全 文 ：20 卷 3 期
2004 年 5月
生　物　工　程　学　报
ChineseJournal of Biotechnology
Vol.20 　No.3
May　2004
　
收稿日期:2003_10_27 ,修回日期:2003_12_25。
基金项目:国家自然科学基金资助(No.39970896)。
＊通讯作者。 　Tel:86_10_62591431 ext 6201;　Fax:86_10_62590833;　E_mai l:zhaodx@ns.ibcas.ac.cn
新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立
付春祥　金治平　杨　睿　吴风燕　赵德修＊
(中国科学院植物研究所 , 北京 100093)
摘　要　利用发根农杆菌 R1601、R1000、LBA9402 感染新疆雪莲的叶片 、叶柄和根段外植体 , 诱导产生毛状根。毛
状根接种量为 2.8 g L(FW)时 , 20d 生长量可达66.7 g L, 黄酮含量达到干重的 10.23%。冠瘿碱的检测和 rol B基因
的PCR分析表明 , Ri质粒中的 T_DNA片段已经整合到毛状根细胞的基因组中。预培养时间 、外植体类型以及发根
农杆菌的菌株属性对毛状根诱导有着重要的影响。其中预培养 2 d 的新疆雪莲根段外植体 , 经过 R1601 感染后 ,毛
状根的诱导率可达 100%。诱导产生的毛状根在附加生长素的液体培养基中 ,有少量愈伤组织产生。由毛状根再
生的植株与雪莲外植体再生的植株在形态上无明显区别 , 但前者的黄酮含量仅为后者的 53%。
关键词　新疆雪莲 、发根农杆菌 、毛状根 、黄酮
中图分类号　Q813　　文献标识码　A　　文章编号 1000-3061(2004)03-0366-06
　　新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)别名
雪荷花 , 为菊科(Compositae)凤毛菊属(Saussurea
DC.)多年生草本植物。民间常用来治疗风湿性关
节炎 、妇女小腹冷痛 、闭经 、胎衣不下 、麻疹不透 、肺
寒咳嗽和高山不适应症等[ 1] 。新疆雪莲的主要成分
为黄酮类化合物 ,其中 Hispidulin 和 Jaceosidin对腹
水型肝癌和S180癌细胞的 DNA合成有明显抑制作
用[ 2] 。然而新疆雪莲生长环境恶劣 ,人工栽培相对
困难 ,加上近几年来的过度采挖 ,野生资源正面临灭
绝的危险 。
利用毛状根培养技术生产新疆雪莲中的黄酮类
物质 ,是一条经济有效的途径 。毛状根培养系统不
但具有生长迅速 、次生代谢物质合成能力强的优点 ,
而且生产能力稳定 、不需外源激素 ,利于天然药物的
开发和利用[ 3] 。因此利用发根农杆菌(Agrobacterium
rhizogenes)侵染雪莲细胞产生毛状根 ,并对毛状根进
行离体培养 ,是雪莲药用资源可持续发展的有效途
径。到目前为止 ,关于新疆雪莲的研究仅局限于药
用价值 、人工栽培与组培苗的快繁三个方面 ,而涉及
毛状根培养方面的研究未见报道。
本文在新疆雪莲组培苗研究的基础上 ,成功建
立起毛状根离体培养系统 ,初步筛选出三个高产的
毛状根系 ,为新疆雪莲毛状根的大规模培养和产业
化开发奠定了基础。通过适当比例的激素诱导 ,获
得再生植株。对其中的黄酮含量进行检测和比较 ,
提供了 T_DNA对植物次生代谢物质合成影响的证
据。
1　材料与方法
1.1　菌株及植物材料
农杆碱型发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)
菌株 R1601由北京大学林忠平教授惠赠 , R1000 和
LBA9402由清华大学郭志刚教授惠赠 。新疆雪莲
(S .involucrata )全草采自新疆天山博格达峰 ,由中
科院植物研究所陈艺林教授鉴定 。
1.2　方法
1.2.1　农杆菌的活化:从-70℃取出保存菌种 ,划
线接种于 YEB固体培养基上(R1601的培养基中添
加 100mg L 卡那霉素), 28℃培养 ,活化 2次 。挑取
单菌落 ,接种于附加 50μmol L 乙酰丁香酮 、200mg L
脯氨酸的 YEB 液体培养基中 , 28℃振荡(180r min)
培养过夜(OD =0.8)。使用前用 MS液体培养基稀
释 8倍 。
1.2.2　新疆雪莲无菌苗的获得:选取饱满种子流水
冲洗 8h , 70%乙醇浸泡 20s ,无菌水冲洗 2次 ,0.1%
HgC12浸泡 25min ,无菌水洗涤 6次 ,接种于无激素
DOI :10.13345/j.c jb.2004.03.011
MS培养基 ,25℃、连续光照条件培养 。7d 后 ,种子
陆续萌发 。分别切取 2 ～ 3d 苗的子叶 、胚根 、胚轴 ,
接种于附加2.0mg L BA和0.1mg L NAA的MS培养
基上 , 诱导丛生芽 。切取丛生芽接种于附加 2.0
mg L IAA的MS培养基上 ,诱导生根。
1.3　毛状根的诱导
切取 10 ～ 15d 再生苗叶片 、叶柄及根段为外植
体 ,置于 N6 无激素固体培养基上进行预培养 。将
预培养好的上述外植体在制备好的发根农杆菌菌液
中侵染5min ,取出并吸干多余菌液 ,放回原培养基 。
连续光照下共培养 2 ～ 3d ,直到外植体周围出现明
显菌斑 ,转接于附加 500 mg L 头孢噻肟钠的 N6固
体培养基上 ,于 25℃暗培养除菌并诱导发根 。待毛
状根长至 2 ～ 3cm 时 ,切下转接于附加 500 mg L 头
孢噻肟钠的 N6液体培养基中 ,39℃振荡(100r min)
除菌 48h[ 4] 。切取除菌完全的 3 ～ 4cm 长的根尖 ,转
接于无激素 N6液体培养基中 ,25℃、110r min暗培
养。
1.4　毛状根再生苗的获得
切取长 2 ～ 3cm 的毛状根根尖 , 接种于附加
0.5mg L IBA的N6液体培养基 ,诱导产生愈伤组织 。
切取部分愈伤组织 ,转接于附加1mg L BA+0.1mg L
NAA的MS 固体培养基上 ,诱导产生丛生芽 。切取
丛生芽接种于附加 2.0mg L IAA的 MS培养基上 ,诱
导生根 ,获得再生苗 。
1.5　毛状根的冠瘿碱检测
分别称取 0.4g 鲜重的毛状根 、毛状根再生苗叶
片于研钵中 ,加入0.4mL 0.1mol L HCl ,充分研磨后 ,
转入 1.5mL 离心管 , 浸提 24h。 12000r min , 离心
5min ,取上清液10μL 点样于Whatman 3号滤纸上 ,参
照Tanaka[ 5] 等的方法进行高压纸电泳分析 ,以未经
感染的再生苗的根与叶片作为阴性对照 , 甘露碱
(mannopine)标准品(1mg mL)为阳性对照 。
1.6　毛状根的 PCR检测
质粒提取参照文献[ 6] ,植物 DNA提取参照文
献[ 7] 。PCR检测引物参照 rol B 基因序列[ 8] 设计 ,
上游引物:5′TAC TGC AGC AGG CTT CAT GAC 3′;下
游引物:5′GCT TTC CCG ACC AGA GAC TG3′。预期
产物大小为 862bp 。反应条件:94℃预变性 3min;
94℃变性 1min ,52℃退火 1min ,72℃延伸 1min , 35个
循环;72℃延伸 10min。
1.7　毛状根的培养和黄酮含量的测定
收集N6液体培养基上生长 20d的毛状根 ,蒸馏
水冲洗干净 ,滤纸吸干 ,称取鲜重 。于 50℃烘箱中
烘干至恒重 ,备用。黄酮含量的测定采用比色法[ 9] ,
以芦丁的含量进行换算 。芦丁标准品浓度与其吸光
度的直线方程:Y =0.06703X +0.000373 (其中 , X
表示光的吸收变量 , Y 表示总黄酮浓度 ,mg mL),相
关系数 r=0.9991 ,测定波长 510nm ,仪器型号:Beck-
man Coulter 的 DU 640 可见_紫外分光光度计。
2　结果
2.1　新疆雪莲毛状根的诱导和培养
外植体的预培养时间与毛状根的诱导率有密切
关系 。叶柄外植体经 R1601感染后21d的出根情况
统计表明:在N6无激素固体培养基上预培养 2d的
外植体 ,毛状根的诱导频率最高(Table 1)。预培养
能够诱导外植体切口处产生细胞分裂活跃的愈伤细
胞 ,而这些愈伤细胞对发根农杆菌的感染比较敏
感[ 10] 。
表 1　预培养时间对 R1601转化叶柄外植体
产生发状根的影响
Table 1　Effect of preculturing time on transformation
frequency of stem segment with R1601
Preculturing
time d
No.of explants
inoculated
No.of explants
with hairy root
Transformation
frequency %
0 60 0 0
2 60 46 76.7
6 60 30 50
15 60 6 10
Basal medium:N6+3% sucrose+0.8% agar , pH 5.6～ 5.8
图 1　新疆雪莲毛状根培养体系的建立
Fig.1　Establishment of S.involucrata hairy root cultures
a:sterile hairy roots of S.involucrata
f rom leaves、petioles and roots at 15 days
after inoculation with Agrobacterium rhizogenes
strain R1601;b:sterile hairy root s cultured
in a liquid culture of N6 hormone_free medium.
外植体的类型影响发根农杆菌的感染效率 。在
叶片 、叶柄 、根段三种的外植体中 ,根段的诱导效率
3673 期 付春祥等:新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立
最高 ,可达 100%(Table 2);其次是叶柄;叶片的诱导
效率最低 ,且容易褐化死亡。
共培养后的外植体接种于 N6 无激素培养基
上 ,4 ～ 5d后 ,大多数外植体的切口边缘有疏松的愈
伤组织产生。2周后 ,愈伤组织逐渐长出长 2 ～ 3cm ,
直径约 1mm 的毛状根 。出根部位因外植体类型的
不同呈现明显差异 。对于叶片外植体 ,出根部位在
外植体的形态学下端 , 这可能与生长素的极性分布
有关[ 11] 。少数叶片外植体 ,能够在两端产生毛状
根;叶柄外植体 ,出根部位位于外植体的形态学下端
或两端;而根段外植体的出根部位 ,在中间膨大的愈
伤组织处。有部分叶片 、叶柄外植体产生的愈伤组
织比较致密 ,不能产生毛状根 。经继代培养后 ,有疏
松愈伤组织产生的外植体 ,仍可见到毛状根的出现;
有致密愈伤组织产生的外植体 ,则逐渐褐化死亡 。
获得的毛状根形态不一 ,有的呈光滑无根毛状 ,有的
则生有细密的根毛(Fig.1-a)。未经发根农杆菌侵染
的外植体 ,不能产生毛状根。将毛状根切下接种于
N6无激素液体培养基 , 1周后部分毛状根产生分
枝 ,增长速度加快 , 3 周后可以布满培养瓶的底部
(Fig.1_b),还有一部分毛状根不出现分枝 ,生长缓
慢。来自再生苗的根在N6无激素液体培养基中不
能生长 ,必须添加 1mg L IBA ,才能维持生长 ,但它的
形态与毛状根有着明显的区别:侧根细嫩 ,主根膨
胀。
发根农杆菌的种类与毛状根的感染效率有着重
要的联系 。在 3种农杆菌感染新疆雪莲外植体的研
究结果中 ,R1601感染效率最高 ,且率先出现毛状根
(Table 2),而 R1000和 LBA9402 则直到 20d 后才有
毛状根出现。
表 2　3种发根农杆菌对叶片 、叶柄和根段外植体感染的结果
Table 2　Effect of different explants infected by three strains of Agrobacterium rhizogenes
Co_cultivation
medium explants type
No.of sample
tested
No.of explants
transformed
Transformation
rate %
Roots
format ion d
1.R1601
a.Leaves
b.Petioles
c.Roots
2.R1000
a.Leaves
b.Petioles
c.Roots
3.LBA9402
a.Leaves
b.Petioles
c.Roots
60
60
60
60
60
60
60
60
60
42
46
60
14
20
35
3
5
8
70
76.7
100
23.3
33.3
58.3
5
8.3
13.3
15
13
8
27
25
20
40
35
30
＊Data represent the mean values of three independent experiments.
2.2　毛状根再生苗的获得
经过继代培养的毛状根在附加 0.5mg L IBA的
N6液体培养基中有少量愈伤组织产生 。这些愈伤
组织在附加激素的 MS 固体培养基上能够分化出
芽 ,并生根成苗 。由于雪莲生长环境要求较为特殊 ,
再生苗的移栽具有一定的难度 ,有关该方面的研究
尚在进行中 。但在组培条件下 ,该再生苗在形态上
与未经感染的再生苗无明显区别 ,而前者黄酮类物
质的含量仅为后者的 53%(Table 3)。
2.3　毛状根及其再生植株中 rol B基因的 PCR扩
增
Rol B是发根农杆菌 Ri质粒 TL_DNA上与发根
形密切相关的基因[ 13] ,利用 rol B基因序列设计的
引物 ,能够从 R1601菌株质粒和毛状根及其再生植
株的总 DNA中 ,扩增出 862bp的特异性片段(Fig.2_
2 、4 、5),而未经转化的叶片总 DNA中无特异性条带
出现(Fig.2 ～ 3),进一步证明 TL_DNA上的 rol B 基
因整合到了毛状根及毛状根再生植株的基因组中。
2.4　毛状根及其再生植株中甘露碱的纸电泳分析
农杆碱型发根农杆菌TR_DNA 中存在甘露碱合
成酶基因 。当 T_DNA 整合到植物细胞基因组中并
表达后 ,能够利用植物细胞提供的物质和能源合成
甘露碱。利用高压纸电泳技术检测转化根系中甘露
碱的存在 ,能够判断毛状根基因的转入[ 12] 。在毛状
368 生　　物　　工　　程　　学　　报 20卷
根和毛状根再生植株的提取物中 ,利用高压纸电泳
检测到甘露碱(Fig.3_2 ,4)的存在 ,而未经转化的叶
片 、根段 , 未出现阳性斑点(Fig.3_1 , 5),从而说明
TR_DNA上的甘露碱基因已导入毛状根。
图 2　新疆雪莲毛状根中 rol B基因的 PCR检测
Fig.2　PCR detection of the rol B gene fragment
in transformed tissue of S .involucrata
1:molecular weight marker , 1Kb ladder;2:f ragment from plasmid of
A.rhizogenes R1601;3:fragment f rom Non_transformed leaves
of S.involucrata;4:fragment from hairy roots of S.involucrata;
5:fragment from regeneration plantlets from callus of hairy
roots of S.involucrata
图 3　新疆雪莲毛状根中冠瘿碱的高压纸电泳分析
Fig.3　Opine analy sis of hairy root of S.involucrata
by highvotage paper electrophoresis
1:leaves of the explants;2:hairy root cultures
of S.involucrata;3:authentic mannopine;
4:regeneration plantlets from callus of hairy roots
of S.involucrata;5:non_transformed ordinary root s
表3　野生新疆雪莲和新疆雪莲培养物中总黄酮的含量
Table 3　The contents of flavonoid in wild and their culture plant
Leaf of wild
plant
Root of
wi ld plant
Hairy root of
culture plant
Regeneration plantlet
untransformed
Regeneration plantlet
transformed
Contents of flavonoid % 3.55 1.19 10.23 1.97 1.05
2.5　毛状根中黄酮含量的测定
将发根农菌 R1601感染叶片 、叶柄和根段外植
体产生的毛状根系 ,进行离体扩大培养 ,并对其生长
动态和黄酮含量进行测定 ,获得 3 个高产的根系。
其中两个根系来源于根段外植体 ,一个根系来源于
叶片外植体。选择来源于根段外植体的毛状根系进
行研究 ,发现该根系 20d 的生长速率可达到鲜重接
种量(2.8g L)的 24倍 ,其中黄酮含量是野生雪莲根
的 8.6倍 ,是野生雪莲叶片的 2.9倍(Table 3)。
3　讨论
发根农杆菌种类 、被感染部位细胞类型以及生
理状况等方面的不同 ,使 T_DNA插入植物基因组的
位置 、长度和拷贝数千差万别[ 14] 。因此植物感染部
分就会产生在形态 、生长和有效成分含量等方面各
异的毛状根系。将这些毛状根系分别进行离体培
养 ,并对它们的生物量和产量进行动态分析 ,就可以
筛选出高产根系。本实验对新疆雪莲毛状根系进行
筛选 ,得到三个生长迅速 、黄酮含量高的优良根系。
这些根系在无激素培养基中均能旺盛生长 ,表现出
典型的发根特征 ,而未经感染的根系在无生长素附
加的培养基中不能正常生长 。这与 Ri质粒 T_DNA
上携带的 rol基因和生长素合成酶基因(tms1 , tms2)
有关[ 15] 。
发根农杆菌致根性与所含 Ri质粒的类型有密
切关系 ,本实验利用农杆碱型发根农杆菌(R1601 、
R1000 、LBA9402)侵染新疆雪莲的不同外植体 ,发现
不同菌株对新疆雪莲侵染能力不同 ,其中 R1601效
率最高 ,这与其 Ri质粒上整合有超致病根癌农杆菌
(A.tumefaciece)pTiBo542的Vir区粘性质粒 pTVK291
有关[ 16] 。即使同一种发根农杆菌对不同植物或同
一植物不同器官的敏感性也不同。到目前为止 ,已
经在 31个科 100多种植物中实现了毛状根的转化 ,
但多数集中在双子叶植物和裸子植物范围内 ,单子
叶植物诱导成功的例子不多 。在已获得的药用植物
的毛状根中 ,大多采用无菌苗的叶片作外植体进行
诱导 ,其中相当一部分植物毛状根的诱导率低于
60%。我们首次利用根段外植体进行诱导 ,其诱导
率可达到 100%,说明根中含有某些利于发根农杆
菌侵染的信号物质。对这些物质深入研究 ,能够在
3693 期 付春祥等:新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立
其他一些难于诱导的植物组织 、器官和种属里实现
Ri质粒的成功转化。
Ri质粒T_DNA的 rol 基因与植物激素间的相互
作用 ,影响植物细胞分化和植株再生 ,从而间接影响
某些次生代谢产物的合成 。张荫麟等利用丹参毛状
根 ,在无激素培养基上分化得到丹参酮含量高于原
植株的再生植株[ 17] 。我们得到来自新疆雪莲根段
外植体的一个高产毛状根系 ,其愈伤组织在附加
1.0mg L BA 和 0.1mg L NAA 的MS 固体培养基上 ,
再生率可以达到 80%,而其他毛状根系的分化能力
则远远低于该根系(数据未列出)。通过高压纸电泳
和PCR的方法证明了毛状根中T_DNA的转化 ,但在
新疆雪莲毛状根的植株再生过程中 ,仍存在 T_DNA
丢失的可能。为此利用高压纸电泳和 PCR对再生
苗进行检测 ,发现其中仍含有甘露碱和 rol B基因 ,
证明获得的是转化苗 。在获得的毛状根根系中 ,有
些在无激素添加的培养基上也会分化出芽 ,但分化
率低 ,需要时间长 ,加入适当比例的激素后 ,能够提
高分化率 。
野生雪莲叶片中黄酮类物质的含量大约是来源
于种子萌发所得到的再生苗叶片的 2倍 ,这与野生
环境与组织培养条件的差异有关[ 18] 。毛状根愈伤
组织分化出的再生苗与未经发根农杆菌侵染的再生
苗在形态上没有明显差别 ,但前者黄酮含量仅为后
者的 53%,这与张荫麟 、Tepfer等[ 19] 报道的关于毛状
根再生植株叶片边缘皱缩 、节间缩短 、植株矮化 、不
定根多 、目的物含量提高等现象并不一致 。其中原
因尚待进一步研究。
致　谢　发根农杆菌 R1601由北京大学林忠平教授
惠赠 , R1000 、LBA9402由清华大学郭志刚教授惠赠 。
甘露碱标准品由中国医学科学院药用植物研究所宋
经元博士惠赠 ,特此致谢 !
REFERENCES(参考文献)
[ 1 ] 　Li GH(李观海)、Liu F(刘发), Zhao RC(赵荣春).Studies on
pharmacological actions of Saussurea involucrata Kar.et Kir.ex Max-
in.Acta Pharmaceutica Sin(药学学报), 1980, 15:368-369
[ 2 ] 　Liu LS(刘力生), Xiao XH(肖显华), Zhang LD(张龙弟)et al.
Effect of the flavonoids from Saussurea involucrata on DNA synthesis
of cancer cells.J LanzhouUnive Natu Scie(兰州大学学报自然科
学版), 1985 ,21:80-83
[ 3 ] 　DAI JG(戴均贵), ZHU WH(朱蔚华).Application of hairy root
culture technology to production of plant secondary metabolites.Plant
Physiology Communications(植物生理学通讯), 1999 , 35(2):69-
76
[ 4 ] 　XU TF(许铁峰),Zhang HM(张汉明),Zhang W(张威)et al.Es-
tablishing better lines and regenerating system of hairy roots of Isatis
indigotica with Ri T_DNA.Acad J Sec Mi l Med Univ(第二军医大
学学报), 2000 , 21(10):907-910
[ 5 ] 　Tanaka N , Hayakawa M , Mano Y , Ohkawa H , Matsui C.Infection
of turnip and radish storage roots with Agrobacterium rhizogenes.
Plant Cell Reports , 1985 ,4:74-77
[ 6 ] 　Sambrook J , Russell David W.Molecular cloning:A Laboratory
Mannual ,3rd ed.pp:35-37 , by Cold Spring Harbor Laboratory
Press , Cold Spring Harbor , New York , 2001
[ 7 ] 　Doyle JJ , Doyle JL.Isolation of plant DNA from fresh tissue.Focus ,
1990 , 12:13-15
[ 8 ] 　Slightom J L , Durand_Tardif M , Jouanin L , Tepfer D.Nucleotide
sequence analysis of TL_DNA of Agrobacterium rhi_ zogenes agropine
type plasmid:Ident if ication of open reading frames.J.Biol.Chem-
istry ,1986 , 261:108-121
[ 9 ] 　Guan JY(关家彦),Wang WW(王玮文), Ma MT(马幕提) et al.
Investigation of technological preparation on soak of Saussurea involu-
crata.J Shenyang Pharma Univ(沈阳药科大学学报), 1995 , 12:
209-211
[ 10] 　Shi H P(施和平), Li L(李玲), Pan RZ(潘瑞炽)Effect of expant
age and sucrose concentration on hairy root formation from cucumber
cotyledons.Guihaia(广西植物),2000 , 20(4):356-360
[ 11] 　Shi H P(施和平), Li L(李玲),Pan RZ(潘瑞炽)Effect of polarity
and NAA concentration on transformation of cucumber cotyledons by
Agrobacterium rhizogenes.Journal of Tropical and Subtropical Botany
(热带亚热带植物学报), 1997, 5(3):43-47
[ 12] 　Dessaux Y , Petit A.Opines as screenable for plant transformation.
Plant Molecular Biology Manual , 1994, C3:1-12
[ 13] 　Di Cola , A , Costantino P , Spanò L.Cell commitment and rolB gene
expression in the induction of root differentiation.Plant Cell Tissure
and Organ Culture , 1996, 46:203-209
[ 14] 　David C , Petit A , Tempe J.T_DNA length variability in mannopine
hairy root:more than 50kilobase pai rs of pRiT_DNA can integrate in
plant cells.J Plant Cell Reports , 1988 , 7:92-95
[ 15] 　Liang J(梁机),Chen XY(陈晓阳), Lin SZ(林善枝), Xie SM(谢
响明) et al.Advance of studies on Agrobacterium rhizogenes Ri
plasmid rol genes and their applications for forest tree genetic im-
provement.Chinese Bulletin of Botany(植物学通报), 2002, 19(6):
650-658
[ 16] 　Pythoud F , Sinkar V P , Nester E W et al.Increased virulence of
Agrobacterium rhizogenes conferred by the vir region of pTiBo542:
application to genetic engineering of poplar.Bio Techno , 1987, 5:
1323-1327
[ 17] 　Zhang YL(张荫麟), Song JY(宋经元), Qi JJ(祁建军) et al.
Plant regeneration f rom Salvia miltirrohiza Bunge transformed by
Agrobacterium rhizogenes.China Journal of Chinese Materia Medica
(中国中药杂志), 1997 ,22(5):274-275
[ 18] 　Zhu C(朱晨), Jiang XY(姜湘英), Zhou PW(周丕文).Compari-
son of the contents of total flavone between artifi cial cultivated and
wild Saussurea involucrata.Chin Pharm J .(中国药学杂志),
2002 , 37(2):98-99
[ 19] 　Tepfer D.Transformation of several species of higher plants by
Agrobacterium rhizogenes:sexual transmission of the transformed gen-
otype and phenotype.Cell , 1984 , 37:959-967
370 生　　物　　工　　程　　学　　报 20卷
Establishment of Saussurea involucrata Hairy Roots Culture
and Plantlet Regeneration
FU Chun_Xiang　JIN Zhi_Ping　YANG Rui　WU Feng_Yan　ZHAO De_Xiu＊
(Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093, China)
Abstract　Hairy root clones of Saussurea involucrata transformed with Agrobacterium rhizogenes strains R1601 , R1000 , and
LBA9402 were established to investigate the flavonoid production.Opine synthesis and PCR analysis confirmed the integration of
the T_DNA fragment of Ri plasmid from A.rhizogenes strain R1601 into the transformed root genome.The frequency of hairy root
formation from root segments , which were pre_cultured 2 days in N6 solid medium without plant growth regulators , amounted to
100% following infection with R1601 strain of A.rhizogenes.The transformed roots were kept in hormone_free N6 liquid medium
in the dark at 25℃,110r min and routinely subcultured every 20 ～ 24 days.One hairy root clone , which grew vigorously with
lateral branches , was periodically examined for the ability to produce flavonoid.The maximum of biomass and flavonoid yield
achieved 66.7 g L(fresh weight)and 102.3mg g dry weight after incubation 20 days.The calli were induced from the hairy root
culture in the presence of 0.5mg L IBA and intact plantlets were regenerated from these calli.The regeneration plantlets from
hairy roots , in which the flavonoid content were 53% in that of untransformed plants , werent different in growth and morphology
of the untransformed plantlets.Therefore plant regeneration from hairy roots may be also a means for producing transformed S .
involucrata plants.Hairy root cultures of S .involucrata clearly showed higher flavonoid contents compared to the wild plant or
the regeneration seedlings.As the wild S .involucrata grows only in special regions with peculiar climate , and cultivation of this
species in a normal climate has been unsuccessful so far.The success in obtaining a method for high production of flavonoid
might very well be one of the solutions for this problem in the future.
Key words　Saussurea involucrata , Agrobacterium rhizogenes , hairy roots , flavonoid
Received:10-27-2003
This work was supported by Grant f rom Natural Science Foundation of China(No.39970896).
＊Corresponding author.　Tel:86_10_62591431ext6201;　Fax:86_10_62590833;　E_mai l:zhaodx@ns.ibcas.ac.cn
2004年中国微生物学会学术年会征文通知
由中国微生物学会主办 、广西微生物学会承办的“ 2004年中国微生物学会学术年会”定于 2004 年 11 月中下旬在广西南宁
召开。中国微生物学会 、广西微生物学会热忱欢迎全国从事微生物学研究 、开发的专家学者参会 , 也真诚欢迎与微生物学有
关的生产厂家 、公司赞助会议并前往会场展示自己的产品。
学术年会的主题为:微生物对人类的贡献 ———21 世纪微生物学和微生物技术的发展方向。
分会场的主题为:微生物资源与社会可持续发展;微生物与人类健康;微生物与社会经济发展。
为进一步提高会议的学术交流水平 ,此次年会的大会报告采用公开申请方式 , 凡中国微生物学会会员在微生物学科相关
方向进行的前沿性研究 、取得的最新研究进展 、具有代表性的学术观点 、在国际上处于先进地位的科研成果皆可提出参加大
会报告的申请 ,所有申请的大会报告(约 3000 字)均需在 6 月 15日前报送中国微生物学会办公室 , 统一经专家评定后 , 由常务
理事会讨论确定。中国微生物学会 17个专业委员会和分会同时均可推荐大会报告人选。
征文要求:内容以年会主题和分会场主题为准 ,涉及基础 、工 、农 、医 、兽医微生物学等多方面研究进展。
1.与会者应提交未公开发表的论文摘要(限 400 字), 格式要求如下:题目:三号宋体;作者和作者地址(包括 E-mail 地址):
五号楷体;正文:小四号宋体。
2.论文摘要邮寄(附参加第几分会场学术交流)并通过中国微生物学会 E-mail:csm@sun.im.ac.cn 提交 , 个别无条件者亦
可直接邮寄论文摘要。
3.会议将进行论文摘要统一审稿。
大会报告文章要求提供全文 ,格式及要求同前。
联系地址:北京市海淀区中关村北一条 13号 中国微生物学会办公室收
邮编:100080　电话 传真:010-62554677　E-mail:csm@sun.im.ac.cn
敬请附上你的详细联系地址 、邮政编码 、电话(单位及住宅)、传真以及 E-mail地址 ,以便发放会议通知。
(中国微生物学会办公室 供稿)
3713 期 付春祥等:新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立