全 文 ：sionpaternsoftypeIandtypeⅢ collagenandfibronec-
tiongenesinexperimentalgranulationtissue.BiochimBio-
physACTa, 1994, 1217(1):41-48.
[ 4] TSOJY, sunXH, kaoTH, etal.solationandcharacter-
izationofratsandhumanluceralclehyde-3-phosphatedi-
hydrogenaeCDNAs:Genomiccomplexityandmoleculare-
volutionofthegene.NucleicAcidsRes, 1985, 13:2485-
2502.
[ 5] YinJL, ShackelNA, ZekryA, etal.Real-timereverse
transcriptasepolymerasechainreaction(RT-PCT)for
measurementofcytokineandgrowthfactormRNAexpres-
sionwithfluorogenicprobesorSYBRGreenI.Immunol
CellBiol, 2001, 79(3):213-221.
(2007-01-23收稿)
新疆软紫草系统溶剂法提取分离部位的抗生育作用研究
戴 冰1 ,邹双华 2 ,刘 磊 2 ,周新蓓1
(1.湖南中医药大学附属第一医院 ,湖南长沙 410007;2.湖南中医药大学 ,湖南长沙 410007)
摘要 目的:分离筛选新疆软紫草中抗生育活性部位。方法:用系统溶剂法对紫草进行提取分离 , 通过药理实
验对分离得到的部位进行抗生育活性的测定。结果:新疆软紫草石油醚提取物对小鼠生育表现出较强的抑制作
用 , 新疆软紫草石油醚提取物有抗早孕 、抗中孕作用;而新疆软紫草乙酸乙酯 、乙醇 、水提取物对小鼠没有抗早孕 、
抗中孕作用。在各提取部位中石油醚提取物的抗生育作用最强。结论:石油醚提取部位是新疆软紫草中的抗生育
活性部位。
关键词 新疆软紫草;系统溶剂法;抗早孕;抗中孕;抗生育活性
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)09-1120-03
基金项目:湖南省计划生育委员会科研课题基金(编号:2002-14)作者简介:戴冰 ,女 ,药剂科副主任 , 硕士生导师 ,博士研究生 ,主要从事中药制剂及临床药理研究;Tel:0731-5600467, E-mail:db0223@
163.com。
新疆软紫草 Arnebiaeeuchroma是我国的常用中
药材 ,味甘 、咸 ,性寒 ,归心 、肝经。具有凉血 、活血 ,
解毒透疹等功效 〔1〕。现代研究表明紫草具有抗病
原微生物 、抗炎及抗过敏 、解热 、抗肿瘤 、抗生育 、保
肝 、止血 、降血糖 、镇静和影响免疫功能等作用 〔2〕。
本研究通过用系统溶剂法对新疆软紫草进行初步提
取分离 ,并测定其抗生育活性 ,从而确定新疆软紫草
中抗生育活性部位。
1 材料
1.1 药材 新疆软紫草经湖南中医药大学附属第
一医院药剂科周薪蓓老师检验 ,符合 2005版中国药
典要求 。
1.2 动物 昆明种未生育小鼠体重 26 ～ 35 g或
18 ～ 22 g,由湖南中医药大学动物室提供。
1.3 试剂与仪器 石油醚 ,湖南师范大学试剂厂
(AR级);乙酸乙酯 ,长沙安泰精细化工实业公司
(AR级);乙醇 ,湖南师范大学试剂厂(AR级);水为
纯净水;渗漉筒 ,回收装置 ,干燥器 ,干燥箱 ,电子天
平(BS-J120),紫外分光光度计(UV-2501PC)。
2 方法
2.1 系统溶剂法分离提取紫草 称取新疆软紫草
500 g于渗漉筒中 ,依次用石油醚 、乙酸乙酯和乙醇
渗漉提取 ,每次加溶剂 400 ～ 500 ml,使溶剂匀速流
下 ,同时将流出的提取液重新加入进行多次重复提
取 ,多次流洗至提取液颜色近无色时停止流洗 ,溶剂
用量大约为样品的 20 ～ 30倍。当流洗结束时 ,将药
渣倒出 ,水浴挥干溶剂后再换溶剂依次流洗。最后
各部位提取液于旋转蒸发器上浓缩并回收溶剂 ,浓
缩液挥干溶剂后称重 ,计算得率 〔3〕;各提取部位分
别编号为 Pe, EtoAc和 EtOH。最后用水煎煮提取 ,
得水提取物 ,并计算得率;编号为 H2O。利用紫外分
光光度法测定各提取物中紫草素的含量 ,以左旋紫
草素计〔1〕。
2.2 紫草对小鼠抗生育作用 〔4〕
2.2.1 紫草对小鼠抗着床作用:取成熟小鼠 ,体重
28 ～ 31 g,雌雄 2∶1合笼 ,每天早晨检查阴道 ,用鸡
毛柄或小镊子张开阴门 ,如见到交配后精液在阴道
内凝固而成的一白色栓塞 ,堵塞于阴道中 ,说明已交
配过 ,以阴栓出现日为妊娠第一天 。妊娠小鼠随机
分为三组 ,即空白组 ,高剂量组 ,低剂量组 。交配后
孕卵在输卵管中运行 3天 , 4 ～ 5天后进入子宫并开
始植入 ,子宫中出现孕斑 ,似充血点 ,观察药物抗着
·1120· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 9期 2007年 9月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.09.027
床作用可于交配后 1 ～ 4天内给药。于妊娠 12天处
死动物 ,检查子宫中着床点 ,活胎 ,死胎数 。用 X2检
验比较对照组和用药组妊娠率有无显著差异。 t检
验比较着床数 、活胎数 、死胎数在对照组和用药组之
间有无显著差异 。同时做切片检查。
2.2.2 紫草对小鼠抗早孕作用:妊娠小鼠随机分
为三组 ,即空白组 ,高剂量组 ,低剂量组于妊娠第 6
～ 8天给药 ,第 12天解剖 ,观察子宫中胚胎数 ,着床
点 。用 X2检验比较对照组和用药组妊娠率有无显
著差异 。t检验比较着床数 、活胎数 、死胎数在对照
组和用药组之间有无显著差异 。同时做切片检查。
2.3 提取物溶液的配制 称取一定量的各提取
物 ,加入 4%的吐温 -80,再加纯净水至刻度 ,然后将
其置水浴(80℃)上加热溶解即得。制备后各提取
物的 4个浓度分别为:10.0%, 12.5%, 30.0%和
40.0%。
2.4 给药剂量及方法 灌胃法给药 ,每日 1次 ,给
药天数依实验目的确定 ,给药剂量最大耐受剂量 ,按
动物体表面积换算 ,分别给予低剂量组 、高剂量组 ,
空白组每日灌胃等容量蒸馏水 。
2.5 病理石蜡切片制作 〔5〕 先用 10%甲醛(4℃)
固定过夜;流水冲洗 ,除去残余固定液;酒精脱水;二
甲苯脱水;浸蜡;将浸过蜡的组织块连同熔化的蜡一
并浸入包埋柜内冷却凝固;石蜡切片机切成厚度约
2 ～ 3 μm的切片;贴片;烤片;二甲苯脱蜡;酒精复
水;蒸馏水冲洗;常规 HE染色;再经酒精和二甲苯
分别脱水 、脱蜡;最后用中性树胶封片 ,加盖盖玻片 ,
阴干 ,光镜下观察 。
2.6 统计学处理 用 SPSS11.50版统计软件在计
算机上进行统计 , X2检验比较对照组和用药组妊娠
率有无显著差异 。t检验比较着床数 、活胎数 、死胎
数在对照组和用药组之间有无显著差异。
3 结果
3.1 系统溶剂法提取新疆软紫草分离部位 各提
取部位称重 ,计算得率(相对于生药材)及测定紫草
素的含量 ,结果见表 1。
表 1 各提取部位固形物得率及紫草素含量
提取部位 固形物得率(%) 紫草素含量(mg/g)
Pe 3.15 289.04
EtOAc 4.06 217.51
EtOH 0.82 116.20
H
2
O 1.03 -
3.2 新疆软紫草各提取部位对小鼠抗着床作用
石油醚提取部位对小鼠着床有抑制作用 ,着床数明
显低于空白组 ,且石油醚提取物对小鼠的抗着床作
用与剂量大小无关;而乙酸乙酯 、乙醇和水提部位对
小鼠着床没有明显的抑制作用;病理切片评价结果
与实验结果一致。结果见表 2、3。
表 2 新疆软紫草对小鼠抗着床作用实验结果表
组别 实验动物数
妊娠动物数
未妊娠动物数
妊娠抑制率(%)
着床总数 平均着床数 妊娠率(%)
空白对照组 11 9 2 18.2(未孕率) 103 5.91±2.26 81.8
石油醚高剂组 20 3 17◇◇ 85◇◇ 35 2.44±1.25◇ 15◇◇
石油醚低剂组 13 3 10◇ 76.9◇ 9 2.46±1.27◇ 23◇
乙酸乙酯高剂组 10 7 3 30 103 4.60±2.59 83.3
乙酸乙酯低剂组 10 8 2 20 95 5.90±2.42 70
乙醇高剂组 11 10 1 9.1 110 7.70±2.76 90.9
乙醇低剂组 10 9 1 10 96 8.50±3.10 90
水高剂组 13 12 1 7.6 96 10.10±4.22 92.3
水低剂组 10 10 0 0 113 10.11±4.08 100
注:与空白对照组比较 , ◇P<0.05, ◇◇P<0.01。下表皆同
表 3 新疆软紫草对小鼠抗着床作用病理切片结果表
组别 实验动物数
着床动物数
未着床动物数 着床抑制率(%)着床率(%)
空白对照组 11 9 2 18.2(未孕率) 81.8
石油醚高剂组 20 3 17◇◇ 85◇◇ 15◇◇
石油醚低剂组 13 3 10 92.3◇ 23◇
乙酸乙酯高剂组 10 7 3 30 83.3
乙酸乙酯低剂组 10 8 2 20 70
乙醇高剂组 11 10 1 9.1 90.9
乙醇低剂组 10 9 1 10 90
水高剂组 13 12 1 7.6 92.3
水低剂组 10 10 0 0 100
3.3 新疆软紫草各提取部位对小鼠抗早孕作用
石油醚提取部位对小鼠早孕有抑制作用 ,高剂量组
死胎数明显高于空白组;低剂量组胚胎数明显低于
空白组 ,而乙酸乙酯 、乙醇和水提取部位对小鼠早孕
没有明显的抑制作用;病理切片评价结果与实验结
果一致。结果见表 4、5。
4 讨论
为了确定给药剂量及实验分组 ,先进行急性毒
性实验 ,求出 MTD或 LD50 ,结合急性毒性的实验结
果确定一般药理实验的剂量 。低剂量组应相当于主
要药效学的有效剂量 ,高剂量组以不产生严重毒性
反应为限 。中药粗制剂而言 ,灌胃一般先找到该药
的最大给药浓度 ,用最大给药体积 ,先作预试验 ,然
后根据小鼠的死亡情况看是否需要下调给药量 ,并
进一步确定是作 LD50 ,还是作最大给药量实验。本
实验预实验中发现无法测出 LD50 ,故选择确定作最
大给药量实验 。
·1121·中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 9期 2007年 9月
表 4 新疆软紫草对小鼠抗早孕作用实验结果表
组别 实验动物数 妊娠动物数 未妊娠动物数 未孕率(%) 平均胎教数 平均活胎数 平均死胎数 妊娠率(%)
空白对照组 11 9 2 18.2 5.91±2.26 5.91±2.26 0±0 81.8
石油醚高剂组 17 13 4 76.5 4.56±2.35 1.76±1.58 2.71±1.78◇ 76.5
石油醚低剂组 12 10 2 83.3 1.08±1.42◇ 1.00±1.44◇ 0±0 83.3
乙酸乙酯高剂组 11 8 3 72.7 6.57±2.48 6.56±2.35 0.33±0.11 72.7
乙酸乙酯低剂组 8 6 2 75 7.51±4.11 7.51±4.11 0±0 75
乙醇高剂组 11 10 1 90.9 8.33±3.56 8.33±3.56 0±0 90.9
乙醇低剂组 10 8 2 80 7.32±2.96 7.32±2.96 0±0 80
水高剂组 13 11 2 84.6 8.21±2.35 8.21±2.35 0±0 84.6
水低剂组 10 9 1 90 8.16±3.07 8.16±3.07 0±0 90
表 5 新疆软紫草对小鼠抗早孕
作用病理切片结果表
组别 实验动物数 有死胎动物数 无死胎动物数 未妊娠动物数 妊娠率(%)
空白对照组 11 0 9 2 81.8
石油醚高剂组 17 10◇◇ 3 4 76.5
石油醚低剂组 12 6◇ 4 2 83.3
乙酸乙酯高剂组 11 0 8 3 72.7
乙酸乙酯低剂组 8 0 6 2 75
乙醇高剂组 11 0 10 1 90.9
乙醇低剂组 10 0 8 2 80
水高剂组 13 0 11 2 84.6
水低剂组 10 0 9 1 90
在配制新疆软紫草石油醚提取物溶液时发现以
4%、2%的比例加入吐温-80时 ,石油醚提取物的最
大耐受量不同 ,分别为 2.0 g/kg、2.6 g/kg〔6〕 ,这可
能与作为增溶剂吐温-80剂量的大小也可影响该提
取物中脂溶性成分的活性 ,从而导致毒性反应的程
度不同有关 。当然可以用 1%的西黄蓍胶溶液 ,也
可以用 1%CMC溶液 ,作为增溶剂加入 ,但考虑到以
后大量生产的需要 ,选择吐温-80作为常用增溶剂
加入。
胚泡埋人子宫内膜的过程称植入 (implanta-
tion),又称着床(imbed)。紫草药效学抗着床 、抗早
孕作用动物实验观察表明 , 空白组的妊娠率为
81.8%,石油醚高 、低剂量组的妊娠率分别为 15%、
23%;抗着床与空白对照组比较 ,软紫草石油醚高 、
低剂量组的妊娠率有明显降低 ,且有显著意义 ,其它
药物组的妊娠率均无明显差异 ,提示新疆软紫草石
油醚提取物对小鼠妊娠有抑制作用;同时对新疆软
紫草石油醚提取物高 、低剂量两组之间进行 χ2检验
比较 ,结果无显著差异 ,提示新疆软紫草石油醚提取
物对小鼠的抗着床作用与剂量大小无关。抗早孕与
空白对照组比较 ,石油醚提取部位对小鼠早孕有抑
制作用 ,高剂量组死胎数明显高于空白组;低剂量组
胚胎数明显低于空白组 ,这可能是由于小鼠服用石
油醚提取物后导致的流产;而乙酸乙酯 、乙醇和水提
取部位对小鼠早孕没有明显的抑制作用;进一步应
用病理学和病理切片研究了紫草对 SD雌性大鼠抗
生育作用机理 ,实验结果表明 ,新疆软紫草有抑制小
鼠着床 、卵泡发育与成熟作用 ,从而具有抗着床 、抗
早孕作用 ,评价结果与实验评价结果一致。
本研究以小鼠为药理实验筛选模型 ,以比较抗
着床 、抗早孕中妊娠率 、着床数 、活胎数及死胎数为
指标 ,对新疆软紫草用系统溶剂法分离得到的提取
部位进行了筛选。结果表明 ,石油醚提取部位是紫
草中抗生育作用的主要部位 ,对其中的抗生育活性
成分有待进一步的研究 。同时 ,为了实现紫草抗生
育药剂的推广应用 ,还需要对其它动物进行相关实
验 ,此外在给药剂型上也需做进一步研究。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 .一部 .北京:
化学工业出版社 , 2005:238.
[ 2] 沈映君 .中药药理学 .北京:人民卫生出版社 , 2000:
289.
[ 3] 王彬 , 王锐 ,贾正平 , 等.瑞香狼毒系统溶剂法分离提取
部位的体外抗肿瘤活性 .中药材 , 2004, 27(5):355-
357.
[ 4] 徐淑云 .药理实验方法学 , 第三版 .北京:人民卫生出
版社 , 2002:1572.
[ 5] 王伯沄 , 李玉松 ,黄高昇 , 等 .病理学技术 .北京:人民
卫生出版社 , 2001:951.
[ 6] 戴冰 , 周新蓓 ,尹爱武 , 等.新疆软紫草四种溶媒系统提
取物紫草素含量测定及急性毒性的实验研究 .中国中
医药科技 , 2005, 12(3):168-169.
(2006-12-14收稿)
·1122· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 9期 2007年 9月