全 文 ：新疆紫草素对肿瘤细胞生长抑制作用的研究
林　江 ,韩福刚1 ,王开正
(泸州医学院附属医院:检验科;　1 放射科 , 四川泸州　646000)
　　摘　要　目的:探讨新疆紫草素对小鼠胶质瘤细胞 C6 、人舌鳞癌细胞 Tca-8113 和人宫颈癌细胞 HeLa细胞的
体外生长抑制作用。方法:显微镜观察经新疆紫草素作用后细胞形态的变化;应用 MTT 法和平板克隆形成法检测
新疆紫草素对小鼠胶质瘤细胞 C6 、人舌鳞癌细胞 Tca-8113 和人宫颈癌细胞 HeLa 的生长抑制作用 。结果:新疆紫
草素对C6 、Tca-8113 和HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用。但作用方式不同 , 对 C6 和 Tca-8113主要以作用
于细胞质为主 ,细胞以坏死为主 , 而对于 HeLa细胞则主要作用于细胞核 , 引起细胞的凋亡。结论:本研究表明 , 在
体外实验中 ,新疆紫草素对小鼠胶质瘤细胞 C6 、人舌鳞癌细胞 Tca-8113 和人宫颈癌细胞 HeLa细胞 3种不同类型
的肿瘤细胞均具有明显的杀伤和抑制作用 ,表现出剂量—效应关系。待进一步研究后 ,作为抗肿瘤药物可以应用于
临床。
关键词　紫草素;MTT;平板克隆;C6 细胞;Tca-8113 细胞;HeLa 细胞
中图分类号　R73　　　　　文献标识码　A　　　　　文章编号　1000-2669(2003)02-0102-05
　　紫草在我国分布较广 ,但以新疆的紫草的质量
为好 。新疆紫草素是一种从紫草根中提取出来的一
种萘醌类化合物 。一些研究表明[ 1 , 2, 7]紫草素是抗炎
症的主要成分。紫草素对多种肿瘤 ,如小鼠腹水型
肉瘤 S180 、自发性乳腺肿瘤 、恶性葡萄胎等起抑制
作用[ 7 , 8] 。蒋英丽等[ 3] 的研究表明 ,新疆紫草素能有
效诱导人大肠癌细胞发生程序性细胞死亡(细胞凋
亡)。路桂荣等[ 7] 的研究也证明紫草素对人胃癌细
胞(BGC823)和人食道癌细胞(Ega109)具有明显的抑
制作用。但紫草素对其他肿瘤细胞的抑制作用的研
究还尚未见报道。本研究采用 3种(小鼠胶质瘤细
胞C6 、人舌鳞癌细胞Tca-8113和人宫颈癌细胞He-
La)不同种类的肿瘤细胞 ,应用形态观察 、MTT 和克
隆形成3种方法探讨紫草素对这 3种肿瘤细胞的抑
制作用和 3种肿瘤细胞之间的敏感性差异 。分析引
起肿瘤细胞生长抑制作用的可能机理。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　新疆紫草素
华西药学院提供 ,乙醇溶解 ,过滤灭菌。
1.1.2　细胞株
小鼠胶质瘤细胞 C6 、人宫颈癌细胞 HeLa 和人
舌鳞癌细胞 Tca-8113 ,三细胞株均为四川大学生命
科学院提供。
作者简介:林　江(1967-), 女 ,技师。
1.1.3　试剂
四甲基唑氮蓝(MTT)(3 , -4 , 5diemethylthiazol-
2 ,5 diphenyl tetrazolium bromide),Sigma公司产品;胰
蛋白酶(1:250)为Difco公司产品;RPMI1640为Gibco
产品;二甲亚砜(DMSO)为国产试剂;小牛血清为华
西利康公司产品。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养
细胞在含有 10%小牛血清的 RPMI1640培养液
中 ,37℃、5%CO2条件下培养 ,取对数生长期的细胞
进行实验。
1.2.2　实验分组
药物组浓度分成 0.01 、0.1 、1.0 、10.0μg ml及对
照组。
1.2.3　细胞形态的观察
用倒置相差显微镜 ,从形态学上观察药物作用
组与对照组相比较细胞形态的变化。
1.2.4　MTT法
贴壁生长处于对数生长期的细胞 ,用 0.25%的
胰蛋白酶消化成单个细胞后计数 ,调整细胞浓度为
105 ml ,接种于 96 孔板中 ,每孔 0.1ml , 24 h 后加入
药物 ,每个浓度平行接种四孔 ,分别于加药物后的第
1 、2 、3 、4 、5 、6d测定各孔的吸光值。终止实验前 4 h
加入 10μl MTT(浓度为 5 mg ml),继续培养 4 小时
后 ,弃上清液 ,加入二甲亚砜 100μl ,振荡 20 min ,使
紫色结晶完全溶解 ,用酶标仪在 570nm 处测定 OD
值 。用各组平均 OD值按下式计算细胞生长抑制
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率。
生长抑制率=(对照组 OD值—实验组 OD值
对照组OD值)×00%
1.2.5　克隆形成
克隆形成是测定单个细胞增殖能力的有效方法
之一 。单个细胞在体外持续 6代以上 ,其后代所组
成的细胞群 ,称为克隆。一般以 50 个以上细胞 ,大
小在 0.3 ～ 1.0mm , 通过计数克隆形成率 ,可对单个
细胞增殖潜力作定量分析 ,以此可以了解细胞的增
殖能力和对生存环境的适应性 。该实验常常是用来
确定抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用。本实验采用
平皿法 ,取经药物处理后的细胞经 0.25%胰酶消化
成单个细胞后计数 ,接种细胞数为 800个 皿 ,4d 以
后开始观察 ,能见到克隆后即取出 ,倒掉培养液 ,用
PBS 洗涤 2次后 ,用甲醇固定 30min ,冲洗后用 Giem-
sa染色 ,肉眼计数平皿上所见到的红色斑点(克隆),
统计分析 。
2　结　　果
2.1　形态学观察
倒置相差显微镜下观察 ,对照组的细胞生长活
跃 ,核分裂增多 ,细胞形态正常。实验组的细胞形态
变化较大 ,异型形增多 ,细胞空泡大量增多 ,细胞数
量随着药物浓度的增加和时间的延长而减少 ,培养
液中出现较多的漂浮的死细胞。其中尤以 HeLa细
胞中空泡增加明显 , C6 细胞次之 ,Tca -8113 较少 ,
但Tca-8113细胞数量减少较为明显 ,细胞出现皱
缩 ,表现多为坏死特征。C6 细胞的数量也有减少 ,
突起缩短 ,圆形细胞明显增多。经台盼兰染色发现
有空泡的细胞并没有被染上色。
图 1　药物处理后 C6 细胞的形态变化
(示形态改变及空泡)
图 2　药物处理后 Tca-8113 细胞的形态变化
(示形态改变)
图 3　药物处理后 HeLa细胞的形态变化
(示空泡)
2.2　紫草素对肿瘤细胞的生长抑制
MTT 法测得的 OD值 ,计算出药物对肿瘤细胞生长的抑制率并作图如下:
图 4　紫草素对 C6 细胞生长的抑制作用 图 5　紫草素对Tca-8113细胞生长的抑制作用
103第 2期　林　江等:新疆紫草素对肿瘤细胞生长抑制作用的研究
图 6　紫草素对 HeLa细胞生长的抑制作用
　　从 3个图中可以看出:紫草素对 3种种类的肿
瘤细胞都有较强的抑制作用。特别紫草素药物浓度
是10μg ml的实验组 ,3种肿瘤细胞的抑制率都达到
了50%以上 。
两个低浓度为 0.01μg ml 和 0.1μg ml对 C6 细
胞抑制作用 ,在 4d内的抑制在 10%以下 , 5d 抑制增
大 ,6d时抑制为 15.7%和 16.5%。药物浓度为 1μg
ml和 10μg ml时对细胞的抑制率大大增加 , 6d 分别
达到 46%和 55.8%。说明紫草素对 C6 细胞的生长
具有较强的抑制作用 。随着药物作用时间的增加 ,
抑制率也呈增加趋势(图 4)。
紫草素对 Tca-8113细胞的抑制作用 ,4个药物
浓度组都随着时间的增加而抑制率也增大 ,其中
0.01μg ml、0.1μg ml和 1μg ml三个药物组的抑制率
在30%以下 ,而 10μg ml组的抑制率大大增加达到
了53%(图 5)。
紫草素对 HeLa 细胞的抑制作用 ,在 3d前都较
为平缓 ,药物组 0.01μg ml , 0.1μg ml和 1μg ml在 4d
前抑制率基本相同 ,从 4d开始 ,1μg ml组抑制率急
剧增大 ,达到 56%基本和 10μg ml 组的抑制率(60.
9%)一样。两个低浓度药物组 0.01μg ml , 0.1μg ml
的抑制率还是较低 ,6d时还都在 20%左右 。药物作
用时间增加 ,抑制率也有增加的趋势(图 6)。
2.3　克隆的形成
药物作用后 , 3种肿瘤细胞平板克隆形成率的
结果 ,如图 7。从图中可以看出 ,C6 细胞的克隆形成
率较低 ,Tca-8113和HeLa细胞的克隆形成率较高 ,
随着药物浓度的增加 ,克隆形成率减少 ,Tca -8113
细胞的克隆形成率减少幅度要大于HeLa细胞和 C6
细胞。高浓度组与对照组克隆形成率有显著差异
(P<0.01), Tca-8113细胞的高浓度组与低浓度组
差异也显著(P <0.01),C6 细胞和 Hela 细胞高浓度
组与低浓度组差异不显著(P<0.5 ,图 7)。
图 7　C6 、Tca-8113 和HeLa细胞经药物处理后克隆形成率
说明:X 轴上的 1、2 、3 和 4 表示药物浓度 0.01μg ml、
0.1μg ml、1.0μg ml和 10.0μg ml对照组克隆形成率为:C6:
30%;Tca-811:62.2%.;HeLa:41.2%。
3　讨　　论
药物对肿瘤的治疗作用 ,其治疗后肿瘤细胞增
殖能力的变化是判断抗癌疗效及敏感性的指标之
一 。本研究所选用的指标与细胞的增殖能力有着密
切的关系。
培养细胞在正常生活状态下具有比较固定的形
态和结构 ,在倒置显微镜下可以观察到这种形态和
结构。经紫草素处理后 ,实验组的 3种肿瘤细胞都
出现比较大的形态和结构的变化 。表现在细胞生长
被抑制 、细胞数量减少 、出现空泡(3种细胞都有)、
细胞皱缩 、形态多形型增加(Tca-8113)和突起缩短
(C6)等变化 。这可能就是药物作用后引起细胞死亡
的前期征象 ,C6 和 Tca-8113经药物处理后出现较
多的细胞坏死特征 ,HeLa细胞出现的空泡较其它两
种细胞多。这可能是药物对细胞的作用点不同而造
成的差异。出现空泡的细胞经台盼兰染色后并不着
色 ,这有可能是药物引起了细胞的凋亡 ,空泡可能就
是凋亡小体 ,这还需作进一步的研究加以证实。
MTT法自 1983年 Mosmann[ 4] 首次介绍以来 ,已
广泛应用于细胞因子的生物检定 、放射敏感性测定 ,
MTT法不仅适用于检测抗癌效应细胞的细胞毒效
应 ,而且也可用于抗癌药物药敏试验[ 5 , 6] 。是一种简
便 、快速 、呈色反应可作自动测定分析的一种方法。
活细胞的线粒体脱氢酶能将染料 MTT ,转变为不可
溶性的紫色颗粒 ,这种紫色颗粒能溶解于二甲基亚
砜(DMSO)中 ,它可反映出活细胞的代谢水平 ,死亡
细胞则无此酶。
本实验结果表明 ,紫草素对 C6 、HeLa 和 Tca-
8113细胞生长都具有明显的抑制作用 ,特别是高浓
度组(10μg ml)的抑制率更大 ,都达到 50%以上 ,低
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浓度组(0.01μg ml 、0.1μg ml)的药物对细胞的生长
抑制作用要相对弱一些。但随着药物处理时间的增
加 ,抑制率也呈增长趋势 ,而且表现出剂量—效应关
系。结果表明紫草素对肿瘤细胞的生长抑制和细胞
来源 、细胞种属的差异性关系不大 ,是一种广谱的抗
肿瘤药物 ,路桂荣[ 7] 的研究表明紫草素对正常的细
胞生长未见抑制作用 ,这就为紫草素的临床应用提
供较为可靠的用药基础。但紫草素对三种细胞的作
用点不同 ,作者认为紫草素对 C6 和 Tca-8113细胞
主要作用于细胞质 ,主要引起细胞的坏死 ,从而杀死
细胞;而对于HeLa 细胞则主要作用于细胞核 ,引起
细胞凋亡 。鄂征[ 9] 的研究也证明紫草素能抑制 He-
La细胞分裂指数 ,对细胞的生长具有抑制作用 。
克隆形成率是测定单个细胞增殖潜力并作定量
分析 ,以此可以了解细胞的增殖能力和对生存环境
的适应性 。常是用来确定抗癌药物对肿瘤细胞的杀
伤作用 。本实验的克隆形成率 C6 细胞明显要比另
外两种肿瘤细胞的形成率低一些 ,这是因为在相同
时间里 C6 细胞在解除药物作用后能很快进行分裂
增殖 ,而且这种增殖速度据我们观察也比另外两种
细胞要快些 ,所以在计数克隆时由于有的克隆与克
隆之间都融合在一起 ,计数时分不清界限 ,所以克隆
数要低些。HeLa细胞形成的克隆数随着药物的浓
度的增加而减少幅度要小些 ,较为平缓 ,这可能是和
药物作用解除后 , 细胞恢复了较快增长能力有关 。
而Tca-8113细胞的形成的克隆在低浓度时较高达
50%,在高浓度时只有 11.4%,这说明紫草素对 Tca
-8113细胞有明显的抑制克隆形成的作用。
综上所述 ,新疆紫草素对 C6 细胞 、人舌鳞癌 Tca
-8113和 HeLa 细胞具有明显的杀伤和抑制作用 ,
表现出剂量 —效应关系。这种抑制作用的方式不
同 。对 C6 和人舌鳞癌 Tca-8113 可能主要以作用
于细胞质为主 ,引起细胞的坏死 ,对肿瘤细胞的作用
以降低细胞的 RNA 含量以及对癌细胞超微结构的
影响有关[ 7] 而对于HeLa 细胞 ,作者认为则主要作用
于细胞核 ,引起细胞凋亡 , 蒋丽英等[ 3] 的研究结果
也说明紫草素能诱导肿瘤细胞的细胞凋亡 。这两种
方式是新疆紫草素对三种肿瘤细胞杀伤和抑制作用
的主要原因 。
参　考　文　献
1.林志彬 , 柴宝玲 , 王　佩 , 等.紫草化学成分抗炎症作
用的研究 [ J] .北京医学院学报 , 1980;12 (2):101
2.吴葆杰.中草药药理学 [ M] .北京:人民卫生出版社 ,
1983;60～ 62
3.蒋英丽 , 宋今丹.新疆紫草素诱导人大肠癌细胞的凋亡
[ J] .癌症 , 2001;20 (12):1355
4.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and cy-
totoxicity assays [ J] , J Immunol Methods , 1983;65 (1):55
5.郝新保 , 张利朝 , 殷　缨 , 等.MTT比色法测定细胞生
长曲线 [ J] .第四军医大学学报 , 1997;18 (4):190
6.李　杰 , 刘玉琴.MTT 法在肿瘤研究中的改良及应用进
展 [ J] .中国肿瘤临床 , 1998;25 (4):312
7.路桂荣 , 廖静 、 李延钧 , 等.紫草萘醌单体分离物的抗
癌生物效应测试 [ J] .中西医结合杂志 , 1990;10 (7):
422
8.胡艳萍 , 王骏业.紫草素增加小鼠肝癌和 Lewis 肺癌放
射治疗效应的初步研究 [ J] .肿瘤防治研究 , 1991;18
(2):71
9.鄂　征 , 陈泉光 , 徐新来 , 等.组织培养技术 [ M] .
北京:人民卫生出版社 , 1988;248～ 249
(2002-05-10 收稿) 　　
STUDY OF SUPPRESSION EFFECT OF XINJIANG SHIKONIN INHIBITOR
ON THE GROWTH CANCER CELLS
Lin jiang , et al
Clinical Laboratory , Luzhou Medical College Hospital
Abstract　Objective:To evaluate the growth inhibition of Xinjiang Shikonin on C6 cells 、Tca-8113 cells and He-
La cells in vitro.Methods:Microscope was used to observe the morphological changes of cells induced by Xinjiang
Shikonin;MTT methods and colony-forming test were used to examine the growth inhibition of Xinjiang Shikonin on C6
105第 2期　林　江等:新疆紫草素对肿瘤细胞生长抑制作用的研究
cells 、Tca-8113 cells and HeLa cells.Results:Xinjiang Shikonin significantly inhibited the growth of C6 cells 、Tca-
8113 cells and HeLa cells in vitro.But with different mode of action , it impacted principally on cytoplasm cansing necro-
sis toward C6 cells and Tca-8113 cells , but it impacted principally on nucleus giving rise to apoptosis toward HeLa
cells.Conclusions:The study showed , that Xinjiang Shikonin can kill and inhibit the three types of cancer cells-C6
cells 、Tca-8113 cells and HeLa cells , and manifest dose-effect relation- ship in vitro.Xinjiang Shikonin might be
applied clinically as anti-tumor drug after further studying probably with affirmative proofs after further studying.
Key words　Xinjiang Shikonin;MTT;Clone on dishes;C6 cells;Tca-8113 cells;HeLa cells
牵引推拿治疗腰椎间盘突出伴反“S”型侧弯 1例
肖华强
(泸州医学院附属医院针炙骨伤科 ,四川泸州　646000)
　　袁余秀 , 女 、53 岁。因腰腿疼痛伴左下肢疼痛麻木 3 年
于2002年 11 月 1日前来我科就诊。入院时症见痛苦面容 ,
面色苍白晦暗 ,跛行且身体前倾 , 左足不能完全触地 , 触地则
足底疼痛。查体见腰脊柱上段向右侧明显侧弯 ,下段腰脊柱
向左侧弯 ,双髋右高左低 , L4 ～ 5旁压痛 , 深压时有向左下肢放
射感 ,直腿抬高试验(+)。且当左腿抬到 30 度时牵扯右腿
疼痛;左下肢肌肉轻度萎缩 , 左拇趾背屈减弱。跖踝时左侧
亦减弱。 X片示 , 正位:腰椎反“ S”型侧弯 , T1～ 2至 L3 向右旋
转 , L4 ～ S1段向左侧弯 , 并旋转。 L3 ～ 4椎间隙右宽左窄 , L4 左下
关节突完全与 L5 右关节面分离;L4 左下关节突与 L5 左下关
节面交锁;L5 隐裂。侧位片示腰脊柱以 L2～ 3为中心后突畸
型 , L4 ～ 5 , L5～ S1间隙狭窄 , L2 ～ 3椎体前后缘明显增生形成骨刺。
CT 示:L4 ～ 5椎间盘向左后突出 7.2 毫米 , L5～ S1椎间盘向后膨
出。
治疗方法:治疗上分步进行 , 首先应解决椎间盘突出症 ,
然后逐步矫正S 型侧弯。快速牵引治疗腰椎间盘突出:运用
三维正脊仪将患者的身高体重 、病变部位输入电脑 , 然后再
设置各种操作参数 , 具体分两步进行。 ①纵向成角牵引:先
将患者 L5 ～ S1平面固定绑缚在牵引床头胸板及臀腿板之间 ,
并设定主牵距离 50mm , 倾角 16度 , 转角 0 度臀摆 8 度 , 捆绑
力上体 、中体 、下体分别为 10 、10 、50kg , 然后双掌根重叠按压
在 L5 ～ S1 , 及 L4～ 5 , 左侧同时踩压脚踏开关进行两次纵向牵
引 ,完毕后又将 L4 ～ 5 , L3～ 4及 L2 ～ 3逐步依次固定在牵引床的
头胸板与腿板剪切处分别进行两次纵向牵拉 ,以松解整个腰
脊柱周围侧包括脊间 、脊上韧带 , 缓解竖脊肌痉挛 ,牵张各椎
间隙以初步试图平衡间隙内负压。 ②三维正脊牵引法:将臀
腿板复位至中立位 , 重新固定病员 L4～ 5平面于上下板剪切
处 ,仅将纵牢时所设数据中转角由 0 度改为向左转 23 度 , 其
余数据不变 , 进行三维牵引 ,同时配合罗氏正骨法之侧扳法 ,
即以左掌根抵压在左侧 L4～ 5棘突旁 , 辅以右手提压右髂棘与
左手形成对抗力 , 同时使牵引下板向左旋转 , 上法重复 4 次 ,
然后将 L3～ 4 , L2～ 3依次固定在上下板之间 , 以右掌根抵在其
右棘突旁 , 左手提拉左髂棘 , 启动牵引床向右旋转 4 次。 上
述方法每周 1 次 ,共 4 次。正骨法纠正腰脊柱反“S”型侧弯:
三维正脊法能迅速解决腰椎间盘突出而致的腰腿痛等坐骨
神经压迫症状 , 但不能立即完全纠正脊柱反“S”型侧弯 ,故我
们在快牵间隙期间给此患者行普通间隙 、持续牵引 , 配合正
骨手法 30 次 , 较满意解决了反“ S”型侧弯畸型 。具体方法
为:首先嘱患者俯卧于慢性牵引床 , 运用掌按掌揉法及滚法
放松椎旁肌尤其是侧弯处肌肉。然后经予 20 分钟间隙牵
引 , 待脊柱间隙及周围软组织松解后 ,改用静止牵引 ,力量以
病人能忍受为主 , 同时根据 X 线正位片及查体的见左右侧
弯顶点处(L2～ 3 , L3 ～ 4右侧 , L4 ～ 5左侧), 将右掌根抵压在 L2～ 3 ,
L3 ～ 4棘突右侧 ,左掌按拉左侧肩部向右行成对抗扳压 , 逐步
加力并持续 1 分钟 ,随后将左掌根抵压在 L4～ 5左棘突旁 , 右
掌按拉右侧肩部向左对抗约 1 分钟。上述方法即可通过外
力机械传导及椎间隙内负压吸附作用 , 使患侧交错或跳出的
小关节逐渐复位 , 左右椎间隙内压平衡 ,“S”型侧弯可逐步消
失。上述手法必须循序渐进 , 如肌肉痉挛不解除 ,椎间隙不
充分松解增宽 , 冒然用猛力 ,可致小关节突交锁加重甚至骨
折 , 故必须逐渐加力。
疗效:经过 30 次上述治疗 , 患者腰腿痛消失 ,直腿抬高
试验(一),无跛行 , 双髋等高 , 脊柱居中 , 腰脊柱前屈孤度为
80度;X片示 L2～ 3 , L3～ 4 , L4 ～ 5及 L5 ～ S1椎间隙左右基本等宽 ,
上下小关节咬合正常 , 脊柱后凸消失 , 反“ S” 型侧弯基本矫
正。
(2002-07-30收稿)　　
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Journal of Luzhou Medical College　Vol.26　No.2　2003