全 文 ：食用菌学报 2009.16(1):67～ 72
收稿日期:2008-10-17原稿;2008-12-18 修改稿
作者简介:阳　飞(1981-), 男 ,湖北工业大学生物工程学院在读硕士研究生 ,主要从事发酵工程方面的研究 , 发表
主笔论文 1篇。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2009)01-0067-06
美味牛肝菌多糖发酵工艺的研究
阳　飞 , 张华山＊ , 董殿波 , 顾亚婧
(湖北工业大学生物工程学院 , 湖北武汉 430068)
摘　要:本文对美味牛肝菌(Boletus edulis)液体发酵生产粗多糖的培养基和发酵条件进行了筛选。在实验范
围内 ,美味牛肝菌发酵生产粗多糖的最适培养基配方为:马铃薯 10.0%, 蔗糖 2.0%, 蛋白胨 0.6%, KH2PO4
0.3%, MgSO4·7H2O 0.2%, CaCO3 0.2%, Z nSO4·7H2O 0.1%。在初始 pH 5.0 ～ 5.4 ,振荡转速120 r/min ,
培养温度 25 ～ 28 ℃, 250 mL 三角瓶中装液量 40%,加 10 颗玻璃珠 , 发酵时间 5 d 时摇瓶培养粗多糖产量最
高 ,达 3.161 g/ L。经 10 L 机械搅拌发酵罐放大动态实验 ,研究 pH 值 、溶氧 、菌丝生物量(湿重)以及粗多糖产
量的变化 ,可知最适发酵时间为 96 h。
关键词:美味牛肝菌;发酵条件;摇瓶培养;发酵罐
　　美味牛肝菌(Boletus edulis)属担子菌亚门
(Basidiomyco tina)、层菌纲(Hymenomycetes)、
伞菌目(A garicales)、牛肝菌科(Bo le taceae),与高
等植物共生的外生菌根真菌 ,目前尚不能进行人
工栽培[ 1 , 2] 。美味牛肝菌是一种分布甚广的食用
菌 ,含有丰富的蛋白质 、脂肪以及人体必需的多
种氨基酸 、维生素及微量元素 ,具有调整机体免
疫功能 、降低血脂 、提高人体免疫力以及显著的
抗癌作用[ 3 ～ 5] 。由于其独特的风味和优良的食疗
保健作用 ,国内外市场的需求不断增加 ,采集的
野生资源不仅受到季节的限制 ,更无法满足研发
其中活性成分的需求。而采集菌种进行菌丝体
发酵具有培养周期短 、菌丝生长快 、易于大规模
生产等优点 , 为保健食品的研发提供基础[ 6 , 7] 。
为此 ,笔者进行了美味牛肝菌液体发酵生产粗多
糖条件的研究 ,现将结果介绍如下 。
1　材料与方法
1.1 供试菌种
　　美味牛肝菌菌株 ,编号为 ACCC50559 ,由中
国农业微生物菌种保藏中心提供 。
1.2 试剂和培养基
　　苯酚试剂:取 AR级苯酚 ,参照[ 8]的方法处理。
母种培养基:马铃薯 20.0%,葡萄糖 2.0%,
酵母粉 0.14%,蛋白胨 0.06%, KH2 PO 4 0.1%,
MgSO4·7H 2O 0.05%,ZnSO 4·7H 2O 0.01%, pH
自然 。
发酵培养基:马铃薯 10.0%, 蔗糖 2.0%,
蛋白胨 0.6%, KH2 PO 4 0.3%, CaCO3 0.2%,
MgSO4·7H 2O 0.2%,pH 自然(5.4)。
1.3 菌丝培养和粗多糖提取
1.3.1 菌丝培养
　　美味牛肝菌菌丝经转接活化后接种于装有母
种培养基的三角瓶中(250 mL三角瓶装100 mL 培
养基),25 ℃,120 r/min ,培养 3 d后 ,培养液作为
液体菌种 ,10%的接种量接种于装有发酵培养基
的三角瓶中(250 mL 三角瓶装 100 mL 培养基),
25 ℃, 120 r/min ,培养 5 d ,取发酵液用于菌丝胞
内胞外粗多糖提取 。
1.3.2 胞外粗多糖的提取工艺流程[ 10]
　　取发酵液100 mL※3 500 r/min离心(1 316 g)
20 min※收集上清液※浓缩至 15 mL※加入3倍
体积的 95%乙醇※4 ℃沉淀 48 h※1 316 g 离心
20 min※收集粗多糖※复溶※酶法去除蛋白※浓
缩至 15 mL ※加入 3倍体积的 95%乙醇 ※4 ℃
沉淀 48 h※1 316 g 离心 20 min※收集沉淀于 60
℃恒温干燥收集粗多糖
1.3.3 胞内粗多糖的提取工艺流程[ 11]
　　离心获得的牛肝菌菌丝体※烘干※研磨粉
碎※称取 10 g※加入 100 mL 水※80 ℃水浴浸
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2009.01.014
食　用　菌　学　报 第 16 卷
提 3 h※1 316 g 离心 20 min※收集上清液※浓
缩至 15 mL ,之后的方法同 1.3.2。
1.3.4 粗多糖的测定
　　采用苯酚-硫酸法[ 11 ～ 13] 测定胞内外粗多糖之
和作为本文的粗多糖产量。精确称取于105 ℃干
燥至恒重的葡萄糖 100 mg ,于 100 mL容量瓶中定
容 ,准确吸取 0 、20 、40 、60 、80 、100 、120 μL分别置
于比色管中 ,加蒸馏水至 2.0 mL ,再各加 5%的苯
酚 1.0 mL ,摇匀后迅速滴加浓硫酸 5.0 mL ,摇匀
后于 25 ℃下显色 20 min ,于 490 nm波长处测定
其吸光度 ,以糖的质量浓度为横坐标 ,以吸光度为
纵坐标 ,绘制葡萄糖标准曲线。
1.4 发酵培养基的优化
1.4.1 不同碳源的筛选
　　分别以2%的葡萄糖 、乳糖 、麦芽糖 、D-果糖
替代发酵培养基中 2%蔗糖进行碳源筛选 ,其余
条件同 1.3.1 ,每个处理 6个重复 ,测定不同碳源
对美味牛肝菌粗多糖产量的影响 。
1.4.2 不同氮源的筛选
　　分别以 0.6%的蛋白胨 、麸皮 、酵母粉 、牛肉
膏 、水解乳蛋白为氮源 、其它成分同发酵培养基
组分 ,测定不同氮源对美味牛肝菌粗多糖产量的
影响 ,其余条件同 1.3.1 ,每个处理 6个重复。
1.4.3 不同无机盐的筛选
　　以 2%蔗糖为碳源 ,0.6%蛋白胨为氮源 ,分
别添加 0.1%的 ZnSO 4·7H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、
MnSO 4·H 2O , 测定不同无机盐对美味牛肝菌粗
多糖产量的影响 ,其余条件同 1.3.1 ,每个处理 6
个重复。
1.4.4 培养基成分正交实验
　　在 10%马铃薯 、0.3% KH 2PO 4 、0.2%
MgSO4·7H 2O 的基础培养基中 ,针对 4个因素进
行 L 9(34)正交试验 ,各因素水平设计见表 1 ,每
个处理 6个重复。
表 1　培养基成分试验因素和水平
Table 1　Factors and levels in orthogonal
testing of medium composition
水平
Level
因素　Factors
A(%) B(%) C(%) D(%)
1 1.0 0.4 0.05 0.1
2 2.0 0.5 0.10 0.2
3 3.0 0.6 0.15 0.3
A:蔗糖 , B:蛋白胨 , C:ZnSO4·7H2O , D:CaCO3
A:sucrose , B:peptone , C:ZnSO4·7H2O , D:CaCO3
1.5 发酵条件的优化
1.5.1 初始 pH 值的筛选
　　用 0.1 mo l/L 的 N aOH 或 HCl将发酵培
养基的初始 pH 值分别调为 4.8 、5.0 、5.2 、5.4 、
5.6 、5.8 、6.0 、6.2 , 其余条件同 1.3.1 ,测定初
始 pH值对粗多糖产量的影响 , 每个处理 4 个
重复 。
1.5.2 培养温度的筛选
　　设置不同的培养温度(21 、23 、25 、28 、31 ℃),
其它条件同 1.5.1.,测定培养温度对粗多糖产量
的影响 ,每个处理 4个重复。
1.5.3 发酵时间的确定
　　分别在摇瓶培养 3 、4 、5 、6 、7 d时终止发酵 ,
其它条件同 1.5.1 ,测定不同培养时间对粗多糖
产量的影响 ,每个处理 4个重复。
1.5.4 摇床转速的筛选
　　分别设置摇床转速 80 、100 、120 、140 、160 、
180 r/min ,其它条件同 1.5.1 ,测定不同处理粗
多糖产量 ,每个处理 4个重复 。
1.5.5 装液量的筛选
　　250 mL 的三角瓶中分别装入 50 、100 、150 、
200 mL 的培养基 ,其它条件同 1.5.1 ,测定装液
量对粗多糖产量的影响(结果折算为每 100 mL
培养物的粗多糖产量),每个处理 4个重复 。
1.5.6 玻璃珠数量的筛选
　　三角瓶中分别加入 5 、10 、15和 20颗玻璃珠 ,
其它条件同 1.5.1 ,测定玻璃珠数量对粗多糖产
量的影响 , 每个处理 4个重复。
1.6 发酵罐发酵动态实验
　　在 10 L 机械搅拌罐中进行放大实验 ,接种量
10%,装液量 50%,转速 120 ～ 140 r/min ,温度 25
～ 28 ℃,通风 0.8 vvm ,发酵期间每隔 12 h取样 ,
测定溶氧 、菌丝生物量(湿重)以及粗多糖产量
变化 。
2　结果与分析
2.1 标准曲线
　　本试验室操作中得到葡萄糖的标准曲线回
归方程 , A =6.8736Cx(R2 =0.9973),表明实验
范围内线性良好。
2.2 发酵培养基的优化
2.2.1 不同碳源对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　不同碳源对菌丝体粗多糖产量影响见图 1 ,
由结果可知 ,用 D-果糖 、蔗糖做为碳源时 ,粗多
68
第 1 期 阳　飞 ,等:美味牛肝菌多糖发酵工艺的研究
糖产量较高 ,分别为 3.283 g/L 和 2.778 g/L 。
葡萄糖 、乳糖次之 ,麦芽糖最低.考虑到规模化生
产中原料的易得性及成本因素 ,确定蔗糖为最佳
碳源 。在实验中还发现以蔗糖为单一碳源时 ,菌
体易结菌丝球 ,且结构较紧密 ,向培养基中添加
10%马铃薯可改善菌丝球的生长 ,菌丝球体积明
显变小 , 这种现象的原理有待进一步研究 。
图 1　不同碳源对美味牛肝菌多糖产量的影响
Fig.1　Effect of carbon source on polysaccharide production
2.2.2 不同氮源对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　不同氮源对菌丝体粗多糖产量影响见图 2 ,
由结果可知 ,以蛋白胨做氮源时粗多糖产量最
高 ,为 2.895 g/L ,其次是酵母粉和牛肉膏 ,水解
乳蛋白做氮源时粗多糖产量最低 。因此选择蛋
白胨作为最佳氮源 。
图 2　不同氮源对美味牛肝菌多糖产量的影响
Fig.2　Effect of nitrogen source on polysaccharide production
2.2.3 不同无机盐对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　不同无机盐对菌丝体粗多糖产量影响见
图 3 ,由结果可知 ,添加 ZnSO4·7H2O 时粗多糖
图 3　不同无机盐对美味牛肝菌多糖产量的影响
Fig.3　Effect of inorganic salts on polysaccharide production
产量最大 ,达到 3.004 g/ L ,MnSO4·H 2O 次之 ,
FeSO4·7H 2O 粗多糖产量最低。实验中还发现
添加 ZnSO4·7H2O 所得菌丝球较小 ,数量较多。
2.2.4 培养基成分优化
　　针对培养基4因素3水平的正交实验结果见
表 2 ,由结果得知 ,影响粗多糖产量的因素排序为
B>D>A>C ,各因素最佳组合是 A2B3C2D2 , 追
加的验证实验中A2B3C2D2 组合的获得粗多糖为
3.052 g/L ,高于之前的所有组合 。
表 2　发酵培养基成分优化正交实验测定结果
Table 2　Orthogonal test data
序号
No. A B C D
粗多糖含量(g/ L)
Crude polysac-
charide content
1 1 1 1 1 2.202
2 1 2 2 2 3.025
3 1 3 3 3 2.541
4 2 1 2 3 2.409
5 2 2 3 1 2.529
6 2 3 1 2 3.037
7 3 1 3 2 2.302
8 3 2 1 3 2.369
9 3 3 2 1 2.532
K1 7.818 6.913 7.603 7.263
K2 7.975 7.973 8.016 8.414
K3 7.203 8.110 7.372 7.319
R 0.257 0.399 0.215 0.384
2.3 发酵条件优化试验测定结果
2.3.1 初始 pH 值对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　实验结果见图 4 ,发酵液初始 pH 在 5.0 ～ 5.4
范围内 ,粗多糖产量维持在较高水平 ,在 2.995 ～
3.092 g/L之间。
图 4　pH对多糖产量的影响
Fig.4　Ef fect of pH on polysaccharide production
2.3.2 培养温度对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　实验结果见图 5 ,粗多糖产量在一定范围内
随培养温度的升高而升高。培养温度 25 ℃时 ,
粗多糖产量最高 ,为 3.014 g/L 培养温度超过
69
食　用　菌　学　报 第 16 卷
28 ℃,粗多糖产量下降 。
图 5　温度对多糖产量的影响
Fig.5　Effect of temperature on polysaccharide production
2.3.3 发酵时间对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　实验结果见图 6 ,发酵时间的长短对粗多糖
积累量有重要的影响 。在 120 h 培养时间范围
内 ,粗多糖产量随时间延长有明显提高 , 120 h
时 , 最高粗多糖量达 3.065 g/L 。继续延长发酵
时间 ,粗多糖产量略微下降。
图 6　发酵时间对多糖产量的影响
Fig.6　Effect of incubation time on polysaccharide production
2.3.4 摇床转速对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　实验结果见图 7 ,摇床转速对粗多糖产量有
较大影响 ,当转速 120 r/min 时 ,粗多糖产量最
高 ,达 2.954 g/L 。
图 7　摇床转速对多糖产量的影响
Fig.7　Effect of shaker speed on polysaccharide production
2.3.5 装液量对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　实验结果见图 8 , 随着装液量的增加 ,粗多
糖量先升后降 ,在装液量为 40%时 ,粗多糖产量
达到最大值 , 3.141 g/ L。
2.3.6 玻璃珠数量对美味牛肝菌粗多糖产量影响
　　实验结果见图 9 ,当每瓶玻璃珠 10颗时粗多
糖产量最高 ,达 3.161 g/ L。液体培养时的摇床
转速 、装液量和玻璃珠的数目共同影响了培养液
中的通气状况 ,选择适当的培养条件对多糖产量
有很大的影响 。
2.4 10 L机械搅拌发酵罐发酵动态实验
　　实验结果见图 10 和 11 ,菌丝发酵开始后溶
氧持续 、明显下降 ,84 ～ 96 h 时降至最低 ,之后又
骤然上升;pH 值的变化也表现为先降后升 , 在
48 h左右最低 ,但变化范围相对较小(4.0 ～ 6.8
范围内);菌丝生物量和粗多糖积累量随发酵时
间逐渐增大 ,粗多糖积累量较菌丝生物量的增长
滞后 ,发酵时间达 60/96 h 后 ,菌丝生物量/粗多
糖积累量趋于平稳并随时间进一步延长略微下
降。由实验可知 ,现有发酵条件下美味牛肝菌在
菌丝发酵 96 h粗多糖产量最高。
图 10　pH与溶氧随发酵时间的变化
Fig.10　Changes in pH and dissolved
oxygen with incubation time
70
第 1 期 阳　飞 ,等:美味牛肝菌多糖发酵工艺的研究
图 11　生物量与多糖含量随发酵时间的变化
Fig.11　Changes in fungal biomass and polysaccharide
levels with incubation time
3　结　论
　　笔者通过正交试验得出供试美味牛肝菌的
液体培养生产菌丝体粗多糖的最适培养基配方
为马铃薯 10.0%, 蔗糖 2.0%, 蛋白胨 0.6%,
KH 2PO 4 0.3%, CaCO 3 0.2%, MgSO 4 ·7H 2O
0.2%,ZnSO 4·7H 2O 0.1%。通过单因子优化实
验得出摇瓶培养生产粗多糖的最适发酵条件 ,即
初始 pH 5.0 ～ 5.4 ,装液量 40%,每瓶加 10颗玻
璃珠 ,在温度 25 ～ 28 ℃,摇床转速 120 r/min摇
瓶培养 5 d。在实验室的10 L 机械搅拌发酵罐动
态实验表明 ,美味牛肝菌发酵产粗多糖的最适发
酵时间为 96 h 。由于美味牛肝菌尚未实现人工
栽培 ,而液体发酵培养仅需 96 h就可获得大量的
粗多糖 ,产量高 ,成本低 ,周期短 ,具有显著优势 ,
因此 ,有希望通过深层发酵的方法解决美味牛肝
菌等一些珍稀食用菌野生资源不足之矛盾 ,满足
日益增长的需求。
参考文献
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[本文编辑] 　曹　晖
Optimization o f Culture Parameters Affecting
Polysaccharide Production by a S t rain of Boletus edulis
Grow n in Submerged Cultu re
YANG Fei , ZHANG Huashan＊ , DONG Dianbo , GU Yajing
(Bioengineer ing Institute of Hubei University of Technology , Wuhan , Hubei 430068 , Chin a)
Abstract:The e ffe cts of selected cultur e par ame ters on polysacchar ide production by a str ain of Boletus edulis
ar e descr ibed.Optimal conditions for small-scale polysacch aride production in submerged f lask cultur es were
as follows:a fermenta tion medium consisting of 10% potato , 2% sucrose , 0.6% peptone , 0.10% ZnSO4·
7H2O , 0.2% CaCO3 , 0.3% KH2PO4 and 0.2% MgSO4·7H 2O , pH 5.0 ～ 5.4 , 120 r/min shaking speed ,
temperature 25～ 28 ℃, 40% medium loading r atio , 10 glass beads per flask , and a 5-day incubation per iod.
71
食　用　菌　学　报 第 16 卷
Unde r these conditions , polysacchar ide production r eached a peak of 3.161 g/ L.I n 10-L fermenter cultur es
using the same medium , pH , temperature , a 50% medium loading r atio , a similar stirr er speed , and an
aer ation r ate of 0.8 vvm , highest polysacchar ide yields were obt ained af ter four days.
Key words:Boletus edulis ;cultur e par ame ters;submerged flask culture;fermenter
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