全 文 ：食用菌学报 2007. 14(1):1～ 5
收稿日期:2006-11-01 原稿;2006-12-15 修改稿
基金项目:浙江省重点科技攻关项目“生物技术在林木共生菌菌种分离鉴定上的应用研究”(编号 2004C22032);浙
江省自然科学基金项目“牛肝菌疏水蛋白功能基因的克隆及表达基础研究”(编号:Y304403);丽水市重
点科技攻关项目“牛肝菌菌根成因仿生栽培技术研究”(编号:2001003)的部分研究内容
作者简介:李海波(1969 -), 男 , 2001 年毕业于浙江大学植物分子生理学专业 , 硕士 , 助理研究员 , 主要从事食(药)
用菌 、菌根菌资源开发利用和基因工程研究 , 已发表论文 10 余篇。
*本文通讯作者
文章编号:1005 - 9873(2007)01 - 0001 - 05
缘盖牛肝菌纯培养菌种的 RAPD和 ITS分子标记鉴定
李海波1 , 吴学谦1 , 2 * , 应国华3 , 魏海龙1 , 2 , 付立忠1 , 2 , 吴庆其1 , 2 , 许　琳1 , 柳　青2
(1浙江省林业科学研究院生物技术研究所 , 浙江杭州 310023;　2丽水市食用菌研究开发中心 ,
浙江益圣菌物发展有限公司 ,浙江丽水 323000;　3丽水市林业科学研究所 ,浙江丽水 323000)
摘　要:以浙江省庆元县的缘盖牛肝菌[ Boletus ap pendiculatus (Sehaeff:Fr .) Secretan] 子实体及其组织分
离菌种作为研究材料 ,运用 RAPD分子标记和 ITS 序列测定二种技术手段来鉴定该组织分离菌种是否为缘盖
牛肝菌的真正纯培养菌种。 RAPD 分析结果表明 ,缘盖牛肝菌子实体与其组织分离菌种在 0. 92 的 Dice相似
系数水平上聚为一类。 ITS 序列分析结果表明 , 二者的 ITS 序列在长度和碱基排列上完全一致。二种技术手
段的分析 、测定结果相互支持 , 证明缘盖牛肝菌的组织分离菌种为其真正的纯培养菌种。本研究结果同时表
明 , RAPD指纹分析结合 ITS 序列测定是鉴定外生菌根菌纯培养菌种真伪的一种高效可行的方法。
关键词:缘盖牛肝菌;鉴定;分子标记;纯培养
中图分类号:S646. 301　　　　文献标识码:A
　 　缘 盖 牛 肝 菌 [ Boletus append iculatus
(Sehaeff :Fr. ) Secretan]在浙江省又名黄靛牛肝
菌 ,属外生菌根菌 ,浙江省内主要分布在庆元县
境内 海 拔 800 ～ 1300 m 台 湾 松 (Pinus
taiwanensis)纯林或以台湾松为主的混交林内 ,
与台湾松 、赤松(P inus densi f lora)等形成外生菌
根。经中科院昆明植物研究所臧穆研究员鉴定 ,
认为缘盖牛肝菌极有可能系美味牛肝菌(B.
edul is Bull. :Fr.)的变种升格而成的一个
新种[ 1 , 2] 。
长期以来 ,外生菌根菌菌种分类鉴定主要是
根据子实体的形态解剖特征来进行的[ 3] ,但对于一
些不产生子实体或尚未找到子实体的外生菌根菌
则无法进行。此外 ,采用经典柯赫法则(Koch’ s
Postulate)对外生菌根菌纯培养菌种进行真伪鉴
定 ,回接试验的执行难度较大 。因此 ,对外生菌根
菌及其纯培养物的分类鉴定需借助现代分子生物
学的技术手段 ,即开展 DNA 亲菌鉴定。本文对采
自浙江省庆元县的外生菌根菌缘盖牛肝菌子实体
及其组织分离菌种的基因组 DNA 进行 RAPD
(Random Amplified Polymo rphic DNA)指纹图谱分
析和 ITS(Internal Transcribed Spacer)区域碱基序
列分析来鉴定该组织分离菌株是否为缘盖牛肝菌
的真正纯培养菌种。
1　材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试子实体和组织分离菌种
供试的缘盖牛肝菌子实体采自浙江省庆元县
举水乡银屏山 ,分离菌种为当日采集缘盖牛肝菌子
实体的组织分离培养物。组织分离和培养采用
MMN培养基[葡萄糖 10 g ,麦芽浸出粉 3 g ,蛋白
胨 10 g , 牛 肉 膏 5 g , 1% FeCl3 1. 2 mL ,
MgSO 4 7H 2O 0. 15 g , KH2 PO4 0. 50 g , (NH4)2
HPO40. 25 g ,CaCl2 2H2O 0. 05 g ,NaCl 0. 025 g ,硫
胺素10 mg ,琼脂 20 g ,水 1000 mL] [ 4] ,子实体组
织分离培养物 28 ℃恒温培养 40 d 。
1. 1. 2 主要试剂和引物
PCR扩增所用试剂 、DNA 纯化试剂盒和
DNA 凝胶回收试剂盒均购自杭州博日科技有限
DOI牶牨牥牣牨牰牬牳牳牤j牣cnki牣牨牥牥牭牠牴牳牱牫牣牪牥牥牱牣牥牨牣牥牥牨
食　用　菌　学　报 第 14 卷
公司 。RA PD分析所用的 10碱基 S 系列随机引
物和 rDNA ITS 分析所用的 ITS5 / ITS4引物[ 5] 购
自上海生工公司 。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 的提取及检测
子实体的菌盖部分(含菌褶)用来提取基因组
DNA ;组织分离菌种先从 MMN 培养基试管斜面
转接到 MMN 培养基平皿培养 ,待菌丝长满平皿
后 ,刮取平皿上的菌丝体来提取基因组 DNA 。基
因组 DNA的提取参照 SDS-CTAB 法[ 6] ,并使用杭
州博日公司的DNA纯化试剂盒对提取的 DNA 进
行纯化。纯化的基因组 DNA 先用 1. 5%的琼脂糖
凝胶电泳定性检测 ,再用 DNA /RNA紫外分光光
度计(GeneQuant Pro ,英国GE Healthcare公司)定
量检测。
1. 2. 2 RA PD-PCR扩增
RAPD-PCR的扩增体系为:10×PCR Buffer
2 μL , 10 mmol /L dN TPs 2 μL , 25 mmo l /L
MgCl2 2 μL , 5 U /μL Taq DNA 酶 0. 3 μL ,
0. 2 μmo l/L随机引物 3 μL ,17 ng /μL 模板 DNA
3μL ,ddH2O 7. 7 μL ,反应总体积为 20 μL 。扩
增反应在杭州博日公司的 TC-XP 型扩增仪上进
行。94 ℃预变性 6 min;92 ℃变性 40 s ,38 ℃退
火 40 s , 72 ℃延伸 2 min ,共 30 个循环;最后
72 ℃补平 7 min ,终止温度为 4 ℃。以缘盖牛肝
菌子实体 DNA作为模板 ,使用随机挑选的 65个
随机引物进行 RAPD分析 ,从中筛选 24个对供
试材料 DNA 能进行有效扩增且稳定性较好的随
机引物(表 1)用于进一步分析。
表 1　24 个供试随机引物编号及核苷酸序列(5′→3′)
Table 1　Nucleotide sequences of the random primers used for RAPD
编号
P rimer
核苷酸序列
Nucleo tide
sequence
编号
P rime r
核苷酸序列
Nucleotide
sequence
编号
Primer
核苷酸序列
Nucleo tide
sequence
编号
P rimer
核苷酸序列
Nucleo tide
sequence
S26 GGTCCCTGAC S1008 TTCCCGTGCC S1313 CTACGATGCC S1378 CCGACGT TGA
S42 GGACCCAACC S1009 AGAACCGAGG S1317 TGCTGCTGCC S1380 CATCACCCCT
S43 GTCGCCGTCA S1010 GGGATGACCA S1321 GTGTGCCGTT S1392 GGACCTCTTG
S102 TCGGACGTGA S1014 TGTGGCCGAA S1327 ACGCGACAGA S1396 GGAACCCACA
S108 GAAACACCCC S1016 CAAGGTGGGT S1345 TCGCTGCGTT S1397 GAGCCCGAC T
S1001 TCCGCAACCA S1310 GGTGTTTGCC S1346 CTGTCTGTGG S2032 TTCGGCCGAC
1. 2. 3 ITS-PCR扩增
ITS-PCR的扩增体系为:10 ×PCR Buffer
2. 5 μL , 10 mmol /L dNT Ps 2 μL , 25 mmo l /L
MgCl2 2 μL , 5 U /μL Taq DNA 酶 0. 3 μL ,
10 μmol /L ITS5 /I TS4引物各 1 μL , 17 ng /μL 模
板 DNA 3 μL , ddH2O 14. 2 μL ,反应总体积为
25 μL。扩增反应在杭州博日公司的 TC-XP 型
扩增仪上进行 , 94 ℃预变性 1 min;92 ℃变性
15 s ,61 ℃退火 15 s ,72 ℃延伸 1 min ,共 30个循
环;最后 72 ℃补平 5 min ,终止温度为 4 ℃。
1. 2. 4 PCR扩增产物的测定
采用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测 RA PD-
PCR和 ITS-PCR扩增产物 ,采用上海培清科技
有限公司的 JS-380A 自动凝胶图像分析仪摄取
扩增图谱 , 采用 Quantity One 1-D Analysis
S of tw are(Version 4. 4 ,美国 Bio-Rad公司)估算
扩增产物中的片段长度。
1. 2. 5 ITS 片段的回收 、克隆和测序
采用杭州博日公司的 DNA 凝胶回收试剂盒
从 1. 5%的琼脂糖凝胶中回收 I TS 片段 , 并用
DNA /RNA紫外分光光度计检测浓度。回收产
物用大连宝生物工程公司的 pMD-18T Vecto r连
接 ,转化于大肠杆菌 E. col i(DH5α)菌株感受态
细胞 ,经蓝白斑筛选和 PCR鉴定后 ,每个样品随
机挑选 3 个阳性克隆交付大连宝生物工程公司
完成测序 。
1. 3 统计分析
　　将子实体与分离菌种的 RAPD-PCR图谱中
分子量不同的 DNA 条带作为多态性状 ,有性状
记为 1 , 无性状记为 0 , 转换为数字矩阵 。用
NTSYSpc2. 10e 版软 件 包 (Exeter Sof tw are ,
Se tauket , NY ,USA)中的 Simqual程序计算子实
体与分离菌种间的 Dice 相似系数 ,U PGMA 法聚
类分析 ,构建亲缘关系树状图 。
2
第 1 期 李海波 ,等:缘盖牛肝菌纯培养菌种的 RAPD和 ITS 分子标记鉴定
2　结果与分析
2. 1 子实体及其组织分离菌种的 RAPD多态性
分析
　　用筛选出的 24个随机引物对缘盖牛肝菌子
实体及其组织分离菌种的基因组 DNA 进行
RAPD多态性分析 。图 1 所显示的其中 8 个引
物的扩增结果可以看出 , 不同的引物扩增的
DNA 片段数目(介于 1 ～ 21 条 ,一般为 5 ～ 15
条)、DNA 片段长度(0. 2 ～ 3. 1 kb)均存在明显的
差异 。但同一引物的 2 个供试材料扩增图谱极
其相近 ,除个别主带存在多态性外 ,绝大多数条
带无多态性 。另外 16个引物也扩增出了与图 1
相近的结果。依据 24个随机引物扩增所产生的
条带对缘盖牛肝菌子实体及其组织分离菌种进
行遗传相似性分析 ,构建亲缘关系树状图。
图 1　RAPD-PCR图谱
Fig. 1　RAPD amplif ication patterns of DNA extracted from B. appendiculatus fruit bodies
and fungal mycelium isolated from fruit body tissue
M. 100bp DNA ladder , fb. 缘盖牛肝菌子实体 , mb. 缘盖牛肝菌子实体组织分离菌种
M. 100bp DNA Ladder , fb. B. appendiculatus f ruit body , mb. I so lated fungal mycelium
2. 2 遗传相似系数的估算和聚类分析
　　亲缘关系树状图(图 2)显示 ,缘盖牛肝菌子
实体(fb)及其分离菌种(mb)在 0. 92 的 Dice 相
似系数水平上聚为一类 ,根据相似系数在 0. 7以
上的菌株为同种的观点[ 7] ,可以判定在本研究中
的组织分离培养物为缘盖牛肝菌纯培养菌种 。
图 2　供试菌株间 Dice系数 UPGMA 聚类法产生的聚类图
Fig. 2　Dendrogram resulting from UPGMA cluster analysis based on Dice coef ficient
fb. 缘盖牛肝菌子实体 , mb. 缘盖牛肝菌子实体组织分离菌种
fb. B. appendiculatus f ruit body , mb. Iso la ted fungal mycelium
2. 3 供试子实体及其分离菌种的 ITS分析
　　通过对缘盖牛肝菌子实体及其组织分离菌
种的 3个 I TS 区段阳性单克隆测序结果进行修
正分析 ,得出二者的 ITS 序列(图 3)。由图 3可
见 ,缘盖牛肝菌与其组织分离菌种的 ITS 序列不
仅长度皆为 810 bp ,而且碱基排列完全一致 ,这
一结果再次表明该组织分离培养物为缘盖牛肝
菌纯培养菌种 。
2. 4 ITS区段的同源性检索
　　将缘盖牛肝菌子实体及其组织分离菌种的
ITS序列与 GenBank核酸序列数据库进行序列
相似性检索(BLAST) ,结果表明 ,二者皆与采自
云南的华美牛肝菌(Boletus speciosus)菌株分离
物的 ITS序列(DQ407253)相似程度最高 ,其最
3
食　用　菌　学　报 第 14 卷
高分值为 1330 ,最高相似率为 99%;未检索到
与本试验提交的 ITS序列具有一定相似率的美
味牛肝菌(Boletus edul is)ITS 序列 。这一结果
提示 ,缘盖牛肝菌很可能是华美牛肝菌的一个
变种 。本项目组多次野外考察亦发现 ,缘盖牛
肝菌与华美牛肝菌的子实体形态特征极为相
似 ,二者间的最大差异是华美牛肝菌菌肉受伤
后立即变青兰色 。
　　fb 1 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGT TTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC AT TATCGAAT　　mb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61 TCTGAGGGGG GGGGAAGATG GAGGAGTGAA GACTGTCGCT GGCCCCATCT CTGGGTGGAG
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
121 CA TGTGCACG TCTT CCT TT T CG TCGACCCC CT T TCTCACA CACAACACAC ACCTGTGCAC
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
181 CTAT TGT AGG TCCTCGGAAG AGGATCTATG T T TT TCACA T CACACACCA T CG TATGT CTA
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
241 TAGAATGTAT TGAAGACCGT CCGGGATGGA TGG TCAATAA T ATT AAA TCA TACAACTTTC
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
301 AGCAACGGAT CTCTTGGCTC TCGCATCGAT GAAGAACGCA GCGA AT TGCG ATAAG TAATG
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
361 TGAAT TGCAG AT TT TCAGTG AATCATCGAA TCT TTGAACG CACCTTGCGC TCCTTGGTAT
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
421 TCCGAGGAGC ATGCCTG T TT GAGTG TCAT T TGAA TT TCTC AAACCCCA TG TCTT TT T TAG
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
481 AGCATGAGCT TTGGAGTTGG GGGCTGCTGG CGGCGAAAAG CCGTCGGCT C TCCTGAAATG
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
541 CA TT AGCAAA GGA TGGGGCA AGT CT TTGAC GTGCATGGCC T TCGACGTGA TAATGAT CG T
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
601 CGTGGCT AGG AGCG TCGGAC ATGCATGAAT CTG TCTG TGC TGCTT CTAA T CCCCTAGGCT
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
661 AGCCT CGGCT TGGTCACT TT TAACTACTAG T TGGTCGTGA GGCTGACGAA CG TTGAGT TG
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
721 GGCTGAGCAA GGCTT TTG TC TCT AT TCGAA ACT TGACCT C AAAT CAGG TA GGACT ACCCG
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
781 CTGAACT TAA GCA TA TCAAT AAGCGGAGGA 810
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
图 3　供试菌株间 Dice系数 UPGMA 聚类法产生的聚类图
Fig. 3　Dendrogram resulting from UPGMA cluster analysis based on Dice coef ficient
fb. 缘盖牛肝菌子实体 , mb. 缘盖牛肝菌子实体组织分离菌种
fb. B. appendiculatus f ruit body , mb. Iso la ted fungal mycelium
3　讨论
　　真菌个体不同组织的 DNA 应该是均一的 ,
子实体组织与其组织分离物是一个无性克隆系
的二种不同存在形态 , 应该具有完全相同的
DNA 组成。这是本研究利用 DNA 分子标记对
缘盖牛肝菌子实体组织分离物进行“亲菌鉴定”
的理论基础。
根据 RA PD指纹图谱比较分析 ,本研究得出
缘盖牛肝菌子实体与其组织分离菌种的相似系
数为 0. 92;贺冬梅等[ 8] 利用 RA PD研究香菇不同
部位子实体组织分离物与菌丝体的遗传相关性 ,
得出相似系数分别为 0. 882和 0. 971 ,相似系数
均未达到理论上的 1. 0 水平 。这表明 ,尽管组织
分离是一种无性繁殖技术 ,遗传变异小 ,但在无
性繁殖过程中可能产生某些自然变异和突变 。
此外 ,尽管 RAPD标记具有经济 、快捷 、操作简单
等优点 ,但 RAPD同时具有重复性和稳定性差的
缺陷 ,也可能造成在扩增条带判读上出现一定的
偏差 ,进而导致相似系数偏低 。
真菌的 rDNA 的 I TS 区段的保守性基本上
表现为种内相对一致 ,种间差异比较明显 ,这一
特点使 ITS 不仅适合于属内物种间或种内差异
较明显的菌群间的系统发育关系分析 ,而且非常
适合于真菌物种的分子鉴定。特别是对于一些
目前尚无法人工栽培的外生菌根菌子实体组织
分离菌种是否为纯培养菌种的分子鉴定 , ITS 的
应用优势尤为突出 。根据文献报道 , ITS 已成功
4
第 1 期 李海波 ,等:缘盖牛肝菌纯培养菌种的 RAPD和 ITS 分子标记鉴定
应用于对致命鹅膏菌(Amanita exi tialis)[ 9] 、正
红菇 (Russula v inos)[ 10] 、松乳菇 (Lactarius
deliciosus)[ 11] 和乳牛肝菌(S ui l lus bovinus)[ 12] 等
纯培养菌种的鉴定。为了进一步验证 RAPD指
纹分析的鉴定结果 ,本研究又对供试材料进行了
ITS序列的比较分析 ,分析结果支持了 RAPD指
纹分析的结论 ,表明 , RAPD 指纹分析结合 ITS
序列分析可准确鉴定牛肝菌类等外生菌根菌的
纯培养菌种。
目前 ITS 序列在菌种界定上的应用 ,主要是
在传统形态学鉴别的基础上为种的分类鉴定提
供进一步的分子依据 。LANDEWEERT [ 13] 等在
对土层中分布的外生菌根菌群落进行分子鉴定
的研究中提出 ,通过 ITS 区域序列比对 ,序列相
似性 ≥ 99%, 可 以 鉴 别 为 相 同 种 。 而
TA YLOR
[ 14] 等提出了基于 ITS 序列构建系统树
的 GCPS (Genealogical Concordance Phy lo-
genet ic Species Recognition)法来鉴定种。尽管
缘盖牛肝菌与华美牛肝菌的子实体形态特征极
为相似 ,且 BLAS T 检索结果显示二者 ITS 序列
的最高相似率为 99%,但准确鉴定二者间的种属
关系尚有待进一步研究。
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[本文编辑] 　于荣利
5