全 文 ：书科学试验与研究
饲料研究 FEED ＲESEAＲCH NO．16，2016 1
收稿日期:2016－04－19
基金项目:2014 年辽宁省大学生创新创业训练计划资助项目
(201410160038)
第一作者:李丽，硕士，教授，研究方向为兽医药理毒理与新
兽药。
杨树花超声波提取物的抑菌作用
及对鸡源性大肠杆菌耐药性的消除作用
李 丽 周平和 唐 毓 李 慧 王金莉
锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001
摘 要 以杨树花超声波提取物为研究对象探讨其抗菌活性，观察杨树花超声波提取物对感触培养前后
鸡源性大肠杆菌耐药性的影响。采用药敏试验法测试杨树花超声波提取物对大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌和
枯草芽孢杆菌的抑菌效果，利用加有 100 μmol /L的杨树花超声波提取物溶液培养基进行感触培养，观察感
触培养前后辽宁省锦州市某养鸡场分离的致病性大肠杆菌对抗菌药敏感性的变化。杨树花超声波提取物药敏
试验结果表明:大肠杆菌对杨树花超声波提取物极度敏感(21. 17±0. 41) ，沙门菌和葡萄球菌对其高度敏感
(17. 87±0. 25和 17. 10±0. 37) ，枯草芽孢杆菌对其中度敏感(13. 03±0. 54) ;杨树花超声波提取物感触培养试
验结果表明:锦州某养鸡场鸡大肠杆菌分离株对抗菌药物的敏感性发生变化，抑菌直径扩大 0. 21～5. 60 mm，
10种抗菌药物的抑菌直径平均提高 2. 09 mm。抑菌试验结果说明，杨树花超声波提取物对大肠杆菌、沙门
菌和葡萄球菌均有明显抑菌作用，且对大肠杆菌的作用效果强于沙门菌和葡萄球菌，对枯草芽孢杆菌的作用
效果次之;耐药性消除作用试验结果说明，杨树花超声波提取物可消除鸡源性部分大肠杆菌的耐药性。
关键词 杨树花;超声波提取;抑菌作用;耐药性;鸡大肠杆菌
中图分类号:S 853. 7 文献标志码:A 文章编号:1002－2813 (2016)16－0001－04
DOI编号:10. 13557 / j. cnki. issn1002－2813. 2016. 16. 001
近年来，随着科技的发展，人们逐渐意识到化
学药品的过度使用可能会导致诸多不良后果，抗生
素的滥用会导致细菌的耐药性升高和药物残留的后
果，动物性食品安全问题亟待解决，因此，我们必
须努力开发和利用纯天然及无污染的中药材来帮助
解决这一问题［1］。杨树花为杨柳科植物毛白杨、加
拿大杨或同属树种植物的干燥雄花序，临床主要治
疗湿热下痢和幼畜泄泻等病症。杨树花含有丰富的
黄酮类化合物，来源广泛，使用成本低，能较好地
降低生产成本，无残留，病原体不产生耐药性，对
生产环境无污染，符合现代动物生产生态化健康养
殖的需要［2］。试验采用药敏试验法测试杨树花超声
波提取物对大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌和枯草芽
孢杆菌的抑菌作用，观察杨树花超声波提取物溶液
感触培养前后大肠杆菌对抗菌药敏感性的变化，为
临床选药和耐药性研究提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 试验原料
杨树花雄花序:2014年 5月采集于辽宁省锦州
市锦州医科大学校园;菌株:大肠杆菌、沙门菌、
葡萄球菌和枯草芽孢杆菌(以上均为标准菌株) ，由
锦州医科大学畜牧兽医学院动物药理实验室提供;
大肠杆菌分离株，分离自锦州某养鸡场，经锦州医
科大学畜牧兽医学院微生物学实验室鉴定确认为致
科学试验与研究
2 饲料研究 FEED ＲESEAＲCH NO．16，2016
病性大肠杆菌。
1. 1. 2 主要药品及试剂
庆大霉素饮水剂(批号 20140622) ;强力霉素饮
水剂(批号 20140724) ;硫酸链霉素(链霉素)可溶
性粉(批号 20140311);氨苄霉素钠(氨苄霉素)可溶性
粉(批号20140221);注射头孢唑啉钠(头孢唑啉) (批
号 20140511) ;阿 莫 西 林 可 溶 性 粉 剂 (批 号
20140521) ;硫酸安普霉素(安普霉素)可溶性粉剂
(批号 20141103) ;四环素可溶性粉剂 (批号
20140213) ;硫酸丁胺卡那霉素(阿米卡星)可溶性
粉剂(批号 20141012) ;氟苯尼考可溶性粉剂(批号
20140405) ;硫酸新霉素(新霉素)可溶性粉剂(批号
20140902) ;复方磺胺甲噁唑可溶性粉 (批号
20130809) ;甲 砜 霉 素 可 溶 性 粉 剂 (批 号
20140611) ;诺氟沙星饮水剂(批号 20141012)及环
丙沙星饮水剂(批号 20140504)。以上药品均由锦州
某兽药厂和天津某兽药厂提供。无水乙醇、氯化钠注
射液和盐酸等由锦州医科大学畜牧兽医学院动物药学
实验室提供。
1. 1. 3 主要仪器及材料
100 mL量筒瓶、100 mL量筒、100 mL和 500 mL
烧杯、平皿、试管、酒精灯、接菌环、玻璃棒、0～
200 μL和 0 ～ 100 μL 微量移液枪、0. 45 μm 滤膜、
FA2004N型电子天平、DHG－9245A 型电热恒温鼓
风干燥箱、KQ－300B 型超声波清洗器、YX－400B
不锈钢双层立式蒸发压力消毒器和 SW－CJ－1F型单人
双面净化工作台等由锦州医科大学畜牧兽医学院动物
药学实验室提供;药敏纸片，由上海生化试剂厂生产。
1. 1. 4 培养基
麦康凯琼脂及 MH 培养基，购自杭州天和微生
物试剂有限公司;普通营养肉汤培养基按文献［3］
方法自行配备。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 杨树花超声波提取物的制备
采用文献［4］中方法，制备杨树花超声波提取
物，备用。
1. 2. 2 培养基、药敏片和菌液的制备［5］
1. 2. 2. 1 普通琼脂培养基
蛋白胨 10、牛肉膏 5、氯化钠 5及琼脂粉 15 g，
蒸馏水 1 000 mL 放入烧杯中混合加热溶解，用
0. 1 mol /L氢氧化钠溶液校正 pH 7. 2 ～ 7. 4，加热
10 min，滤纸过滤，滤过后的肉汤须完全透明，分
装于三角瓶中，包装，于 121 ℃ 高压蒸汽灭菌
15 min，冷却备用。
1. 2. 2. 2 药敏纸片的制备
选用优质滤纸用打孔器打成 6. 00 mm直径的圆
形纸片，121 ℃高压灭菌 30 min，将制备好的滤纸
片在无菌状态下于提取物中浸泡 24 h，取出滤纸片
无菌状态下自然干燥，备用。
1. 2. 2. 3 菌液的制备
把大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌及枯草芽孢杆
菌菌种分别接种于普通肉汤中，置 37 ℃恒温培养
箱中培养 18 h，稀释 10倍，4 ℃冰箱保存备用。
1. 2. 3 体外抑菌活性的测定
将固体培养基浇定后，待其完全冷却凝固，分
别移取各菌悬液 100 μL，涂布棒涂布均匀，每平板
贴放 4片试验样片，用无菌镊子取样片贴放于平板
表面，各样品片中心相距超过 20. 00 mm，与平板
的周缘相距超过 15. 00 mm，于 37 ℃恒温培养箱中
培养 16～18 h，重复 3 组，测量并记录其抑菌圈直
径。抑菌效果判定:抑菌圈直径＞20. 00 mm 为极度
敏感，16. 00～19. 00 mm为高度敏感，10. 00～15. 00 mm
为中度敏感，抑菌圈直径＜9. 00 mm为低度敏感［6］。
1. 2. 4 鸡大肠杆菌分离株对常用抗菌药物的药敏
试验
采用 Kirby－ Bauer 试纸法［7］进行试验。直接钩
取麦康凯平板培养基上已分离典型菌落，挑取单个
菌落接种于营养肉汤培养基，37 ℃恒温培养箱中培
养 24 h。将受试菌种接种于 MH 培养基中，室温条
件静置 5 min，将药物纸片均匀贴布于培养基表面，
纸片间距不小于20. 00 mm，37 ℃恒温培养箱中培养
24 h，观察抑菌结果。重复 3次。
1. 2. 5 感触培养试验
取杨树花超声波提取物溶液，按 100 μmol /L
的浓度加入至营养肉汤培养基中，37 ℃保存，确定
无杂菌污染，12 h后用接种环钓取各分离菌，分别
接种至加有杨树花提取物溶液的营养肉汤中，37 ℃
恒温培养箱中培养 48 h。
科学试验与研究
饲料研究 FEED ＲESEAＲCH NO．16，2016 3
1. 2. 6 感触培养菌的药敏试验
使用无杨树花提取物溶液肉汤培养基平行培养
相同菌株，将各培养菌划线分别接种于 MH 培养基
中，再次重复各菌株的药敏试验，观察结果并记
录。按中国药品生物制品检定所国家抗菌药物细菌
耐药性监测中心提供标准判定细菌的耐药性［8］。
1. 2. 7 数据统计
用 SPASS 13. 0软件进行单因素方差分析(One－
way ANOVA)差异性的比较。P＜ 0. 05 表示差异显
著，数据用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2. 1 药敏试验结果
从表 1可见:8 种药物对大肠杆菌敏感性由强
到弱的顺序是:阿米卡星＞庆大霉素＞头孢唑啉＞杨
树花超声波提取物 ＞诺氟沙星＞强力霉素＞链霉素＞
氨苄霉素;对沙门菌敏感性由强到弱的顺序是:阿
米卡星＞庆大霉素＞头孢唑啉＞诺氟沙星＞杨树花超
声波提取物 ＞链霉素＞强力霉素＞氨苄霉素;对葡萄
球菌敏感性由强到弱的顺序是:头孢唑啉＞庆大霉
素＞阿米卡星＞诺氟沙星＞杨树花超声波提取物 ＞强
力霉素＞链霉素＞氨苄霉素;对枯草芽孢杆菌敏感性
由强到弱的顺序是:诺氟沙星＞庆大霉素＞阿米卡
星＞氨苄霉素＞链霉素＞杨树花超声波提取物 ＞强力
霉素＞头孢唑啉。
统计学分析结果表明，8 种药物中对大肠杆菌
的抑菌作用:杨树花超声波提取物、阿米卡星、庆
大霉素及头孢唑啉显著强于诺氟沙星(P＜ 0. 05) ，
极显著强于强力霉素、链霉素和氨苄霉素(P ＜
0. 01) ，阿米卡星、庆大霉素、头孢唑啉和杨树花
超声波提取物间差异不显著(P﹥ 0. 05) ，诺氟沙星
抑菌作用显著强于强力霉素、链霉素和氨苄霉素
(P＜0. 05) ，强力霉素、链霉素和氨苄霉素间差异
不显著(P﹥ 0. 05) ;对沙门菌的抑菌作用:阿米卡
星、庆大霉素和头孢唑啉显著强于诺氟沙星和杨树
花超声波提取物(P ＜ 0. 05) ，极显著强于链霉素、
强力霉素和氨苄霉素(P＜0. 01) ，阿米卡星、庆大
霉素和头孢唑啉间差异不显著(P＞0. 05) ，诺氟沙
星和杨树花超声波提取物作用显著强于强力霉素、
链霉素和氨苄霉素(P＜0. 05) ，强力霉素、链霉素
和氨苄霉素间差异不显著(P﹥ 0. 05) ;对葡萄球菌
的抑菌作用:头孢唑啉、庆大霉素和阿米卡星显著
强于诺氟沙星和杨树花超声波提取物(P＜ 0. 05) ，
极显著强于链霉素、强力霉素和氨苄霉素(P ＜
0. 01) ;对枯草芽孢杆菌的抑菌作用:诺氟沙星显
著强于庆大霉素、阿米卡星和氨苄霉素(P＜0. 05) ，
极显著强于链霉素、杨树花超声波提取物 、强力霉
素和头孢唑啉(P＜0. 01)。
杨树花超声波提取物对 4 种菌抑菌作用由强到
弱的顺序是:大肠杆菌(极度敏感)﹥沙门菌(高度
敏感)﹥葡萄球菌(高度敏感)﹥枯草芽孢杆菌(中
度敏感)。
2. 2 鸡大肠杆菌分离株感触前后对常用抗菌药物
的药敏试验
鸡大肠杆菌分离株，经杨树花超声波提取物感
触培养 48 h后，分离株对常用 10 种抗菌药物的药
敏试验见表 2。结果表明，10 种抗菌药物经感触培
养后其抑菌直径均有不同程度的增大，其中，阿莫
西林和环丙沙星增大幅度较大，敏感性亦发生改变
(I→S) ，其他 8种药物的抑菌直径虽有增加但敏感
性未发生改变。
表 1 杨树花黄酮类物质的抑菌效果 mm
药品名称 大肠杆菌 沙门菌 葡萄球菌 枯草芽孢杆菌
杨树花超声波提取物 21. 17±0. 41Aa 17. 87±0. 25ABb 17. 10±0. 37ABb 13. 03±0. 54Bc
庆大霉素 22. 23±0. 11Aa 20. 90±0. 31Aa 26. 13±0. 98Aa 18. 80±0. 21ABb
强力霉素 12. 47±0. 11Bc 11. 80±0. 21Bc 11. 57±0. 32Bc 10. 33±0. 15Bc
诺氟沙星 17. 63±0. 18ABb 18. 33±0. 27ABb 20. 73±0. 29ABb 21. 93±0. 15Aa
阿米卡星 23. 03±0. 36Aa 21. 37±0. 16Aa 24. 90±0. 58Aa 18. 40±0. 19ABb
链霉素 12. 23±0. 45Bc 12. 23±0. 27Bc 8. 73±0. 33Bc 14. 33±0. 11Bc
氨苄霉素 11. 47±0. 11Bc 10. 93±0. 27Bc 0. 90±0. 14Bc 17. 40±0. 12ABb
头孢唑啉 22. 07±0. 27Aa 20. 63±0. 29Aa 31. 50±0. 49Aa 1. 67±0. 40Bc
注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0. 05) ，肩标不同大写字母表示差异极显著(P＜0. 01) ，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著
(P＞0. 05)。
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4 饲料研究 FEED ＲESEAＲCH NO．16，2016
表 2 鸡大肠杆菌分离株感触培养前后对常用抗菌药物的药敏试验
抗菌药物
感触前
抑菌圈 /
mm
感触前
敏感性
感触后
抑菌圈 /
mm
感触后
敏感性
阿莫西林 18. 15±1. 02b I 21. 79±0. 55a S
安普霉素 22. 33±0. 55 S 24. 56±0. 36 S
四环素 8. 78±0. 70 Ｒ 8. 99±0. 39 Ｒ
阿米卡星 24. 67±0. 03 S 25. 67±0. 07 S
氟苯尼考 25. 23±0. 83 S 25. 56±1. 07 S
新霉素 12. 88±0. 71 I 16. 43±0. 91 I
复方磺胺甲噁唑 5. 66±0. 40 Ｒ 6. 87±0. 13 Ｒ
甲砜霉素 7. 89±0. 49 Ｒ 9. 87±0. 66 Ｒ
诺氟沙星 15. 76±0. 34 I 16. 76±0. 16 I
强力霉素 16. 25±0. 67b I 21. 85±0. 26a S
注:Ｒ 代表耐药，I代表中度敏感，S代表高度敏感;同行数据肩标
不同小写字母表示差异显著(P＜0. 05) ，肩标相同字母或无肩标表示差
异不显著(P＞0. 05)。
3 结论
3. 1 关于杨树花超声波提物的抑菌作用
通过药敏试验研究杨树花提取物对大肠杆菌、
沙门菌和葡萄球菌的体外抑菌作用，其结果判定直
观及简单。药敏试验结果说明，杨树花超声波提取
物对大肠杆菌、沙门菌和葡萄球菌等常见致病菌均
有很强抑菌作用，其作用与阿米卡星、庆大霉素和
头孢唑啉相当，可避免细菌的耐药性和药物残留出
现，有益提高动物性食品安全，具有很好的临床应
用价值。Vardanega 等［9］研究表明，杨树花作为传
统中药的一种，在很多实践工作中已经被人们所认
识，除本身的抑菌作用外还能对动物机体的免疫系
统有促进和增强的作用，因此试验为杨树花的开发
利用提供数据基础。
杨树花超声波提取物对枯草芽孢杆菌的体外抑
菌作用也进行初步探讨。枯草芽胞杆菌是芽胞杆菌
属的一种，革兰阳性需氧菌。饲料中添加枯草芽胞
杆菌可消耗动物消化道中的游离氧，营造消化道内
的厌氧环境，有利于乳酸菌包括双歧杆菌等有益菌
的生长，改善肠道微生态环境;枯草芽胞杆菌代谢
可产生多种生物酶，如蛋白酶、α－淀粉酶、纤维素
酶及脂肪酶等，在消化道中与动物体内的消化酶类
发挥协同作用，提高饲料转化率，促进动物机体生
长;枯草芽胞杆菌在生长过程中产生的多黏菌素、
短杆菌肽及枯草菌素等活性物质，对致病菌或内源
性感染的条件性致病菌均有明显的抑制作用，因此
作为微生态制剂，枯草芽胞杆菌已广泛被应用于畜
牧生产中［10］。药敏试验结果表明，枯草芽胞杆菌
对杨树花提取物中度敏感，临床应用枯草芽胞杆菌
微生态制剂时应避免与杨树花及其提取物制剂一起
使用，以免影响药效。
3. 2 鸡大肠杆菌分离株的耐药性分析
鸡大肠杆菌分离株对安普霉素、阿米卡星和氟
苯尼考高度敏感，阿莫西林、新霉素、诺氟沙星和
强力霉素中度敏感，四环素、复方磺胺甲噁唑和甲
砜霉素耐药。由此可见，锦州某养鸡场分离的鸡大
肠杆菌已对常用的抗菌药物呈现出耐药的趋势。在
养殖过程中，养殖户依靠加大药量来克服耐药性的
做法是错误的，也会给临床用药带来安全隐患。因
此在临床用药中应加强细菌耐药性的监测，同时在
药敏试验基础上，选择敏感的中草药制剂，既消除
加大用量带来的安全隐患，又发挥中草药在动物源
性食品安全生产中的优势［11－12］。
3. 3 杨树花超声波提取物对抗菌药物耐药性的消
除作用
大肠杆菌、沙门菌和葡萄球菌对强力霉素和氨
苄霉素敏感性已呈下降趋势(见表 1) ，说明常见致
病菌对强力霉素和氨苄霉素已逐渐产生耐药性。经
杨树花超声波提取物感触培养 48 h后分离株对常用
10种抗菌药物的抑菌圈直径均有不同程度的增加
(见表 2) ，平均抑菌直径提高 2. 09 mm。强力霉素
和氨苄霉素的敏感性发生改变，强力霉素抑菌圈增
加的最多(5. 60 mm) ，阿莫西林次之(3. 64 mm) ，
均由中度敏感变为高度敏感。试验结果表明，锦州
某养鸡场鸡大肠杆菌分离株经杨树花超声波提取物
感触培养后，部分耐药性消失，但经再传代后耐药性
可能重新恢复［13］，这将在后续研究中进行探讨。
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(下转第 13页)
饲料添加剂
饲料研究 FEED ＲESEAＲCH NO．16，2016 13
酸菌类微生态制剂后鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和哈
夫单位均显著提高(P＜0. 05) ，蛋黄颜色略有提高。
黄遵锡等［9］报道饲粮中添加饲用凝结芽孢杆菌的试
验组蛋鸡产不合格蛋的比例显著下降(P＜ 0. 05) ，
并且认为凝结芽孢杆菌具备芽孢杆菌属与乳酸菌类
的双重优势。试验结果显示饲粮中添加凝结芽孢杆
菌可降低蛋鸡的病死率，提高鸡蛋蛋壳厚度和蛋壳
强度，究其原因可能是凝结芽孢杆菌在肠道内和乳酸
菌一样生成乳酸等有机酸，促进钙和磷等矿物质的吸
收，提高肠道对胡萝卜素和蛋白质等营养成分的消化
吸收能力，从而改善蛋壳质量和蛋黄色泽，具体机制
有待进一步研究证实。
综合生产性能和经济效益考虑，饲粮中添加
100 mg /kg凝结芽孢杆菌制剂是较为适宜的。
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通信地址:湖北省武汉市洪山区狮子山街南湖
瑶苑 1号 430064
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
(上接第 4页)
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