全 文 ：牛肝菌液体发酵及产多糖的影响因素研究
刘　媛 ,陈育如 ,陈志芳①
(南京师范大学　生命科学学院 ,南京　210097)
摘　要:牛肝菌(Boletused)属外生菌根菌 , 美味牛肝菌多糖有明显的抗肿瘤效果。采用液体培养方法对牛肝菌菌丝
体的发酵及产多糖特性进行了研究 ,实验考察了培养基中葡萄糖浓度和培养基的初始 pH 对牛肝菌菌丝量及产多
糖的影响。结果表明 ,实验条件下 , 该株牛肝菌在 pH值 5.5～ 6.0 , 葡萄糖含量为 60 mg/ mL时 , 多糖产量为 6.7 mg/
mL。实验考察了从发酵菌丝体中提取多糖的几种方法 , 其中研磨法效果较好 , 与对照相比 , 多糖提取量增加了
20%。
关键词:牛肝菌;菌丝体;发酵;多糖;提取
中图分类号:Q93　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-3678(2004)01-0044-03
Study on effect factors of boletus sp.liquid fermentation
for polysaccharides preparation
LIU Yuan , CHEN Yu-ru , CHEN Zhi-fang
(College of Life Science , Nanjing Normal University , Nanjing 210097 , China)
Abstract:Boletus is mycorrhizal fungi.The polysaccharides of Boletused edulis have significant effect on tu-
mour.In this paper , the liquid fermentation of boletus sp.for polysaccharides preparation were studied.Effects
of glucose concentration and medium pH on polysaccharides of boletus sp.were discussed.The result indicated
that 6.7 mg/mL polysaccharides was gained when the medium pH value was 5.5 ～ 6.0 and glucose concentra-
tion was 60 mg/mL.The effects of separation methods on cell disruption and polysaccharides yield were inves-
tigated.
Key words:boletus sp.;mycelium;fermentation;polysaccharides;separation
　　牛肝菌属于担子菌纲伞菌目 、牛肝菌科 ,其中的
食用牛肝菌如美味牛肝菌(Boletus edulisv)、铜色牛
肝菌(B.aereus)、橙香牛肝菌(B.citrifragrans)是著
名的食用真菌。我国牛肝菌资源丰富 ,尤以我国西
南和华南地区食用牛肝菌资源最为丰富[ 1 , 2] 。牛肝
菌含有多种氨基酸 、维生素 、矿物质和多糖 ,具有调
整免疫机体功能 ,降低血脂 ,提高人体免疫力以及显
著的抗癌作用[ 3] ,由于其优良的食疗保健作用 ,国内
外市场的需求量不断增加。但牛肝菌的人工栽培难
度大 ,目前还未能在人工栽培的条件下大量获得子
实体。发酵菌丝体培养周期短 ,生长快 ,易于大规模
工业生产 ,从其发酵液或固体培养物中得到菌丝体
作为保健食品或提取多糖具有很好的应用前
景[ 4 ,5] 。本文旨在通过牛肝菌的液体培养 ,对其菌
丝量及产多糖的条件进行探讨。
① 收稿日期:2003-09-25基金项目:江苏省高校自然科学研究指导性计划(180003)和高新技术产业发展项目(JH02-082)资助作者简介:刘媛(1980-),女 ,南京师范大学生科院硕士研究生 ,主要从事应用微生物研究。
　Feb.2004·44　 ·
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
第 2卷第 1期
2004年 2月
1　材料与方法
1.1　菌　种
牛肝菌(boletus sp.),本实验室分离保藏 。
1.2　培养基
1.2.1　斜面培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)
1.2.2　液体培养基
液体 PDA培养基(鲜马铃薯 200 g 切块煮沸过
滤 ,除去滤渣 ,加葡萄糖 20 g ,补充水至 1 000 mL ,其
自然 pH 即适合使用)。以液体 PDA 培养基为基础 ,
为探讨葡萄糖量及培养基初始 pH 值对发酵的影
响 ,将其中的葡萄糖量(增减量以形成浓度递度)和
培养基初始 pH(用稀酸或稀碱)进行调整 。
除PDA培养基外 ,为降低原料成本 ,考察不同
培养基成份对牛肝菌发酵的影响 ,还设计了以下四
种低成本的培养基:
a.马铃薯 5%(不过滤去渣),葡萄糖 2%;
b.马铃薯 20%(过滤),糖蜜 2%;
c.豆粕 5%,玉米粉2%;
d.豆粕5%,薯干粉 2%。
1.2.3　培养方法
(1)种子培养
将斜面菌种接入500 mL 三角瓶 ,装液量100mL ,
26 ℃125 r/min培养 3 d。
(2)摇瓶发酵培养
在100 mL 三角瓶中装入 20 mL 发酵液 ,接种量
10%,具体培养条件见图中标注。
1.3　发酵 pH 及生物量的测定
pH值由 pH计测定 。
生物量测定:取 5 mL 培养物 ,用滤纸过滤菌丝 ,
60 ℃下烘干至恒重 ,称重。
1.4　多糖测定
取 5 mL培养物加入 5 mL水后混匀 ,于4 000 r/
min ,10 min 离心沉淀菌体。取 5 mL 上清液加入
10 mL 95%(w/v)乙醇后混匀 , 4 000 r/min 10 min
离心沉淀多糖 。弃去上清液 , 将多糖沉淀定容于
50 mL容量瓶 ,用苯酚-硫酸法测定多糖量[ 7] 。
2　结果与讨论
2.1　葡萄糖质量浓度对菌体生长及多糖分泌的影响
为考察培养基中葡萄糖浓度对牛肝菌菌丝体及
多糖产量的影响 ,保持培养基中其他成份不变 ,对在
不同葡萄糖质量浓度下进行生产发酵试验(26 ℃,
125 r/min ,培养 5 d),结果见图 1。
(PDA培养基 , 26 ℃, 125 r/min , 培养 5 d)
图 1　不同葡萄糖质量浓度对多糖产量及菌体量的影响
Fig.1　Effect of glucose concentration on polysaccharides yields
and biomass
由图1可见 ,在实验条件下 ,初始时多糖产量随
着葡萄糖质量浓度的增加而上升 ,当质量浓度增加
到 60mg/mL 后 ,多糖量达到最大值。再增加葡萄糖
量时 ,多糖的产量反而下降。随着培养基中葡萄糖
质量浓度的增加 ,供菌丝体用来合成多糖的碳源更
加充足 ,多糖产量也随之增加。当葡萄糖质量浓度
高于60 mg/mL时 ,培养基中的过多的葡萄糖量不利
于菌丝产多糖 ,故多糖产量下降 。
菌体量也随着葡萄糖质量浓度增加而增加 ,达
到 60 mg/mL后 ,菌丝量的增加趋于平缓 ,此时因菌
丝量的增加 ,发酵液变得粘稠 ,实验观察到当葡萄糖
量高于 60 mg/mL时 ,发酵液产生较多量的小气泡 ,
其原因有待探讨。
实验观察到 ,该株菌在培养过程中 ,在适当的条
件下发酵液的颜色会逐渐由初始的浅黄变成悦目的
粉红至红色 ,在培养过程中 ,培养液的 pH 值逐步下
降 ,结果见表 1。
由表1可见 ,当培养基中葡萄糖质量浓度为 20
mg/mL 时 ,发酵液颜色最深(+++,红色),而在葡
萄糖浓度为 40 ～ 80 mg/mL时 ,发酵液颜色一般为粉
红色(++)。发酵液 pH 值最低时降 3.0。
2.2　发酵液初始 pH 对菌丝量的影响
一般而言 ,培养液的 pH 值关系到微生物是否
处在其适宜的酸碱性环境中 ,对菌体的正常生长与
代谢有重要的作用[ 6] ,为探讨发酵液初始 pH 值对
　2004年 2月 刘　媛等:牛肝菌液体发酵及产多糖的影响因素研究 ·45　 ·
菌丝体产量及发酵液颜色的影响 ,实验设计一系列
不同起始 pH 值的培养基 ,以观察菌体在其中的生
长情况 ,其结果见表 2和图 3。
表 1　不同葡萄糖浓度对发酵液颜色和 pH值的影响
Table 1　Effect of glucose concentration on the color and
pH of fermentation liquid
葡萄糖浓度
/(mg/mL) 10 20 40 60 80
颜色(红) + +++ ++ ++ ++
终 pH 5.5 3.5 3.0 3.0 3.5
　　注:PDA培养基 , 26 ℃, 125 r/min ,培养 5 d
表 2　不同初始 pH 对最终 pH 及发酵液颜色的影响
Table 2　Effect of start pH on color of media and
ultima pH of media
起始 pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
颜色(红) ++ ++++ +++ ++ +
最终 pH 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
(PDA培养基 , 30 ℃, 175 r/min , 培养 5 d)
图 3　不同起始 pH 对菌体量的影响
Fig.3　Effect of start pH on biomass
由表 2和图 3可见 ,在影响发酵过程的因素中 ,
pH的变化与微生物的生长和生物理积累确实有着
重要的作用 。在不同初始 pH的培养基对菌丝产量
影响很大 。在初始 pH 值为 5.5 ～ 6.0之间时 ,菌丝
体产量最大 ,而小于或大于此范围时 ,产量急剧下
降。在起始 pH值为 5.5时 ,发酵液颜色最深 ,最终
pH值为 4.0。
2.3　发酵液初始 pH对多糖量的影响
从上述实验可见 ,发酵液初始 pH 值对菌丝体产
量有较大影响 ,实验设计一系列不同起始 pH 值的培
养基 ,以考察菌体产多糖的情况 ,其结果见图4。
(培养温度 28 ℃, 培养基中葡萄糖量 20 mg/mL)
图 4　初始 pH 对多糖产量的影响
Fig.4　Effect of start pH on polysaccharides yields
由图4可见 ,初始 pH对多糖产量也有较大的影
响 。
2.4　培养基种类对多糖产量的影响
由表3可知 ,在上述四种培养基中 ,采用糖蜜培养
基多糖产量最高。5 d培养后多糖产量(1.34 mg/mL)
与相同糖含量时的普通 PDA培养基产多糖量(1.20
mg/mL)相近 ,且发酵液较为澄清 ,对于多糖提取有
利 。以价格较低的糖蜜替代价格较高的葡萄糖 ,对
降低成本有一定的意义 。
表 3　不同培养基种类对牛肝菌多糖产量的影响
Table 3　Effect of medium on polysaccharides yields
培养基种类 a b c d
多糖含量/(mg/mL) 1.16 1.34 0.93 0.65
2.5　不同的多糖提取方法的提取效果比较
多糖分胞外多糖和胞内多糖[ 5] ,对于胞外多糖可
以直接提取 ,而对胞内多糖则必须对菌丝体进行处
理 ,本实验对同一批发酵液分成等量的体积 ,分别用
以下方法分别处理(以不处理的作为对照)。 ①酶法:
在 20 mL发酵液中加入纤维素酶液 2 mL(5 IU/mL),
50 ℃水浴 3 h;②冻融法:将发酵菌液在冰箱中冷
冻 ,50 ℃水浴解冻;③研磨法:在 20 mL 发酵液中加
入碳化硅 5.5 g ,研磨 10 min;④微波处理法:将发酵
液在 Galanz600型微波炉中加热至沸腾 ,自然冷却。
各种方法的提取效果见表 4。
由表4可见 ,与对照(不处理)的样品相比较 ,用
研磨和添加酶的方法 ,可以达到破碎细胞壁 ,释放胞
内多糖的目的;与对照相比 ,酶法和研磨处理方法的
多糖提取量分别增加了 18.8%和 20%,而用冻融处
理的方法所得到的多糖略低于 (下转第65页)
　·46　 · 生物加工过程 第2卷第1期
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(上接第 46页)
对照样品 ,说明实验条件下的冻融处理对多糖的提
取作用不大 。而微波处理的样品 ,其提取过程可能
会对多糖有破坏作用 。
表 4　不同的多糖提取方法的提取效果比较
Table 4　Comparison of polysaccharides extraction effects
of different methods
处理方法 对照(不处理) 酶法 冻融 研磨
微波
(1 次)
微波
(2次)
多糖量/(mg/mL) 3.40 4.04 3.26 4.08 2.38 2.00
3　结　论
通过对牛肝菌在不同培养基中的发酵及产多糖
的研究 ,得到了适应于多糖生产的培养基成份:土豆
200mg/mL ,葡萄糖含量为 60 mg/mL ,初始 pH 为 5.5
～ 6.0。在此葡萄糖浓度和初始 pH 为6.0条件下 ,26
℃125 r/min摇瓶培养 5 d ,多糖产量为 6.7 mg/mL。
用研磨和添加酶等方法对菌丝进行破壁处理以释放
胞内多糖;与对照相比 ,酶法和研磨处理方法的多糖
提取量分别增加了 18.8%和 20%
用价格较低的糖蜜代替葡萄糖 ,增加多糖产量 ,
有利于降低成本 ,充分利用资源 。
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　2004年 2月 逄淑召等:荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescence 5963产脂肪酶条件的优化 ·65　 ·