全 文 ：第３２卷　第１期 《新疆师范大学学报》（自然科学版） Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１
２０１３年３月 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｒ．２０１３
（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
新疆紫草组织培养中试管苗玻璃化的控制与修复
郗浩江，　葛素囡，　王芳＊
（新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐８３００３２）
　　［收稿日期］２０１２－１１－１８
　　［基金项目］新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（２００８２１１７０）
　　［作者简介］郗浩江（１９８６－），男，新疆阿图什人，研究生，主要从事植物细肥工程方面的研究。
　＊［通讯作者］王　芳（１９６２－），女，甘肃兰州人，教授，硕士生导师，主要从事植物细肥工程方面的研究。
摘 要：文章研究新疆紫草组织培养中修复与控制试管苗玻璃化的因子，为新疆紫草组织培养提供技术支持。采用 ＭＳ
固体培养法，分别考察硝酸铵、蔗糖、琼脂、吲哚乙酸对试管苗玻璃化的影响。当硝酸铵（ＮＨ４ＮＯ３）８２５ｍｇ／Ｌ在不同激素环境中将
有效的控制试管苗玻璃化的发生。硝酸铵（ＮＨ４ＮＯ３）８２５ｍｇ／Ｌ、蔗糖４０ｇ／Ｌ、琼脂６ｇ／Ｌ、将有效的帮助玻璃化试管苗转化为正常
植株，本研究结果发现克服试管苗玻璃化的主要因素是硝酸铵，其他如蔗糖、琼脂、ＩＡＡ影响因素较小。修复与控制新疆紫草试管
苗培养过程中的玻璃化现象，可以通过在降低硝酸铵浓度的基础上，适当提高蔗糖的浓度，选择合适的激素浓度配比来实现。
关键词：新疆紫草；试管苗；玻璃化；影响因素
中图分类号：　Ｑ９４．１　　　文献标识码：　Ａ　　　文章编号：　１００８－９６５９（２０１３）０１－０２１－０５
新疆紫草［Ａｒｎｅｂｉａ　ｅｕｃｈｒｏｍａ（Ｒｏｙｌｅ）Ｊｏｈｎｓｔ］是我国重要的传统中草药，随着人们对野生资源的过渡
采集，其种质资源受到严重破坏，已无法满足中药产业的需求［１］。植物组织培养技术在新疆紫草资源开发和
引用中具有举足轻重的作用，与此同时在其组织培养过程中的玻璃化现象较为明显。因此对新疆紫草试管
苗控制和克服玻璃化现象的研究具有重要的现实意义。
关于组织培养过程中玻璃化现象的研究在许多植物中早已开展［２－５］，如桉树、芥菜、大白菜、芦荟等，主
要针对玻璃化的产生机理和控制进行大量的研究工作，但目前为止，对新疆紫草试管苗在组织培养中玻璃化
修复和控制的研究报道较少。
利用组织培养技术快速繁育试管苗，可以提高繁殖系数，并打破季节局限，加快繁殖速度，实现工厂化育
苗。在新疆紫草的组织培养过程中，培养材料的玻璃化现象比较严重。而玻璃化导致愈伤组织的分化能力
严重降低，难以继代培养，这成为新疆紫草快速繁殖和规模化生产中必须解决的一个难题。
以新疆紫草组培苗为实验材料，研究对试管苗玻璃化产生具有重要影响的硝酸铵、蔗糖、琼脂及激素，从
而为新疆紫草试管苗规模化培养提供参考依据。
１　材料和方法
１．１　材料
材料新疆紫草组培苗由本课题组提供，试验在新疆农业大学农学院组培室进行。
１．２　方法
１．２．１　无菌材料建立
无菌材料建立采用本课题组前期研究结果以 ＭＳ为基础固体培养基，附加硝酸银０．０８ｍｇ／Ｌ、蔗糖１０ｇ／
１２
DOI:10.14100/j.cnki.1008-9659.2013.01.003
新疆师范大学学报（自然科学版） ２０１３年
Ｌ、葡萄糖２０ｇ／Ｌ、ＩＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ、ＫＴ　０．５ｍｇ／Ｌ继代培养３代。
１．２．１．１　硝酸铵对控制紫草在组织培养中玻璃化影响
取培养３０ｄ正常的再生植株，以 ＭＳ无硝酸铵为基础培养基，活性炭１ｇ／Ｌ、硝酸银０．０８ｍｇ／Ｌ 、
ＩＡＡ１ｍｇ／ｌ、ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ附加不同浓度的硝酸铵（１６５０、８２５、４１２．５ｍｇ／Ｌ）共３个处理。
１．２．１．２　激素浓度对玻璃化苗的影响
取培养３０ｄ的正常的再生植株，以 ＭＳ为基础培养基，活性炭１ｇ／Ｌ、硝酸银０．０８ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ（０、１、２、
３ｍｇ／Ｌ）共４个处理。
１．２．１．３　硝酸铵和激素 对控制紫草在组织培养中玻璃化影响
取培养３０ｄ的正常的再生植株，以不含有硝酸铵的ＭＳ为基础培养基，活性炭１ｇ／Ｌ、硝酸银０．０８ｍｇ／Ｌ、
硝酸铵８２５ｍｇ／Ｌ附加ＩＡＡ（０、１、２、３ｍｇ／Ｌ）３共４个处理。
１．２．１．４　硝酸铵、蔗糖、琼脂对紫草玻璃化试管苗的影响
取培养３０ｄ的玻璃化的再生植株，以不含有硝酸铵的 ＭＳ为基础培养基，活性炭１ｇ／Ｌ、硝酸银０．０８ｍｇ／
Ｌ、ＩＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ、ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ附加不同浓度的硝酸铵（１６５０、８２５、４１２．５ｍｇ／Ｌ）蔗糖（３０、３５、４０ｇ／Ｌ）、和琼
脂（６、８、１０ｇ／Ｌ）使用正交实验设计Ｌ９（３）４共９个处理。
以上各处理均接种５瓶，每瓶接种６块芽，共３０块芽，培养期间不更换培养基，所有培养基ｐＨ调制５．８
后于１２１℃高温灭菌２０ｍｉｎ、培养物置于２４～２５℃、光照周期１２ｈ、光照强度２０００ｌｕｘ。４周后统计结果，以幼
芽透明、多水为特征判断是否为玻璃化，并统计其产生频率，褐化率、芽增殖率、大苗率。
玻璃化率＝（玻璃化组培苗数／接入组培苗总数）×１００％
褐化率＝（褐化死亡组培苗数／接入组培苗总数）×１００％
增殖率＝（侧芽数／接入芽总数）×１００％
大苗率＝（超过２ＣＭ芽数／植入芽总数）×１００％
实验数据用ＤＰＳ６．５进行统计分析
２　结果与分析
２．１　硝酸铵对控制紫草在组织培养中玻璃化影响
由表１研究结果表明紫草试管苗玻璃化在硝酸铵浓度为１６５０ｍｇ／Ｌ高于８２５ｍｇ／Ｌ且提升显著；同时紫
草试管苗大苗率在硝酸铵浓度为１６５０ｍｇ／Ｌ也高于８２５ｍｇ／Ｌ；表明硝酸铵对试管苗玻璃化是由于硝酸铵在
组织培养的过程作用机理较为复杂，不仅仅为试管苗提供氮源，还与根系分泌氢离子与细胞膜电位及质子泵
有一定的关联性［８－９］；因此本试验发现当硝酸铵浓度为８２５ｍｇ／Ｌ，既降低了试管苗的玻璃化率又可以维持试
管苗的正常生长。
表１　硝酸铵对控制紫草在组织培养中玻璃化影响
组合 ＮＨ４ＮＯ３（ｍｇ／Ｌ） 褐化率（％）
大苗率
（％）
玻璃化率
（％）
１　 ４１２．５　 ２６．６７　 ６．６７　 ０
２　 ８２５　 １６．６７　 １６．６７　 １０
３　 １６５０　 １６．６７　 ４０　 ６６．６７
２．２　激素浓度对苗玻璃化的影响
表２结果显示，随着ＩＡＡ浓度的减少植株玻璃化率有显著降低有效地防止了玻璃化现象的发生；表明
适当的降低激素浓度有利于防止玻璃化。
２２
第１期 郗浩江等　　新疆紫草组织培养中试管苗玻璃化的控制与修复
表２　ＩＡＡ浓度对苗玻璃化的影响
组合 培养基
芽增殖率
（％）
玻璃化率
（％）
大苗率
（％）
褐化率
（％）
ＩＡＡ（ｍｇ／Ｌ） ＫＴ（ｍｇ／Ｌ）
１　 ０　 ０．５　 １２．６　 ０　 ０　 ５０
２　 １　 ０．５　 １８３．３３　 ５８．３３　 ９．７６　 ３１．７１
３　 ２　 ０．５　 １２３．３３　 ８０　 １６．２２　 １６．２２
４　 ３　 ０．５　 ８０　 １００　 ６４．２９　 ７１．４３
２．３　硝酸铵与ＩＡＡ对控制紫草在组织培养中玻璃化影响
由表３可以得出在硝酸铵为８２５ｍｇ／Ｌ时随着激素浓度的提高其试管苗玻璃化率基本得到克服；同与
２．２结果对比发现，可以得出硝酸铵在适当激素浓度环境下，可以对试管苗玻璃化的控制起到关键作用。综
合因素考虑本实验最佳培养为２号组合（ＩＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ），芽增殖率为１５０％玻璃化率为０％。
表３　硝酸铵与ＩＡＡ对控制紫草在组织培养中玻璃化影响
组合
ＮＨ４ＮＯ３
（ｍｇ／Ｌ）
培养基
ＩＡＡ（ｍｇ／Ｌ） ＫＴ（ｍｇ／Ｌ）
芽增殖率
（％）
玻璃化率
（％）
大苗率
（％）
褐化率
（％）
１　 ８２５　 ０　 ０．５　 ２５　 ０　 ３０　 ３０
２　 ８２５　 １　 ０．５　 １５０　 ０　 ３１　 ２１．６７
２　 ８２５　 ２　 ０．５　 ２３．３３　 ０　 １３．５　 １６．２２
３　 ８２５　 ３　 ０．５　 ３０　 ４　 １５．３８　 ２５．６４
２．４　硝酸铵、蔗糖、琼脂对紫草玻璃化试管苗的影响
从表４中可以看出，在不同的因素条件下对修复试管苗玻璃化的正交实验的９个组合中，以处理９组合
修复试管苗玻璃化效果最好，玻璃化率为１０％修复试管苗玻璃化的直观分析，硝酸铵的极差在３个影响因
素（硝酸铵、蔗糖、琼脂）中最大为２３．９２１，其次为蔗糖极差为值９．９再次为琼脂为５．４４最差的是误差列为
１．１极差相比值很小，说明本实验真实可靠；因此，硝酸铵是影响修复玻璃化率的重要因素，其次是蔗糖含
量；而琼脂对修复试管苗玻璃化影响较小。方差分析表明，硝酸铵、蔗糖、琼脂对修复试管苗玻璃化现象有显
著作用，其中硝酸铵对试管苗玻璃化具有极显著作用（Ｐ＝０．００２６４＜０．０１），随着硝酸铵浓度的降低，其
修复试管苗玻璃化有显著提高的趋势。
表４　硝酸铵、蔗糖、琼脂对紫草玻璃化试管苗的影响
组合
ＮＨ４ＮＯ３
（ｍｇ／Ｌ）
蔗糖
（ｇ／Ｌ）
琼脂
（ｇ／Ｌ）
玻璃化率
（％）
１　 １６５０　 ３０　 ６　 ４３ａ
２　 １６５０　 ３５　 ８　 ３６．６７ａ
３　 １６５０　 ４０　 １０　 ２６．６７ｂ
４　 ８２５　 ３０　 ６　 ２６．６７ｂ
５　 ８２５　 ３５　 ８　 １６．６７ｃ
６　 ８２５　 ４０　 １０　 １６．６７ｃ
７　 ４１２．５　 ３０　 ６　 １０．００ｃ
８　 ４１２．５　 ３５　 ８　 １３．３３ｃｄ
９　 ４１２．５　 ４０　 １０　 ３．３３ｄ
３２
新疆师范大学学报（自然科学版） ２０１３年
表５　极差分析结果
总和 因子 水平１ 水平２ 水平３
ｘ（１） １０６．３４　 ６０．０１　 ２６．６６
ｘ（２） ７９．６７　 ６６．６７　 ４６．６７
ｘ（３） ７３　 ６６．６７　 ５３．３４
ｘ（４） ６３　 ６３．３４　 ６６．６７
均值 因子 水平１ 水平２ 水平３
ｘ（１） ３５．４４６７　 ２０．００３３　 ８．８８６７
ｘ（２） ２６．５５６７　 ２２．２２３３　 １５．５５６７
ｘ（３） ２４．３３３３　 ２２．２２３３　 １７．７８
ｘ（４） ２１　 ２１．１１３３　 ２２．２２３３
因子 极小值 极大值 极差Ｒ 调整Ｒ＇
ｘ（１） ８．８８６７　 ３５．４４６７　 ２６．５６　 ２３．９２１７
ｘ（２） １５．５５６７　 ２６．５５６７　 １１　 ９．９０７３
ｘ（３） １７．７８　 ２４．３３３３　 ６．５５３３　 ５．９０２４
ｘ（４） ２１　 ２２．２２３３　 １．２２３３　 １．１０１８
表６　正交设计方差分析表（完全随机模型）
变异来源 平方和 自由度 均方 Ｆ值 ｐ－值
ｘ（１） １０６７．５１０４　 ２　 ５３３．７５５２　 ３８９．３９０８　 ０．００２６ ＊＊
ｘ（２） １８４．２２２２　 ２　 ９２．１１１１　 ６７．１９７９　 ０．０１４７ ＊
ｘ（３） ６７．１４１５　 ２　 ３３．５７０７　 ２４．４９０９　 ０．０３９２ ＊
ｘ（４）＊ ２．７４１５　 ２　 １．３７０７
误差 ２．７４１５　 ２　 １．３７０７
总和 １３２１．６１５６
３　讨论
组织培养过程中，硝酸铵为植物提供氮元素，是生长过程中不可缺少的大量物质，但其浓度过大又会间
接造成培养材料的试管苗玻璃化现象，所以在试验中选择合适的硝酸铵浓度是非常必要［８］。黄花花等通过
研究大花萱草“黄绣客”组织培养过程中的试管苗玻璃化现象得出，降低硝酸铵浓度是控制试管苗玻璃化发
生的有效途径［９］。张翠玉等在 ＭＳ培养基中减少３／４的硝酸铵，对减少月季玻璃化效果极其显著［１０］。本试
验研究结果和前人研究结果一致，随着硝酸铵浓度的降低，紫草试管苗玻璃化率有显著下降，但是硝酸铵浓
度过低会影响植株正常生长而最佳的硝酸铵浓度为８２５ｍｇ／Ｌ。
本研究发现，在长期继代增殖过程中，芽的玻璃化现象较易发生，这与陈龙清［１１］等一些研究结果一致，
其主要原因是继代增殖中细胞分裂素和生长素不断积累所致。吲哚乙酸（ＩＡＡ）在组织培养中的作用是诱导
细胞的分裂和伸长［１２］。在组织培养过程中，不同种类不同质量浓度的激素所产生的玻璃化率不同［１３］。本试
验中随着ＩＡＡ浓度的提高试管苗玻璃化发生比较显著，在试验中发现有利于降低新疆紫草试管苗玻璃化的
降低，且增加侧芽生长的激素组合为ＩＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ较合适 。
蔗糖不仅仅能为细胞提供合成化合物的碳骨架和能源外，还可以维持一定的细胞渗透压［１４］。本试验
中，最佳的蔗糖质量浓度在４０ｇ／Ｌ，适当提高蔗糖质量浓度可以降低新疆紫草试管苗玻璃化，原因可能是由
于培养基中糖质量浓度提高，同时也降低了培养基的渗透势，试管苗不容易吸水，也就不会造成细胞吸水过
４２
第１期 郗浩江等　　新疆紫草组织培养中试管苗玻璃化的控制与修复
度导致的试管苗玻璃化。琼脂可以克服试管苗玻璃化也是基于上述机理但本实验琼脂浓度跨度较少，固表
现出对试管苗玻璃化发生效果不明显。
４　结论
本研究结果发现在新疆紫草组织培养中试管苗玻璃化的控制过程中，克服试管苗玻璃化的主要因素是
硝酸铵，ＩＡＡ影响因素较小。控制新疆紫草试管苗培养过程中的玻璃化现象，可以通过在降低硝酸铵浓度
的基础上，选择合适的激素浓度配比来实现。在新疆紫草组织培养中试管苗玻璃化的修复过程中，克服试管
苗玻璃化的主要因素是硝酸铵，蔗糖、琼脂影响因素较小。修复已玻璃化的新疆紫草可以通过在降低硝酸铵
浓度的基础上，选择合适的琼脂和蔗糖浓度配比来实现。
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Ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｉｎ　Ａｒｎｅｂｉａ　ｅｕｃｈｒｏｍａ（Ｒｏｙｌｅ）Ｊｏｈｎｓｔ
ＸＩ　Ｈａｏ－ｊｉａｎｇ，　ＧＥ　Ｓｕ－ｎｉｕ，　ＷＡＮＧ　Ｆａｎｇ
（Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｇｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，８３００３２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎｔｅｎｄｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ａｆｆｅｃｔ　Ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ
ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ａｒｎｅｂｉａ　ｅｕｃｈｒｏｍａ（Ｒｏｙｌｅ）Ｊｏｈｎｓｔ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎ－
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ｍａ（Ｒｏｙｌｅ）Ｊｏｈｎｓｔ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｓｅｐｔｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＮＨ４ＮＯ３，Ｓｕｃｒｏｓｅ，ａｇａｒ，ＩＡＡ
ａｎｄ　ＫＴ　ｏｎ　ｓｏｌｉｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｖｅｒ－
ｃｏｍｅ　ｔｈｅ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＨ４ＮＯ３８２５ｍｇ／Ｌ，Ｓｕｃｒｏｓｅ４０ｇ／
Ｌ，ａｇａｒ　６ｇ／Ｌ，ａｎｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅ：ＩＡＡ　１ｍｇ／Ｌ＋ ＫＴ　０．５ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ
ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ＮＨ４ＮＯ３ａｎｄ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ
ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｇａｒ．Ｔｏ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
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ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｒｎｅｂｉａ　ｅｕｃｈｒｏｍａ（Ｒｏｙｌｅ）Ｊｏｈｎｓｔ；Ａｓｅｐｔｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ；Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒ
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