全 文 ：小飞蓬总黄酮提取工艺优选及体外抗氧化活性研究
赵 爽， 严铭铭* ， 赵大庆， 黄耀玲， 唐 灿
(长春中医药大学，吉林 长春 130117)
收稿日期:2009-10-12
基金项目:国家“十一五”科技支撑项目(2007BAI38B05);国家“十一五”科技重大新药创制项目(2009ZX09103-323)
作者简介:赵爽(1981 －)，女，硕士研究生，研究方向:中药有效成分的提取与分离。Tel:15844010383 E-mail:zhao_shuang_happy@ 126. com
* 通讯作者:严铭铭，女，教授，研究方向:中药有效成分的提取与分离。Tel:13578990277 E-mail:yanmm595@ yahoo. com. cn
关键词:小飞蓬;总黄酮;正交试验;抗氧化活性
摘要:目的:筛选小飞蓬中黄酮类化合物的最佳提取工艺及抗氧化活性的研究。方法:以小飞蓬总黄酮及槲皮素含量为
指标，通过正交试验对小飞蓬总黄酮的提取工艺进行优化;采用 DPPH自由基清除法对优化工艺制备的小飞蓬中总黄酮
及其精制产品进行了抗氧化活性试验。结果:确立了小飞蓬总黄酮的最佳提取工艺是以 10 倍量的 70%乙醇提取 2 次，
每次 l. 0h。抗氧化实验表明，当总黄酮含量达到 28. 7%、53. 2%及 77. 5%时，对 DPPH的 IC50值(IC50表示为当达到 50%
清除率时，单位质量抗氧化剂所清除 DPPH的质量)分别为 3. 58、6. 17 及 8. 00。结论:小飞蓬总黄酮设计优化的最佳提
取工艺稳定、可靠;体现了明显的体外抗氧化活性。
中图分类号:R 284. 1 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2011)02-0348-03
小飞蓬 Erigeron canadensis L.为菊科植物小飞蓬 Eriger-
on canadensis L.的干燥全草［1］。有文献记载小飞蓬的药用
有清热利湿、散瘀消肿、改善肾的微循环的功效 ［2］并且还具
有较强抗肿瘤的药理作用［2］。本课题组已从该中药材中分
离出近二十余种黄酮类化合物，主要为:芦丁、槲皮素、木犀
草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、圣草酚、4′-羟
基黄芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4′-羟基黄芩素-7-O-β-D-
吡喃葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物［3］。在进一步对小飞蓬
总黄酮提取物进行研究发现，小飞蓬黄酮类化合物除了具有
文献报道的药理作用以外，还具有较强的抗氧化活性，在抗
老化，抗突变，调血脂等方面具有一定的临床应用价值。
本试验以优选小飞蓬总黄酮最佳乙醇提取工艺为目标，
采用正交实验法，以总黄酮和槲皮素的含量为指标对乙醇提
取工艺进行比较，确立了最佳提取工艺，并对其体外自由基
的清除作用进行了初步研究，为小飞蓬的利用和综合开发提
供参考。
1 实验材料
UV-1700 型分光光度计(日本岛津公司);Agilent 1100
型高效液相色谱仪(美国 Agilent公司);METTLER-AE240 型
电子分析天平(瑞士 METTLER 公司);BUCHI 旋转蒸发仪
(瑞士 BUCHI公司)。
芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，编号:111520-
200201)、槲皮素对照品 (中国药品生物制品检定所，编号
0721-200010) ，二者纯度都达到 98%以上，供含量测定用。
1，1 二苯基苦味苯肼(1. 1-dipbenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、
维生素 C(Vit C)对照品、维生素 E(Vit E)对照品均购于 sig-
ma公司;大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂);色谱级甲醇
购于美国 Fisher公司，其余试剂均为分析纯，均购于(北京精
细化学品有限责任公司)。
小飞蓬采于吉林省长白县，经长春中医药大学姜大成教
授鉴定为菊科飞蓬属植物小飞蓬 Erigeron canadensis L.。
2 实验方法
2. 1 总黄酮含量测定方法［4］
2. 1. 1 对照品溶液的制备:精密称取 5. 38 mg 芦丁对照品
于 25 mL 量瓶，70%乙醇溶解并定容，配制成浓度为 0. 209
mg /mL的芦丁标准溶液。
2. 1. 2 标准曲线的绘制:分别精密吸取 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、
2. 5、3 mL芦丁对照品溶液于 10 mL量瓶中，加 70%乙醇至 5
mL，依次加入 5%亚硝酸钠溶液 0. 3 mL，摇匀，放置 6 min，再
加入 10%硝酸铝溶液 0. 3 mL，摇匀，放置 6 min，之后加入
4%氢氧化钠溶液 4 mL，最后用 70%乙醇稀释定容，摇匀，放
置 15 min，进行全波长扫描，结果均在 510 nm处有最大吸收
峰。在 510 nm处测定不同浓度下的吸光度值作标准曲线。
得芦丁浓度 Y 与吸光度 A 关系曲线回归方程式:Y =
11. 604X － 0. 011 3，相关系数:r = 0. 999 5，表明芦丁在
0. 010 8 ～ 0. 064 6 mg /mL 范围内与吸光度呈良好的线形关
系。
2. 1. 3 样品溶液的制备:分别称取小飞蓬粗粉 500 g按表 4
正交实验表中的条件进行乙醇回流提取，合并滤液，过滤，滤
液蒸干，即得小飞蓬总黄酮提取物。精密称取上述按正交表
制备的相应总黄酮提取物 50 mg，置 100 mL量瓶中，加 70%
乙醇适量使溶解，定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液 1
mL于 10 mL量瓶中，加 70%乙醇定容至 5 mL，照 2. 1. 2 项
下自加 5%亚硝酸钠溶液 0. 3 mL起，在 510 nm 下测定其吸
光度，带入标准曲线计算其总黄酮浓度。
2. 2 槲皮素含量测定方法［5］
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中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
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Vol. 33 No. 2
2. 2. 1 色谱条件:色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(4. 6 mm ×
250 mm，5 μm);流动相:甲醇 － 0. 5%磷酸(47 ∶ 53)，流速:
1. 0 mL /min;检测波长为 360 nm;柱温:30 ℃;理论塔板数按
槲皮素计应不低于 4 000。
2. 2. 2 对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品溶液6. 5
mg置 100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，
即得浓度为 0. 065 mg /mL的槲皮素对照品溶液。
2. 2. 3 标准曲线的绘制:精密吸取上述对照品溶液 8. 0，
10. 0，12. 0，14. 0，16. 0，18. 0 μL注入高效液相色谱仪中。按
照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的
进样量为横坐标，绘制标准曲线，得槲皮素的标准曲线为:
Y = 1 081X + 16. 062，r = 0. 999 9。表明槲皮素进样量在 0. 52
～ 1. 17 μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
2. 2. 4 样品溶液的制备:称取上述按正交表制备的相应总
黄酮提取物 5 g，加乙酸乙酯回流提取 3 次，每次 500 mL，合
并 3 次乙酸乙酯提取液，减压蒸馏回收，提取物蒸干，加甲醇
30 mL溶解，拌样于 5 g聚酰胺(100 ～ 200 目)，收集 95%乙
醇洗脱液，60 ℃水浴蒸干，加甲醇 10 mL，超声，过滤，滤液蒸
干，加甲醇溶解，转至 10 mL 量瓶中，甲醇定容，经 0. 45 μm
微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。分别精密称取对
照品溶液与样品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，测定槲皮
素含量。
2. 3 DPPH溶液的配制及测定方法
在装有 2 mL浓度为 132. 0 μg /mL 的 DPPH70%乙醇溶
液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液 2 mL摇匀，避光静
置 30 min，在 517 nm处测定吸光度 Ai。用 70%乙醇溶液代
替样品溶液，得吸光度 A0。70%乙醇代替 DPPH，得吸光度
Aj详见文献［6］。
清除率 = 1 － ［(Ai － Aj)/A0］× 100%
式中，A0 为 2 mL DPPH70%乙醇溶液和 2 mL70%乙醇溶液
的吸光度;Ai为 2 mL的 DPPH70%乙醇溶液和 2 mL样品的
吸光度;Aj为 2 mL70%乙醇溶液和 2 mL样品的吸光度。
3 结果与分析
3. 1 单因素对提取率的影响研究
3. 1. 1 提取次数的影响 分别称取小飞蓬 500 g，设定提取
4 次，每次提取 1. 0 h，料液比 1 ∶ 10，70%乙醇加热回流提
取。计算每次提取总黄酮含量在 4 次总黄酮含量总和中所
占的比例。结果见表 1。
从表 1 中可以看出第 1 次提取总黄酮含量占总含量
53%，达到了总体含量一半以上，第 2 次提取总黄酮含量达
到 42%占总黄酮含量很高的比例，第 3 次提取和第 4 次提取
总黄酮含量只达到 4%和 1%占总黄酮总量很小比例，为了
考虑节约成本，提高效率，则取消第 3 次和第 4 次提取次数。
表 1 提取次数对总黄酮含量的影响(n =2)
提取次数 第 1 次 第 2 次 第 3 次 第 4 次
出膏率 /% 9. 4 6. 7 3. 4 1. 2
总黄酮的量 / g 5. 776 4. 498 0. 428 0. 107
占总黄酮比例 /% 53. 43 41. 61 3. 96 0. 99
3. 1. 2 提取时间的影响 提取时间过短，有效成分提取不
完全，提取时间过长，费时且成本较高。根据实验预试并参
照文献报道，提取时间选择 1. 0 h、1. 5 h、2. 0 h 提取效果较
好。
3. 1. 3 料液比的影响 加醇量太少，不能完全浸没药材，有
效成分提取不完全，加醇量太大，成本较高。根据预试结果，
加醇量为 8 倍、10 倍、12 倍较为合理。
3. 1. 4 醇浓度的影响 由于小飞蓬除了含有脂溶性成分
外，且含有水溶性成分，为了将有效成分提取完全，以芦丁含
量为指标，选取乙醇浓度为 50%、60%、70%、80%、90%，对
醇提浓度进行了优选预示试验，结果见表 2，从表 2 中可以
看出，当乙醇浓为 70%时小飞蓬总黄酮的含量较高，故得出
醇提浓度最佳范围为 65% ～ 75%。
表 2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响(n =2)
乙醇浓度 /% 60 70 80 90
总黄酮含量 /% 0. 51 0. 73 1. 88 0. 47 0. 32
3. 2 小飞蓬有效部位提取工艺的优化
单因素实验说明，提取次数为 2 次时，提取的小飞蓬总
黄酮的量已达到其总量的 95 %以上，为适合工业化生产，节
省能源，选取提取次数为 2 次，在此基础上，对乙醇浓度、提
取时间及料液比进行进一步的优选，采用 L9(3
4)正交试验
表进行实验，因素水平见表 3，正交试验结果见表 4、表 5。
表 3 因素水平表
水平 A乙醇浓度 /% B提取时间 /h C 料液比(W/V)
1 65 1 8
2 70 1. 5 10
3 75 2 12
以小飞蓬总黄酮含量为考察指标时，方差分析表明:因
素 C和因素 A对总黄酮的影响最大，因素 B对结果有影响，
直观分析表明:最佳提取工艺为 A2B1C2;以槲皮素含量为考
察指标时，方差分析表明:因素 B对槲皮素提取的影响最大，
因素 A对其有影响，而因素 C 对结果无影响，直观分析表
明:最佳提取工艺为 A2B1C3。综合上述两个考察指标的方
差及直观分析，可以看出因素 A与 B优选的结果一致，因素
C对总黄酮提取影响较大，而对槲皮素提取无影响，为有效
地将总黄酮提取出来，制定 A2B1C2 作为最佳提取方案，即
70%乙醇、料液比 1 ∶ 10、每次 1. 0 h。
3. 3 验证实验
称取小飞蓬药材 3 批，按正交实验优选结果进行提取并
测定其含量。结果见表 6。
3. 4 体外抗氧化实验
DPPH自由基清除 DPPH 自由基是判定药物体外抗氧
化活性的经典实验方法，并利用维生素 E能抑制脂溶性抗氧
化物和维生素 C能抑制水溶性抗氧化物的特点综合评定小
飞蓬总黄酮的抗氧化活性。以正交优选工艺制备的小飞蓬
总黄酮样品 A及在此优选工艺上进一步纯化的小飞蓬总黄
酮精制品B及精制品C进行了自由基的清除能力实验，并
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表 4 正交试验设计结果(n =2)
实验号
因素
A B C D
实验结果
总黄酮含量 /% 槲皮素含量 /%
1 1 1 1 1 0. 875 0. 779
2 1 2 2 2 1. 025 0. 510
3 1 3 3 3 0. 355 0. 271
4 2 1 2 3 1. 890 1. 270
5 2 2 3 1 0. 968 0. 715
6 2 3 1 2 0. 717 0. 480
7 3 1 3 2 0. 715 1. 311
8 3 2 1 3 0. 477 0. 535
9 3 3 2 1 0. 962 0. 520
以总黄酮为指标 以槲皮素为指标
I 2. 255 3. 480 2. 069 2. 805 I′ 1. 560 3. 360 1. 794 2. 014
II 3. 575 2. 470 3. 877 2. 457 II′ 2. 465 1. 760 2. 300 2. 301
III 2. 154 2. 034 2. 038 2. 722 III′ 2. 366 1. 271 2. 297 2. 076
R 0. 474 0. 482 0. 613 0. 330 R′ 0. 302 0. 696 0. 169 0. 330
注:总黄酮含量为每 100 g药材中含总黄酮的量(g)，槲皮素含量为每 100 g药材中含槲皮素的量(mg)。
表 5 正交实验方差分析
因素 离差平方和 ν F P
总黄酮 槲皮素 总黄酮 槲皮素 总黄酮 槲皮素
A 7. 501 8 4. 702 6 2 19. 03 10. 80 < 0. 05 < 0. 5
B 7. 449 5 5. 334 2 2 16. 65 52. 35 < 0. 5 < 0. 05
C 7. 821 8 4. 594 9 2 33. 56 3. 72 < 0. 05 < 0. 5
D(误差) 7. 104 7 4. 5535 2 1. 00 1. 00
与相应浓度的维生素 C和维生素 E作为对照，结果见表 7。
表 6 正交工艺验证实验
化合物
含量 /%
1 批 2 批 3 批
均值含量 /%
总黄酮含量 1. 934 2. 152 2. 053 2. 046
槲皮素含量 1. 414 1. 532 1. 641 1. 529
表 7 各供试品 IC50值(n =2)
样品 A 样品 B 样品 C 维生素 C 维生素 E
总黄酮含量 /% 23. 7 53. 2 77. 5 － －
IC50 /μg /mL 3. 58 6. 17 8. 00 7. 63 2. 01
由表 7 可知，不同总黄酮含量的样品清除 DPPH 自由基
的能力存在显著性差异，其中优选工艺样品 A逐步纯化得到
样品 B活性强于维生素 E而弱于维生素 C，最终纯化样品 C
的活性高于维生素 E及维生素 C。证明样品 A 和 B 对脂溶
性自由基有很强的抗氧化活性，样品 C 由于进一步进行纯
化，随着含量的不断提高不但对脂溶性自由基抗氧化活性逐
步增强并且对水溶性自由基抗氧化活性也明显增强。
4 结论
4. 1 本实验在单因素实验的基础上，采用正交实验法对小
飞蓬中总黄酮有效部位的乙醇提取工艺进行了优选，选用 L9
(34)正交进行考察，实验结果表明小飞蓬有效部位最佳提取
工艺条件是，以 70%乙醇为提取溶剂，在 1 ∶ 10 料液比条件
下提取 2 次每次 1. 0 h。该提取工艺简单，条件易于控制，提
取率高。
4. 2 抗氧化实验表明，黄酮类成分清除 DPPH 自由基的能
力与化合物中酚羟基的取代个数和位置有关;中药清除 DP-
PH自由基能力与总黄酮类成分含量之间存在相关性。小飞
蓬中的黄酮类化合物有良好的 DPPH清除活性，且随着小飞
蓬中总黄酮含量的提高，IC50值也明显提高，即随着小飞蓬中
总黄酮含量的提高，其抗氧化活性明显增强。
参考文献:
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