全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod ResDev 2006 , 18:643-646
文章编号:1001-6880(2006)04-0643-04
　
　
　收稿日期:2005-11-04　　　接受日期:2005-12-19
　基金项目:河北省自然科学基金项目(303470)
＊通讯作者 Tel:86-311-86266335;E-mail:xykf@hebmu.edu.cn
欧亚旋覆花总黄酮提取与富集工艺研究
耿红梅 ,张嫡群＊ ,王云志 ,祁金龙 ,杨双革
(河北医科大学新药开发研究室 ,石家庄 050017)
摘　要:为研究欧亚旋覆花总黄酮的最佳提取与大孔吸附树脂富集工艺 , 采用不同溶剂 、多种提取方法 、L9(34)
正交实验优化及AB-8 大孔吸附树脂富集 , 结果表明其最佳提取工艺为用 10倍量水为溶剂回流提取3 次 ,每次 1
h ,再结合 AB-8 大孔吸附树脂富集 ,以 70%乙醇洗脱效果最佳 , 总黄酮回收率达 90%, 总黄酮含量达 50%以上。
此工艺简便可行 ,符合工业化生产要求 。
关键词:欧亚旋覆花;总黄酮;大孔树脂;正交设计
中图分类号:R284.2 文献标识码:A
Extraction and Enrichment of Total Flavonoids in Inula britannica L.
GENG Hong-mei ,ZHANG Di-qun＊ ,WANG Yun-zhi ,QI Jin-long ,YANG Shuang-ge
(Development Department of NewDrugs of Hebei Medical University , Shijiazhuang 050017 , China)
Abstract:The process of extracting total flavonoids from Inula britannica L.and of enriching them with macroporous resins was
studied.The extraction process was optimized by orthogonal design.The total flavonoids were enriched by AB-8 macroporous
resins.The results indicated that the optimum process was to extract 3 times(each one hour)at reflux with 10:1 water:materials
and the total flavonoids were enriched with AB-8 macroporous resins and eluted by 70% ethanol.The recovery rate of total
flavonoids was above 90%.The extraction procedure was applicable to industrial production.
Key words:Inula britannica L.;total flavonoid;macroporous resin;orthogonal design
　　欧亚旋覆花(Inula britannica L.)为菊科植物欧
亚旋覆花的干燥头状花序 ,是一种传统的中草药 ,具
有降气 、消痰 、行水 、止咳的功效 ,收载于中华人民共
和国药典(2005 版)[ 1] 。欧亚旋覆花的化学成分主
要有黄酮类[ 2 , 3] 、倍半萜内酯和萜类化合物[ 4] 。黄
酮类化合物具有多种生物活性 ,是当今众多学者研
究的热点之一。据报道欧亚旋覆花的抗氧化活性与
其含有的黄酮有关[ 5] 。目前未见有关欧亚旋覆花总
黄酮提取工艺的研究报道 ,本文以总黄酮含量为指
标 ,研究欧亚旋覆花总黄酮的最佳提取与纯化工艺 。
1　实验材料
欧亚旋覆花采购于山西运城地区 ,经河北医科
大学药学院生药教研室聂风礻是教授鉴定为菊科植
物欧亚旋覆花(Inula britannica L.)。芦丁对照品购
自中国药品生物制品检定所(批号 0080-9504 ),AB-
8树脂(天津市光复精细化工研究所),其它试剂均
为分析纯。
2　方法与结果
2.1　提取工艺的研究
2.1.1　总黄酮含量测定方法
标准曲线的制备:精密称取芦丁对照品 10 mg ,
置 50 mL 量瓶中 ,加入75%乙醇溶解并稀释至刻度 ,
摇匀。作为储备液备用 。精密量取芦丁对照品储备
液 0.0 、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0 mL ,置 10 mL 量瓶中 ,
分别加蒸馏水至 5 mL ,各精密加入 5%NaNO2溶液
0.3 mL ,摇匀 ,放置 6 min;加入 10%Al(NO3)3 溶液
0.3 mL ,摇匀 ,放置 6 min;加入 10%NaOH 溶液 4.0
mL ,再加水至刻度 , 摇匀 , 放置 15 min 。以储备液
0.0 mL的标准溶液做空白 ,在 510 nm 的波长处测定
吸收度 ,以吸收度值为纵坐标 、以溶液浓度为横坐
标 ,绘制标准曲线 ,得回归方程为:Y =12.1845X -
0.0003(R=0.9999),芦丁在 10.3 ～ 51.5 μg/mL 范
围内线性关系良好 。
样品溶液浓度测定:以下所得供试品溶液均精
密量取 1 mL置 10 mL量瓶中 ,按 2.1.1项下法测定
吸收度 ,代入回归方程计算总黄酮含量。
2.1.2　提取溶剂的选择
取欧亚旋覆花适量 ,粉碎成细粉 ,精密称取约
2.5 g , 8 份 ,置 500 mL 圆底烧瓶中 , 分别加 95%、
60%、30%乙醇和蒸馏水400mL 各2份 ,回流2 h ,过
滤 ,用水洗涤并定容至500 mL量瓶中 ,摇匀 ,测定总
黄酮的含量。结果见表 1。
表 1　不同提取溶剂提取总黄酮含量的测定结果(n =3)
Table 1　Determination of total flavonoids from different solvents(n
=3)
提取溶剂
Extract solvent
含量(%)
Content
平均值(%)
Average
95%乙醇(95% Ethanol) 6.57
6.59 6.58
60%乙醇(60% Ethanol) 7.68
7.59 7.63
30%乙醇(30% Ethanol) 8.60
8.48 8.54
水(Water) 8.72
8.88 8.80
　　总黄酮含量的测定结果表明 ,以水为溶剂提取
效果较佳 ,提取完全 ,而且成本低 ,安全无毒 ,操作方
便 ,适合工业化生产 ,所以我们选用水为提取溶剂 。
2.1.3　总黄酮提取方法的比较
取欧亚旋覆花适量 ,粉碎成细粉 ,精密称取 2.5
g ,9份 ,分别用超声提取法 、回流提取法及索氏提取
法提取。
表 2　不同提取方法的总黄酮含量测定结果(n =3)
Table 2 　Determination of total flavonoids from different extract
way s(n=3)
提取方法
Extract method
含量(%)
Content
平均值(%)
Average
超声法(Ultrasonic waves) 3.51
3.46 3.46
3.40
回流法(Reflux) 8.11
7.98 8.07
8.13
索氏提取法(Apparatus) 8.12
7.89 8.02
8.05
　　超声提取:取欧亚旋覆花细粉三份 ,分别置 500
mL 圆底烧瓶中 ,精密加水 400 mL ,密塞 ,称定重量 ,
超声处理 60 min ,放冷至室温 ,再称定重量 ,用水补
足减失的重量 ,滤过 ,用水洗涤并定容至 500 mL 量
瓶中 ,摇匀 ,测定总黄酮的含量。
回流提取:同超声提取法 ,加蒸馏水 400 mL ,回
流 2 h ,过滤 ,用水洗涤并定容至 500 mL 量瓶中 ,摇
匀 ,测定总黄酮的含量 。
索氏提取:同法 ,取精密称定的欧亚旋覆花细
粉 ,分别置索氏提取器中 ,加蒸馏水 400 mL ,提取至
无色 ,过滤 ,用水洗涤并定容至 500 mL 量瓶中 ,摇
匀 ,测定总黄酮的含量 。结果见表2 。
　　提取结果表明:回流提取的方法最好 ,提取含量
高 ,耗时不太长;超声提取法虽然简单省时 ,但提取
效率较低 ,提取不完全;索氏提取法与回流法提取含
量相近 ,提取比较完全 ,但时间太长 ,因此本文选定
回流法提取 。
2.2　正交试验与结果[ 6]
2.2.1　因素及水平设计
选择提取次数 、提取时间和提取加水量 3个因
素 ,每个因素选择 3个水平 ,进行试验 ,考察对总黄
酮提取的影响 ,因素水平表见表 3。
表3　欧亚旋覆花总黄酮提取工艺因素水平表
Table 3　Factors and levels of technics on extracting total flavonoids
from Inula Britannica L.
因素水平
Factors and
levels
A提取次数
Extract times
(order)
B提取时间
Extract t ime
(h)
C溶剂用量
Volume
(times)
1 1 1 10
2 2 2 15
3 3 3 20
表 4　欧亚旋覆花水提工艺正交设计表及试验结果
Table 4　Arrangments and results of test of extractive techniques of
Inula britannica L.by water
试验号
Number
A B C D
总黄酮含量(%)
(Content of total f lavonoid)
1 1 1 1 1 9.43
2 1 2 2 2 7.96
3 1 3 3 3 7.27
4 2 1 2 3 10.66
5 2 2 3 1 9.96
6 2 3 1 2 9.34
7 3 1 3 2 10.90
8 3 2 1 3 10.88
9 3 3 2 1 10.53
I 24.66 30.99 29.65 29.92
II 29.96 28.80 29.15 28.20
III 32.31 27.14 28.13 28.81
R 7.65 3.85 1.52 1.72
644 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.18
2.2.2　试验与结果
以总黄酮提取量为指标 ,选择 L9(34)正交设计
表对水提工艺参数进行筛选研究 ,测定欧亚旋覆花
总黄酮含量 ,每次试验药材量 50 g 。结果见表 4 ,方
差分析见表5。
　　结果分析 :由表 4 的 R值可知 ,A 、B 、C 三个因
素对欧亚旋覆花总黄酮提取的影响程度不同 ,各因
素的影响顺序为A>B>C ,其中 A 因素为影响欧亚
旋覆花提取的主要因素 , B 、C 为从欧亚旋覆花中提
取总黄酮的非主要因素 , 最终确定其提取工艺为:
A3B1C1 ,即欧亚旋覆花用 10 倍量水提取 3 次 ,提取
时间为 1 h。表 5的方差分析表明提取次数对提取
工艺有显著性影响 ,而提取时间和加水量对提取工
艺没有显著性影响 。
表 5　方差分析
Table 5　Analysis of variance
方差来源
Source
离差平方和
Sum of
deviation square
自由度
Degree of f reedom
方差
Variance
F值
F Value
P
显著性
Significance
A 10.2372201 2 5.11861006 20.19 0.0472 <0.05显著
B 2.48602206 2 1.24301103 4.90 0.1694 -
C 0.400089306 2 0.200044653 0.79 0.5589 -
D 0.506955709 2 0.253477854 - - -
2.3　验证实验
为考察上述优选提取工艺的稳定性 ,按该工艺
条件进行重复性试验 3次 ,分别测定欧亚旋覆花总
黄酮的含量 , 结果欧亚旋覆花总黄酮含量为
10.92%、10.88%、10.95%,均优于正交试验表中的
任何一组 ,说明该工艺稳定可行。
2.4　AB-8树脂纯化欧亚旋覆花总黄酮的研究[ 7-10]
2.4.1　上柱液制备
将上述提取液用石油醚脱脂 ,再用正丁醇萃取
4次 ,将所得萃取物浓缩成膏 ,加适量水 ,超声处理
使其混悬 ,过滤 ,滤液为样品液上处理好的大孔树脂
柱。测定总黄酮含量方法同上 。
2.4.2　纯化方法的选择
树脂的筛选:通过对七种大孔树脂的静态和动
态吸附实验 ,结果表明AB-8树脂有较大的吸附量和
较高的解吸率 ,最后确定 AB-8树脂为纯化分离欧亚
旋覆花总黄酮的最佳树脂 。
树脂的预处理:树脂以 95%乙醇浸泡处理后 ,
湿法装柱 ,用 95%乙醇在柱上流动清洗 ,不时检查
流出的乙醇液 ,至乙醇液与水混合(1∶5)不呈白色浑
浊为止 ,然后以大量蒸馏水洗至无醇味 ,备用 。
上样浓度的选择:将不同浓度的欧亚旋覆花样
品液分别通过 AB-8树脂柱 ,在 2 mL/min流速下上
样 ,进行动态吸附。用盐酸镁粉反应检查流出液 ,计
算总黄酮吸附量(总黄酮吸附量为单位树脂湿体积
吸附总黄酮量 ,单位 mg/mL)。结果见表 6。从表 6
可知 ,上样浓度以 20 mg/mL为宜。
表 6　上样浓度的确定
Table 6　Selection of sample s concentration
上样浓度(mg/mL)
Concent ration of sample
总黄酮吸附量(mg/mL)
Adsorption quantity of tatol flavonoids
10 6.21
20 9.42
30 8.89
40 9.14
表 7　洗脱剂的选择
Table 7　Selection of eluting solvent
洗脱剂
Eluting solvent
洗脱剂用量
Volume
(mL)
醇洗物膏重
Weight
(mg)
总黄酮回收
率 Recovery rate
(%)
醇洗物总
黄酮含量
Content
of total
flavonoid(%)
30%乙醇
(30% Ethanol) 300 335 51.68 54.43
50%乙醇
(50% Ethanol) 200 392 89.75 52.04
70%乙醇
(70% Ethanol) 200 383 92.80 55.72
95%乙醇
(95% Ethanol) 120 176 79.88 37.03
　　洗脱溶剂选择:按上述所确定的上样浓度 20
mg/mL ,取样品液分别通过 4根 AB-8树脂柱 ,进行
动态吸附 。4根树脂柱先分别用水洗脱至洗脱液无
色 ,再分别用 30%、50%、70%、95%乙醇洗脱 。将乙
醇洗脱液分别蒸干 ,称重 ,测定总黄酮含量 ,计算总
645Vol.18 耿红梅等:欧亚旋覆花总黄酮提取与富集工艺研究 　
黄酮回收率 ,结果见表 7。由表 8可知 ,70%乙醇洗
脱总黄酮的回收率和总黄酮含量均较高 , 故确定
70%乙醇为最佳洗脱溶媒。
　　吸附及洗脱流速的选择:分别以 1 、2 、3 mL/min
的流速上样 ,收集过柱液 10 mL 蒸干 ,用 1 mL 乙醇
溶解 ,盐酸镁粉反应检查泄漏 ,发现当流速 3 mL/
min时有产生吸附不好而出现泄漏现象 ,故确定上
样流速为 2 mL/min。按上述所确定的上样浓度 20
mg/mL ,以 70%乙醇为洗脱剂 ,分别以 1 、2 、3 mL/min
的速度进行洗脱 , 分别计算总黄酮的回收率 , 为
70.12%、70.01%、62.80%, 故确定洗脱速度为 2
mL/min。
3　讨论
通过正交试验法对欧亚旋覆花的提取工艺条件
进行了优化 ,结果证明欧亚旋覆花总黄酮提取的最
佳提取条件是用 10倍量水做溶剂回流提取 3次 ,每
次1 h ,总黄酮的含量为 10.88%;同时用 AB-8树脂
对欧亚旋覆花总黄酮进行纯化 ,其吸附的工艺条件
为:提取物上样浓度为 20 mg/mL ,最大吸附量(单位
树脂湿体积吸附总黄酮量)为 9.42 mg/mL ,洗脱剂
为70%乙醇 ,洗脱速度为 2 mL/min。我们按此条件
进行了验证 ,用 AB-8树脂吸附分离欧亚旋覆花中总
黄酮 ,其总黄酮含量达 50%以上 ,且总黄酮回收率
达90%以上。可见AB-8树脂对欧亚旋覆花总黄酮
有良好的纯化分离作用 ,用AB-8大孔树脂富集欧亚
旋覆花总黄酮 ,工艺稳定 ,方法可行 。
将欧亚旋覆花水提液通过大孔吸附树脂 ,欧亚
旋覆花总黄酮被吸附 ,而大量水溶性杂质如糖类 、蛋
白质等随水流出 ,解决了欧亚旋覆花总黄酮和水溶
性杂质不易分离的难题 ,可用于工业化生产。
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