的碳进入磷酸已糖库 ,一方面
可以淀粉形式储存在叶绿体内 ,另一方面 ,还可通过
糖酵解途径生成丙酮酸 ,经丙酮酸脱氢酶催化直接
得到乙酰辅酶 A 。乙酰辅酶 A 是脂肪酸合成的前
体 ,合成的脂肪酸运出叶绿体后 ,在内质网上同甘油-
3-磷酸形成中性脂三酰甘油 ,贮存于油体中[ 26] ,这就
是被尼罗红染色后 ,经荧光检测观察到的油脂积累
现象。磷酸已糖如被调用作脂肪酸合成 ,淀粉的合
成将受到抑制。乙酰辅酶 A 还是线粒体中的三羧酸
循环的碳源 ,其中间产物琥珀酰辅酶 A 是合成卟啉
类化合物的基本原料 ,而卟啉是合成叶绿素 、细胞色
素及藻胆素的基本原料[ 27] 。因此 ,在实验中观察到
的油脂积累和叶绿素含量的变化是叶绿体 、内质网
和线粒体等多种细胞器协同作用的结果 。但是在这
些代谢途径中并没有铁的直接作用位点。
叶绿体是微藻细胞的主要铁库 ,一条完整的光
合电子传递链需要 24个铁原子 。此外 ,线粒体的呼
吸电子传递链中的细胞色素也是铁卟啉化合物 ,叶
绿体 、线粒体的电子传递链和光合作用 、呼吸作用等
基础代谢过程是铁的直接作用位点。在大洋中 ,存
在着高氮 、低叶绿素含量的初级生产力极低的区域 ,
其限制因子就是海水中可利用铁的含量低于临界浓
度 ,通过补铁可以明显提高初级生产力[ 28] 。
在光能自养的小球藻中 ,光合作用和呼吸作用
在具有超循环结构的代谢网络中处于核心地位 ,以
正反馈的方式驱动整个网络运转 ,铁通过影响光合
作用和呼吸作用 ,如何进一步影响糖库的调用方向 ,
由贮存淀粉转向积累油脂是需要进一步研究的问
题 。显然 ,这些过程涉及到叶绿体 、线粒体和内质网
等多种细胞器的协同作用 ,由于乙酰辅酶 A 在脂肪
酸合成和呼吸作用中处于代谢的关键位置 ,同时又
是脂类 β-氧化的产物 ,在这种协同作用中乙酰辅酶
A 的代谢趋向和调控是值得关注的问题 。
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Marine Sciences/ Vo l.32 , No.11/ 2008
　　致谢:感谢中国科学院海洋研究所周百成研究员对本文
提出诸多宝贵意见;感谢中国海洋大学朱保华博士的热心帮
助。
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(本文编辑:康亦兼)
(上接第 59页)
Dynamics of lipid accumulation in marine microalga Chlorella
vulgaris promoted by iron
LIU Zhi-yuan 1 , 2 , WANGGuang-ce 1
(1.Institute of Oceanolog y , Chinese Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China;2.Graduate Schoo l , Chi-
nese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China)
Received:Mar., 10 , 2008
Key words:lipid;microalga;FeCl3 ;chlor ophy ll;spectrof luorimetry
Abstract:Some microalg ae are propo sed as good candidates fo r biodiesel production.Lipid accumulation in
a marine microalg a Chlorel la vulgaris can be promo ted by high lev el o f Fe3+concentration in the media.The
dynamics o f lipids accumulation promo ted by iron in Nile red-stained C.vulgaris was t raced w ith spec-
t ro fluo rime try method.T he ef fect of i ron on the g row th and chlorophy ll content of C.vulgaris was also
measured.The results show ed that notable lipid accumulation occurred tw ice in cells under high i ron condi-
tion and much more lipid accumulated in the second period.
(本文编辑:张培新)
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