全 文 ：Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第22期
野生牛肝菌多糖提取工艺的优化及其
对自由基的清除作用
杜敏华，张英君，刘明星，冯伟伟
（南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061）
摘 要：以多糖产率为指标，在单因素实验基础上，选用正交实验对野生牛肝菌粗多糖的提取工艺进行优化，再经乙
醇沉淀、脱蛋白和真空干燥后得到野生牛肝菌多糖。 结果表明，野生牛肝菌粗多糖最佳提取工艺为温度为75℃，浸提
时间为2h，在料液比1∶25下提取3次，多糖产率为9.13%。 影响野生牛肝菌粗多糖提取的主要因素是料液比和提取温
度，其次是提取次数。 应用化学发光法对野生牛肝菌粗多糖的·OH和O-2·的清除能力进行了研究，结果表明，野生牛
肝菌粗多糖对·OH和O-2·自由基均具有明显的清除能力，清除O-2·自由基的IC50为5.40mg/mL，清除·OH自由基的IC50为
6.36mg/mL，野生牛肝菌粗多糖对O-2·自由基的清除能力是对·OH自由基的清除能力的1.18倍。
关键词：野生牛肝菌，多糖，超氧自由基，羟自由基
Optimization of extraction technology and scavenging activity to free
radicals of polysaccharides from Natural Boletus
DU Min-hua，ZHANG Ying-jun，LIU Ming-xing，FENG Wei-wei
（College of Life Science and Technology，Nanyang Normal University，Nanyang 473061，China）
Abstract：On the basis of single factor test，optimization of extraction process of crude Natural Boletus
polysaccharides was investigated by orthogonal tests. Then the Natural Boletus polysaccharide was obtained
after ethanol -precipitation，deproteinixation and vacuum drying. The results showed that the optimum
conditions for the isolation was as follows：temperature was 75℃，time was 2h，material to water ratio was 1∶25，
times was 3，polysaccharide yield was 9.13% . The major factors affecting Natural Boletus polysaccharides
extraction were material to water ratio and temperature in the first place，and times in the next place. The
scavenging ability of·OH and O-2· of Natural Boletus polysaccharide were assayed by chemiluminescence.
There results showed that Natural Boletus polysaccharide had evident abilities of scavenging hydroxyl radicals
and superoxide anion radicals. The crude Natural Boletus polysaccharides obtained had strong superoxide
anion radicals scavenging effect，with an IC50 of 5.40mg/mL，which was more than 1.18-fold increased after
hydroxyl radicals，revealing an IC50 of 6.36mg/mL.
Key words：Natural Boletus；polysaccharides；superoxide radicals；hydroxyl radicals
中图分类号：TS201.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2012）22-0292-05
收稿日期：2012－04－24
作者简介：杜敏华（1964-），男，硕士，教授，研究方向：食品生物技术。
基金项目：河南省教育厅自然科学研究计划项目（2011B550009）；南
阳师范学院SPCP项目（ZZ-2011-39）。
野生牛肝菌（Natural Boletus sp．），又名大脚菇，
隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，牛肝菌
科，牛肝菌属，是一种药、食兼用的珍稀食用菌。经过
大量的化学和药理分析发现，野生牛肝菌具有高优
质蛋白质、高钾、高维生素B2，低脂肪、低热量、低钠，
且含有丰富多糖等生物活性成分的特点[1]。野生牛肝
菌多糖是一种有效的生物免疫调节剂，其具有明显
的抗肿瘤、调节血糖、血脂及胆固醇水平、降血压、改
善免疫系统功能等作用[1-3]。目前，国内、国际市场上
牛肝菌干品的价值逐年上扬，优质牛肝菌干品供不
应求，销价高达l50～240元/kg。我国牛肝菌资源非常
丰富，主要分布在我国西南和华南地区及东北和华
东沿海各省。牛肝菌已成为我国出口创汇的重要菌
类产品，野生牛肝菌的营养及药用价值的研究对进
一步深入开发野生牛肝菌资源具有重要理论意义，
目前有关野生食用牛肝菌的研究主要集中在其营养
成分分析和活性物质多糖的免疫及抗肿瘤作用方
面[1-6]，有关野生食用牛肝菌主要活性物质多糖组分
的分离纯化及抗氧化作用此方面深入系统的研究鲜
见报道。Cuzzocrea等[7]的研究证实，来源于阳光、紫外
线、化学反应和代谢作用的活性氧是造成组织脂过
氧化、蛋白质解聚与聚合，核酸断裂、多糖解聚的重
要活性氧，会产生一系列的病理作用，比如引起DNA
损伤、致癌、肿瘤、细胞功能衰退所导致的机体老化
292
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.22.072
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Vol . 33 , No . 22 , 2012
等。其中，超氧阴离子自由基（O-2·）和羟自由基（·OH）
是最具代表性的两种自由基[5]。羟自由基清除率是反
应药物抗氧化作用的重要指标[8]。本实验以野生牛肝
菌多糖为研究对象，以多糖产率为指标，选用正交实
验对野生牛肝菌粗多糖的提取工艺进行系统优化，
并在测定野生牛肝菌多糖对超氧阴离子自由基与
羟基自由基的清除作用中首次采用化学发光技术，
初步评价了野生牛肝菌多糖多糖的抗氧化作用，旨
在为野生牛肝菌多糖的药用机理研究提供新思路，
为野生牛肝菌资源的深度开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
野生牛肝菌 由西峡米坪真菌研究所提供，筛
选，干燥，清洗，烘干备用；三氯甲烷、正丁醇、无水乙
醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、乙醚、木瓜蛋白
酶、牛血清白蛋白、鲁米诺、邻苯三酚、邻菲罗啉、
CuCl2、H2O2、Na2CO3、NaHCO3 均为分析纯。
7200型可见分光光度计 尤尼柯（上海）有限公
司；SHG-D型生物化学发光仪 上海市检测技术所
上立检测仪器厂；SHZ-IIIB型循环水真空泵 上海
华畸科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上
海博通经贸有限公司；TDL-5000B型冷冻离心机 上
海安亭科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 野生牛肝菌多糖的提取 将野生牛肝菌筛
选、干燥、清洗、烘干、打碎，以4∶1（提取溶剂∶样品，
v∶w）的比例加入85%乙醇浸提3次，滤渣挥干乙醇，用
蒸馏水作溶剂，按一定料液比、水浴温度、浸提时间，
在热水浴中浸提一段时间，提取液减压浓缩，5℃乙
醇沉淀，沉淀用水溶解，再经浓缩醇析沉淀（重复5
次），沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤，真空干
燥得野生牛肝菌粗多糖。
1.2.2 野生牛肝菌多糖的提取工艺优化 野生牛肝
菌多糖提取的单因素实验：选定料液比、浸提温度、
浸提时间和浸提次数作为考察因素，分别考察不同
料液比（g/mL）（1∶5、1∶15、1∶25、1∶35和1∶45）、不同浸提
温度（55、65、75、85、95℃）、不同浸提次数（1、2、3、4、
5次）、不同浸提时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h）等单因素
变化对野生牛肝菌多糖粗多糖提取产率的影响。在
每个单因素实验不同处理中，除考察的单因素数值变
动外，其他考察因素取固定值，即料液比为1∶25g/mL，
浸提温度为65℃，时间为1.5h，提取次数为2次。
以多糖产率（相对于被提取的野生牛肝菌子实
体的干重）为指标，在野生牛肝菌多糖提取的单因素
实验基础上，采用L9（34）正交设计进行野生牛肝菌提
取优化，因素水平设计见表1，每一处理用野生牛肝
菌30g。
1.2.3 野生牛肝菌多糖脱蛋白处理 分别选用三氯
乙酸法、酶法以及Sevag法与上述方法的结合进行脱
蛋白处理[9-10]。最后将多糖用蒸馏水透析52h，浓缩、
醇沉后得浅黄白色多糖纯化物。蛋白含量测定采用
考马斯亮兰法，以蛋白质含量（X）为横坐标，以吸光
度（Y）为纵坐标进行线性回归分析。
1.2.4 野生牛肝菌多糖含量的测定方法 牛肝菌多
糖测定采用苯酚－硫酸法测定牛肝菌多糖。将干燥恒
重的葡萄糖配制成浓度为0.1mg/mL标准葡萄糖溶液用
于制作标准曲线。然后按照下列公式计算多糖产率：
多糖产率（％）＝多糖质量（g）/牛肝菌质量（g）×100。
1.2.5 野生牛肝菌多糖对O-2·和对·OH的清除作
用[11-12] 产生O-2·的化学发光体系为邻苯三酚-鲁米
诺-碳酸缓冲液（pH为10.2）；产生·OH的化学发光体
系为CuC1-H2O2-邻菲罗啉-碳酸盐缓冲液（pH9.60）。
测定方法见参考文献[11-12]。
1.2.6 野生牛肝菌多糖样品清除自由基能力评价[13]
野生牛肝菌多糖样品清除自由基能力具体评价方法
见参考文献[13]。
分别以O2-·和·OH自由基清除率为纵坐标，野生牛
肝菌多糖样品浓度为横坐标，绘出野生牛肝菌多糖浓
度与自由基清除率关系曲线图。一般用自由基清除率
为50%时的浓度IC50来衡量样品对自由基的清除能
力。IC50值越小，表明样品清除自由基的能力越强。
1.2.7 数据处理 实验数据采集后，用SPSS 13.0软
件进行统计学处理，单因素方差分析检验组间显著
性差异，显著用p＜0.05表示，极显著用p＜0.01表示。
2 结果与分析
2.1 不同单因素对野生牛肝菌多糖提取效果的影响
2.1.1 料液比对多糖产率的影响 由图1显示，野生
牛肝菌多糖多糖产率随料液比增大而逐渐增加，料
液比1∶5～1∶25时，多糖产率增加幅度较大，而料液比
在1∶25～1∶45时，多糖产率增加幅度不大，说明料液比
大有利于多糖的渗出，但料液比太大不利于对浸提
液浓缩。需要指出的是，料水比也不能太低，否则料
液黏度太大，过滤困难，会导致后续操作中多糖的损
失。因此采用1∶25的料液比为宜。
2.1.2 浸提温度对多糖产率的影响 由图2可知，提
取温度对多糖产率影响显著，在55～75℃野生牛肝菌
多糖产率随着温度的提高而增加明显，到75℃达到
水平
因素
A 料液比
（g/mL）
B 温度
（℃）
C 提取次数
（次）
D 时间
（h）
1 1∶15 75 1 1.5
2 1∶25 85 2 2.0
3 1∶35 95 3 2.5
表1 正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test design
图1 料液比对野生牛肝菌多糖多糖产率的影响
Fig.1 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield
1∶5 1∶15 1∶25 1∶35 1∶45
8
7
6
5
4
3
2
1
0
多
糖
产
率
（
%）
料液比（g/mL）
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最大为6.23%。继续提高温度，多糖产率下降较快，说
明适当范围的温度有助于野生牛肝菌细胞壁膨胀破
裂，加速多糖溶解[14]，但野生牛肝菌中多糖多与蛋白
质结合为糖蛋白，温度太高使蛋白质变性，则不利于
糖蛋白的析出，且高温增加能耗，也不利于多糖浸提
的操作，因此选择最适提取温度为75℃。
2.1.3 浸提次数对多糖产率的影响 由图3可知，提
取次数对多糖的提取有较大影响。随着提取次数的
增加，多糖产率不断提高。1～3次多糖产率增加幅度
较大，而3～5次多糖产率增加幅度不大。趋于平缓，
选取提取次数3次较合适。
2.1.4 浸提时间对多糖产率的影响 图4显示，多糖
产率随提取时间的增加而均匀增加，每增加0.5h多
糖产率提高幅度均不高于1.0%。在2h时多糖得率达
到最高，为6.17%。时间继续延长，多糖产率反而平缓
下降，这可能是有部分多糖降解所造成的 [15]，因此，
浸提时间以2h为宜。
2.2 野生牛肝菌多糖提取最佳工艺参数优化
影响野生牛肝菌多糖多糖有效成分的提取因素
主要有时间、温度、料液比、提取次数，在单因素实验
的基础之上，进行正交实验设计，结果见表2、表3。
表2显示，料液比、温度、提取次数、时间的极差
大小依次为4.07、2.99、1.05、0.57，说明4种因子对野
生牛肝菌多糖提取的影响程度的大小依次是料液
比＞温度＞提取次数＞时间，料液比、温度、提取次数、
浸提时间之间的极差差异较大，说明各因素间的变
异是可靠的。
方差分析结果（表3）表明，料液比、温度对野生
牛肝菌多糖提取的影响达到显著水平，说明料液比和
温度对野生牛肝菌多糖提取的影响最大，提取次数
次之，浸提时间最小，这与表2极差直观分析的结果
一致。由于浸提时间对野生牛肝菌多糖取的影响最
小且无显著差异（F=1.000），可以不考虑。结合表2、
表3可知，野生牛肝菌多糖最佳提取工艺为：A2B1C3D2
料液比1∶25，时间2h，在温度75℃下提取3次。经验证
实验验证，以该组合进行野生牛肝菌多糖提取，多糖
产率为9.13%，明显高于其他组合。
2.3 不同方法对蛋白脱除率的影响
对提取的野生牛肝菌粗多糖进行纯化，分别选用
三氯乙酸法、酶法以及Sevag法与上述方法的结合进行
脱蛋白处理。采用考马斯亮兰法进行蛋白含量测定，
测定蛋白含量的标准曲线方程为：y=0.0048x+0.0145，
相关系数R=0.9962。由图5可以看出，三氯乙酸法脱蛋
白效果明显好于Sevag法[16]，而且其脱蛋白程度较大。
将酶法与上述方法相结合可以看出，酶法与三氯乙酸-
正丁醇法结合脱蛋白效果较好。即酶解处理后，再经
三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白，重复处理5次即可，此时
蛋白质含量为0.73mg/g，多糖损失率为16.8％。而酶法
图2 提取温度对多糖产率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield
50 60 70 80 90 100
8
7
6
5
4
3
2
1
0
多
糖
产
率
（
%）
提取温度（℃）
图3 提取次数对多糖多糖产率的影响
Fig.3 Effect of extraction times on polysaccharide yield
0 1 2 3 4 5 6
8
7
6
5
4
3
2
1
0
多
糖
产
率
（
%）
提取次数（次）
图4 提取时间对多糖产率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide yield
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
8
7
6
5
4
3
2
1
0
多
糖
产
率
（
%）
提取时间（h）
实验号 A B C D 多糖产率（%）
1 1 1 1 1 4.21
2 1 2 2 1 3.13
3 1 3 3 3 2.56
4 2 1 2 3 8.58
5 2 2 3 1 7.58
6 2 3 1 2 5.82
7 3 1 3 2 7.82
8 3 2 1 1 4.78
9 3 3 2 3 3.26
k1 3.30 6.87 4.94 5.02
k2 7.33 5.16 4.99 5.59
k3 5.83 3.88 5.99 5.31
R 4.07 2.99 1.05 0.57
表2 野生牛肝菌多糖提取正交实验L9（34）结果
Table 2 Results of orthogonal test L9（34）for Natural Boletus
polysaccharide extraction
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F0.05 显著性
A 24.322 2 49.335 19.000 ﹡
B 13.500 2 27.383 19.000 ﹡
C 2.099 2 4.258 19.000
D 0.493 2 1.000 19.000
误差 0.49 2
表3 野生牛肝菌多糖提取正交实验结果方差分析结果
Table 3 Results analysis of variance of orthogonal test for
Natural Boletus polysaccharide extraction
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Vol . 33 , No . 22 , 2012
与Sevag法结合时，酶解处理后，再经6次Sevag法处
理，蛋白质含量仍为1.57mg/g，脱除效率仍然较低。
2.4 野生牛肝菌多糖对O-2·和·OH的清除作用
图6显示，野生牛肝菌多糖的加入量和O-2·及·OH
的清除率（SR）具有明显的量效正相关关系，野生牛
肝菌多糖对O-2·产生50%清除效应所需要的量（IC50）
为5.40mg/mL，野生牛肝菌多糖对·OH产生50%清除
效应所需要的量（IC50）为6.36mg/mL。当野生牛肝菌
多糖浓度在0～5mg/mL时对·OH清除率增加缓慢，大
于5mg/mL则上升加快，当浓度为9mg/mL时清除率达
到76.36%。与·OH清除率增幅相比较，当野生牛肝菌
多糖浓度浓度在0～5mg/mL时对O-2·清除率增加较
快，当大于5mg/mL则增加缓慢，当浓度为9mg/mL时
清除率达到79.93%。
在人体内，羟自由基对细胞的危害最大，可直接
损伤各种生物大分子和生物膜，导致多种疾病的发
生。图6显示，随着野生牛肝菌多糖浓度的升高对·OH
和对O-2·清除率都逐渐增大，均呈现良好的量效关
系。在本实验的浓度范围内，野生牛肝菌多糖对O-2·
的清除作用要优于对·OH的清除作用。
在清除自由基实验中，选用一套适当的发光体
系直接影响到实验数据的重复性、可靠性。本实验采
用的发光体系：产生O-2·的化学发光体系为邻苯三
酚-鲁米诺-碳酸缓冲液（pH10.2）。产生·OH的化学
发光体系为CuC1-H2O2-邻菲罗啉-碳酸盐缓冲液
（pH9.60）。实验证明该两个体系分别适用于多糖对
O-2·的和对·OH清除能力的检测，·OH可快速地攫取
野生牛肝菌多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而多糖
的碳原子上则留下一个单电子，成为碳自由基，进一
步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产
物；O-2·可与多糖发生氧化还原反应，达到被清除的目
的[16]。而且体系中所用的溶剂配制简单，实验操作方
便快捷，真正体现了化学发光法快速灵敏的特点。
根据反应机理不同，抗氧化物可分为2类[13]。一
是直接清除O-2·和·OH等诱发过氧化的自由基清除
剂如SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等。二
是脂过氧化链阻断剂，它们能猝灭脂过氧化过程中
产生的烷氧基（LO·）和烷基过氧基（LOO·），如VE和
VC等。野生牛肝菌多糖能清除O-2·和·OH，也具有脂
过氧化链阻断剂作用[5，13，17]，总抗氧化能力较强。
3 结论
以多糖产率为指标，选用正交实验对野生牛肝
菌粗多糖的提取工艺进行优化，再经乙醇沉淀、脱蛋
白和真空干燥后得到野生牛肝菌多糖。结果表明野
生牛肝菌粗多糖最佳提取工艺为料液比1∶25，浸提
时间为2h，在温度为75℃下提取3次，多糖产率为
9.13%。影响野生牛肝菌粗多糖提取的关键因素是提
取料液比和温度，其次是提取次数。
在本实验的野生牛肝菌多糖浓度范围内，野生
牛肝菌多糖对O-2·产生50%清除效应所需要的量
（IC50）为5.40mg/mL。野生牛肝菌多糖对·OH产生50%
清除效应所需要的量（IC50）为6.36mg/mL，是O-2· IC50
的1.18倍，说明野生牛肝菌多糖对超氧阴离子的清
除作用更有效，野生牛肝菌多糖对O-2·的清除作用要
优于对·OH的清除作用。随着野生牛肝菌多糖浓度
的升高对·OH和对O-2·清除率都逐渐增大，均呈现良
好的量效正相关关系。
本实验以野生牛肝菌多糖为研究对象，进一步探
讨多糖提取分离及对羟自由基的清除作用，采用化学
发光技术检测野生牛肝菌多糖清除自由基活性的模
型方法，简便实用，虽然所得到的结论不能完全代表
药物在体内清除自由基的实际情况，然而对于离体大
面积筛选抗氧化药物有重要的价值，为野生牛肝菌在
保健食品的开发利用上提供了理论依据，同时也为
野生牛肝菌多糖的药用机理研究提供了新的思路。
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图5 不同脱蛋白方法的比较
Fig.5 Comparison of different removal protein methods
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
吸
光
度
Sevag法
三氯乙酸法
E+Sevag法
E+三氯乙酸法
提取次数
图6 野生牛肝菌多糖浓度与·OH、O-2·自由基清除率关系
Fig.6 Relationship between the scavenging activity to
·OH radical，O-2·radical and the concentr ation of
Natural Boletus polysaccharide
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
（
%）
O2-·清除
·OH清除
野生牛肝菌多糖浓度（mg/mL）
（下转第302页）
295
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3 结论
芦根浸提工艺：94℃、浸提 74min、料液比
1 ∶15.8g/mL，固形物含量1.44%；白茅根浸提工艺：
96℃、浸提58min、料液比1 ∶19.4g/mL，固形物含量
1.75%；蒲公英根浸提工艺：86℃、浸提65min、料液比
1∶14.2g/mL，固形物含量3.38%。
三根汤凉茶最佳配方为芦根汁40%，白茅根汁
40%，蒲公英汁13%，白砂糖7%，柠檬酸0.1%。结果表
明，该产品色泽淡黄、澄清透明、具有三根汤凉茶特
有的香味。
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