全 文 ：新疆紫草毛状根愈伤组织诱导及其
生长条件研究(Ⅰ)
敬碧 ,毛拉艾麦提·阿不都卡迪尔 ,王 芳 ,唐雪梅
(新疆农业大学农学院 ,乌鲁木齐　830052)
摘　要:【目的】建立以新疆紫草毛状根愈伤组织为基础的细胞悬浮体系。【方法】以新疆紫草毛状根为外植
体 ,探讨激素 、培养基 、蔗糖 、钙离子等对愈伤组织诱导 、生长的影响。【结果】MS 附加 2 , 4-D 1.0 mg/ L+KT
0.5 mg/L的愈伤组织诱导率为 100%;钙离子浓度为 250 mg/ L时的 B5+6-BA 0.1+NAA 0.5愈伤鲜重最多 ,
愈伤增殖倍数为 9.63 倍;愈伤组织在 P-1 中的生长量均较小 ,但愈伤的颜色普遍较红 , 当钙离子浓度为 250
mg/ L、P-1 附加 1.0 mg/L KT的处理愈伤最红。【结论】毛状根是诱导新疆紫草的最佳外植体。研究为利用新
疆紫草毛状根进行细胞悬浮培养提供了理论依据。
关键词:新疆紫草;毛状根;愈伤组织
中图分类号:S567.23+9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2011)07-1205-05
收稿日期:2011-05-30
基金项目:国家自然科学基金项目(30560059);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200821170);大学生创新基金项目
作者简介:敬碧(1986-),女 ,四川人 ,本科生 ,(E-mail)409071611@qq.com
通讯作者:王芳(1962-),女 ,甘肃人 ,教授 ,硕士生导师 ,研究方向为植物细胞工程 , (E-mail)wangfanghao@126.com
Xinjiang Anti-freckle Hairy Root Callus Induction
and Its Growing Conditions Research (I)
JING Bi ,Maolaaimaiti Apudikadier , WANG Fang , TANG Xue-mei
(College of Agronomy , Xinjiang Agricultural University , Urumqi 830052 , China)
Abstract:【Objective】The purpose of this program was to establish cell suspension system based on Xinjiang
Anti-freckle Hairy Root Callus.【Method】The study , by taking Xinjiang anti-freckle hairy root as explant ,
probes into the effects of hormones , culture medium , sucrose , calcium ion on callus induction and growth.【Result】
Results show that:MS , annexed with 2 , 4-D 1.0 mg/L +KT.0.5 mg/L , had 100% callus induction;and
when calcium ion concentration was 250 mg/L for the B5 +6 -BA 0.1 +NAA 0.5 callus fresh weight was the
most , and callus proliferation multiples 9.63 times;callus in P-1 were smaller , but the growth of callus color was
generally red , when calcium ion concentration was 250 mg/L , P for-1 additional 1.0 mg/L KT processing callus
was at large red.【Conclusion】This study concluded that Xinjiang hairy roots were optimal explant , which has
provided theoretical basis for cultivating cell suspension by applying Xinjiang anti-freckle hairy roots.
Key words:Arnebia euchrorna (Royle)Johnst;hairy root;callus
0　引 言
【研究意义】新疆紫草(Arnebia euchrorna (Royle)Johnst)又名软紫草 ,为紫草科多年生草本植物 ,是我
国传统紫草类植物临床药效最好的一种 ,其主要成分紫草素及其衍生物具有抗菌 、抗炎 、抗绒毛上皮癌
及恶性葡萄胎等多种生理及病理功能。临床上用于治疗肝炎 、静脉炎血管性紫癜 、银屑病 、烧伤等多种
疾病 ,同时紫草素还是世界上常用的天然植物红色素中性能最好的一种[ 1 ,2] 。由于新疆紫草的紫草素
及其衍生物含量最高 ,品质最好 ,因需求量大 ,导致大量 、无序采挖 ,其野生资源日益缺乏 。【前人研究进
展】为保护野生资源 ,维护生物多样性 ,提供稳定 、可持续利用的药材资源 ,许多研究者期望通过组织培
养 、细胞培养方法来生产紫草色素。Tabata[ 3]诱导获得了硬紫草愈伤组织。Mizukani等[ 4]研究了影响愈
伤组织生长及紫草色素形成的营养因子 ,并进行了优良细胞株的筛选 。Fujita 等[ 5]进一步优化了细胞悬
新疆农业科学　2011 ,48(7):1205-1209
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
浮培养条件 ,获得了适于紫草色素形成的 M-9培养基 。国内周立刚等[ 6]诱导得到了滇紫草愈伤组织。
李国凤等[ 7]获得了新疆紫草愈伤组织 ,并鉴定出其中含有与原植物基本一致的色素成分 。叶和春等[ 8]
进一步研究了不同理化因子对愈伤组织生长及紫草色素形成的影响。【本研究切入点】这些研究中 ,诱
导愈伤组织采用的外植体大都是紫草无菌苗的子叶 、下胚轴等 ,而目前将新疆紫草毛状根[ 9]作为诱导愈
伤组织的外植体未见报道 。【拟解决的关键问题】以新疆紫草毛状根为外植体诱导愈伤组织 ,并进行愈
伤组织生长条件研究 ,为细胞悬浮培养生产紫草素及其衍生物奠定理论基础。
1　材料与方法
1.1　材 料
新疆紫草毛状根由本课题组提供。
1.2　方 法
1.2.1　毛状根取材
挑取生长良好的在 25℃暗培养条件下的毛状根新生根。
1.2.2　培养基
(1)愈伤组织诱导培养基
MS附加 2 ,4-D(mg/L ,下同)、KT等不同浓度的激素组合。
(2)愈伤组织生长培养基
MS 、G-1 、B5 、M-9附加 KT 、6-BA 、TDZ 、NAA 、2 ,4-D等不同浓度的激素组合。
(3)不同钙离子浓度培养基
B5+6-BA 0.1+NAA 0.5培养基附加钙离子浓度分别为 150 、250 、350和 450 mg/L。
(4)不同蔗糖浓度培养基
MS+6-BA 0.1+NAA0.5培养基附加蔗糖浓度为 3%、4%、5%和6%的MS 。
将由毛状根诱导出的经过继代的生长良好的毛状根愈伤组织分别接种在上述各培养基中 ,每个处
理均为5 ～ 8瓶 ,每瓶接种 8 ～ 10块 。愈伤接种量均为 0.5 ～ 0.6 g/瓶 ,培养 20 d后称取鲜重 。
1.2.3　培养条件
除特殊说明 ,上述培养基中均添加 3%的蔗糖 、琼脂为 0.7%, pH 为 5.8 ,培养温度为(25±1)℃,暗
培养 ,继代培养 25 ～ 30 d。
1.2.4　观察统计
观察记载各处理愈伤诱导率 、增殖倍数 、愈伤颜色 、质地等生长状况。
愈伤诱导率(%)=(产生愈伤组织的毛状根块数/接种毛状根块数)×100%.
增殖倍数=培养后鲜重/接种量.
2　结果与分析
2.1　激素组合对毛状根愈伤组织诱导的影响
将生长一致的毛状根接种在表 1所列培养基中 ,培养 20 d 后 ,结果显示 ,添加 2 , 4-D均有利于诱
导愈伤 ,且质地疏松 。2 ,4-D的浓度为 1.0 mg/L 、KT 为 1.0 mg/L 时 ,毛状根的出愈率最高 ,同时随着
2 ,4-D浓度的增加 ,毛状根出愈率呈上升趋势。在MS+2 ,4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L中 ,出愈率为
100%,且出愈时间早 ,速度快 ,质地疏松 ,色泽呈淡紫色 。此外 ,在试验过程中发现老化 、过细 、过短的毛
状根均不利于出愈 ,一般以长度为 1.5 ～ 2 cm为宜 。图 1 ,表 1
2.2　培养基及激素组合对愈伤组织生长的影响
将表 1中由MS+2 ,4-D 1.0+KT 0.5及 MS+2 ,4-D 0.5+KT 0.5培养基中诱导出的愈伤组织转
接到表2所列培养基中 ,进行愈伤组织增殖培养。结果显示 ,降低 2 ,4-D浓度 ,即在 MS+2 ,4-D 0.01
+NAA 0.5的培养基上有利于愈伤组织的增殖和生长 ,增殖倍数最大为 1.5 ～ 2倍 。表 2
将表 1中由MS+2 ,4-D 1.0+KT 0.5及 MS+2 ,4-D 0.5+KT 0.5培养基中诱导出的愈伤组织转
接到G-1附加不同生长素与细胞分裂素的组合中 ,经过 20 d的培养结果显示 ,愈伤增殖倍数最大(3
倍)的处理为G-1+6-BA 0.1+NAA 0.5 ,G-1中单独添加NAA 2.0其愈伤增殖倍数可达 2.5倍 。试
验中发现有 2 ,4-D存在的情况下愈伤组织增殖倍数降低 ,表明 2 ,4-D抑制愈伤的增殖 。此外 ,经过
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继代增殖后仍可见从愈伤组织中分化出大量毛状根。图 2 ,图 3
表 1　不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
Table 1　Different hormone combination of the callus induced seaborne influence
培养基及激素组合(mg/ L)
Medium and hormone combination
接种毛状根数
Vaccination hairy
root number
出愈率(%)
Callus induction
rate
愈伤颜色
Callus color
MS+2 , 4-D 0.1+KT 0.5 80 87 灰色
MS+2 , 4-D 0.1+KT 1.0 80 89 紫色
MS+2 , 4-D 0.5+KT 1.0 79 89 白色
MS+2 , 4-D 0.5+KT 0.5 80 92 灰或紫色
MS+2 , 4-D 1.0+KT 1.0 80 96 白色
MS+2 , 4-D 1.0+KT 0.5 80 100 淡紫色
图1　毛状根诱导出愈伤组织　　　　　图 2　增殖愈伤组织　　　　　图 3　长有毛状根愈伤
Fig.1　Hairy root induce callus　　　Fig.2　Proliferation callus　Fig.3　Have long hairy roots callus
表 2　培养基及不同激素组合对愈伤组织生长的影响
Table 2　Medium and different hormone combination of callus growth impact
培养基及激素组合(mg/ L)
Medium and
hormone combination
接种愈伤块数
Vaccinat ion
callus number
愈伤组织增殖倍数
Callus proliferation
mult iples
灰白 、米白愈伤(%)
BaiYu grey
meters wound
红色愈伤(%)
Red callus
淡黄色愈伤(%)
Flaxen callus
MS+2 , 4-D 0.1+NAA 0.3 123 0.2～ 0.5 90.1 0 5.9
MS+2 , 4-D 0.05+NAA 0.3 120 1.1～ 1.3 88.4 0 7.6
MS+2 , 4-D 0.01+NAA 0.5 128 1.5～ 2.0 80.2 0.5 15.3
G-1+6-BA 0.1+NAA 0.5 126 3 / 14.2 28.5
G-1+KT 1.0+2-4D 1.0 136 1 / 0 14.7
G-1+NAA 2.0 108 2.5 / 9.2 33
MS+6-BA 0.1+NAA 0.5 98 4.75 / / /
将表 2中G-1+6-BA 0.1+NAA 0.5中生长一致的愈伤组织转接至激素组合相同(6-BA 0.1+
NAA 0.5)但基本培养基不同的MS 、B5 、G-1 、P-1等中 。培养 10 d后 ,愈伤组织开始增殖并出现点状
红色 。随着培养时间延长 ,愈伤组织生长速度加快 。培养 20 d后结果显示 ,B5培养基中的愈伤组织增
殖最快 ,是接种量的 9.03倍 ,但愈伤颜色呈灰白色 ,其次为G-1(7.93倍),而M-9 、P-1中愈伤增殖倍
数虽最小 ,但其颜色最红 。当愈伤在 P-1中培养 8 ～ 9 d后 ,愈伤组织表面开始变红 。培养 15 d后 ,愈
伤组织在 P-1的生长量虽均较小 ,但愈伤的颜色普遍较红 ,尤以 P-1+1.0 mg/L KT 的处理中最红(+
++)。因此 ,在 P-1中适当添加KT 有利于紫草素含量的提高。综上所述 , B5和G-1有利于愈伤组
织的生长 ,P-1及 M-9有利于紫草素的生成 。表 3 ,图 4 ～ 6
2.3　钙离子浓度对愈伤组织生长的影响
将来自表 3中的 B5+6-BA0.1+NAA0.5 、生长最快 、增殖倍数最大的愈伤组织转接至相同培养基
不同钙离子浓度的培养基中 ,培养 20 d后结果显示 ,愈伤组织增殖倍数随钙离子浓度增加而增加 ,当为
250 mg/L 时 ,愈伤鲜重最多 ,为9.63倍 。此时若再提高钙离子浓度 ,则生长量下降。表明较高浓度的钙
·1207·7期　　　　　敬碧等:新疆紫草毛状根愈伤组织诱导及其生长条件研究(Ⅰ)　　　　　　　　
离子对细胞生长有轻微抑制作用。表 4
表 3　基本培养基及激素组合对愈伤组织生长的影响
Table 3　Basic medium and hormone combination of callus growth impact
培养基及激素组合(mg/ L)
Medium and
hormone combination
接种量(g/瓶)
Vaccination
number
20 d后鲜重(g/瓶)
20 d fresh
weight
增殖倍数
Proliferation
multiples
愈伤颜色
Callus
color
红愈
Red
callus
B5+6-BA 0.1+NAA 0.5 0.6 5.42 9.03 浅灰 +
G-1+6-BA 0.1+NAA 0.5 0.6 4.76 7.93 无色 _
MS+6-BA 0.1+NAA 0.5 0.6 2.97 4.97 红 ++
M-9+TDZ 0.5+NAA 0.5 0.5 0.75 1.5 淡红 ++
P-1+KT 1.0 0.6 100 0.5 淡红※红※深红※更红 +++
P-1+6-BA 0.1+NAA 0.5 0.6 30 1 淡红 ++
P-1+ 0.6 90 2 淡红 ++
　　图4　淡粉红细胞团(B5)　　　图 5　粉红色细胞团(MS)　　　图 6　深红色细胞团(P-1)
Fig.4　Pale pink group ofcells(B5)　Fig.5　Pink group of cells(MS)　Fig.6　Deep red cell group(P-1)
表 4　不同浓度钙离子对愈伤组织生长的影响
Table 4　Different concentrations of calcium ion to the influence of callus tissue growth
钙离子(mg/ L)
Calcium ions
接种重(g/瓶)
Vaccination heavy(g/ flask)
20 d鲜重(g/瓶)
20 d f resh weight(g/ flask)
增殖倍数
Proliferation multiples
150 0.6 4.8 8
250 0.6 5.78 9.63
350 0.6 5.17 8.62
450 0.6 5.03 8.38
2.4　钙离子浓度对愈伤组织颜色的影响
进一步考察钙离子对愈伤组织颜色的影响。即将在生长培养基中生长一致的愈伤组织接种在生产
培养基 P-1+KT 1.0中 ,培养 20 d后 ,随着钙离子浓度的增加 ,愈伤增殖变化幅度不大 。当钙离子浓
度为 250 mg/L时 ,颜色最红 ,表明此时有利于愈伤组织中色素的形成。当钙离子浓度超过250 mg/L时 ,
颜色逐渐变浅 ,表明对细胞生长有抑制作用。表 5
表 5　不同浓度钙离子对愈伤组织颜色的影响
Table 5　Calcium ion of different concentrations of callus color effects
钙离子(mg/ L)
Calcium ions
接种鲜重(g)
Vaccination
fresh weight
鲜重(g)
Fresh
weight
增殖倍数
Proliferation
multiples
红色愈伤
Red callus
150 3.6 5.17 1.4 ++
250 3.6 3.73 1.04 +++
350 3.6 6.4 1.7 ++
450 3.6 7.15 2 +
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3　讨 论
通过细胞悬浮培养获得紫草素有两个重要环节。一是诱导形成愈伤组织并进行有效增殖 ,二是对
愈伤组织的生长速率 、生长状态 、颜色 、质地 、有效成分含量等各方面进行选择 ,筛选生长快速 、颜色深
红 、有效成分含量高的优良小细胞团进行悬浮培养 ,并进行有效增殖 ,从而为实现紫草素的生产奠定理
论基础。因此前者是关键 。在新疆紫草诱导形成愈伤组织环节中 ,所用外植体往往是种子 、茎尖 、胚轴 、
子叶 、真叶等 ,外植体不同 ,由于内源激素水平等生理方面的差异导致愈伤诱导率差异也较大。葛锋
等[ 10]以种子为外植体愈伤诱导率为 81%,子叶愈伤诱导率为 62%,叶片愈伤诱导率为 44%,根愈伤诱
导率为19%。朱军等[ 11]以根 、下胚轴 、子叶 、真叶为外植体诱导愈伤 ,愈伤诱导率为 50%左右。一般而
言愈伤诱导率越高 ,表明用于诱导愈伤的外植体比较敏感 ,将来可以源源不断地进行诱导 ,这就为以后
的生产增殖奠定了良好的物质基础 。但愈伤诱导率的高低受综合因素的影响 ,这在许多研究中已经得
到证实[ 12 ～ 15] ,包括遗传因素如外植体 ,环境因素如激素 、磁场等 。研究以新疆紫草毛状根为外植体 ,结
果表明愈伤组织诱导率均较高 ,在 87%以上 ,最高达100%,是一种愈伤组织诱导率的外植体 ,因而建立
了一种高效诱导新疆紫草愈伤组织的方法 ,可为悬浮培养奠定基础。
新疆紫草毛状根是发根农杆菌转化的结果 ,是一种生长迅速 、分支多 、在无激素培养基上能够自主 、
持续生长 、含有紫草素及其衍生物的新型资源 。由于其中含有能够合成生长素的基因 ,因而这可能就是
愈伤组织诱导率高的原因 ,但是其内源激素水平如何 ,在诱导愈伤组织中的作用机理 ,诱导愈伤及愈伤
增殖过程中仍然需要添加 2 ,4-D 、NAA等生长素 ,它与新疆紫草的子叶 、真叶 、胚轴诱导出的愈伤组织
有什么不同 ,这些将有待进一步深入研究。
4　结 论
新疆紫草愈伤组织或细胞培养物中是否含有紫草素及其衍生物以及含量的高低 ,通过愈伤组织的
表型性状即红色程度可以进行初步判断 ,在早期研究工作中不失为一种既简便易行 ,提高工作效率 ,又
节省成本的筛选方法 。
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