全 文 ：� 1356 � 中华中医药杂志(原中国医药学报)2014年 5 月第29卷第5期 CJTCMP , May 2014, Vol . 29, No. 5
两种新疆紫草细胞系紫草素生物合成关键酶
基因的表达差异分析
王升1，谢腾1,2，周良云1，吴志刚1，张燕1，陈美兰1，黄璐琦1，郭兰萍1
（1道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院中药资源中心，北京 100700；2西南交通大学生命科学与
工程学院，成都 610031）
摘要：目的：为了从遗传表达角度解析两种新疆紫草细胞系中紫草素类化合物红色系高产和白色系低产的
原因。方法：采用Real-time PCR的方法获得不同生长时期新疆紫草红色高产系和白色低产系紫草素生物合成关键
酶基因的表达规律及相对表达量差异。结果：新疆紫草红色高产系和白色低产系在不同生长时期其关键酶基因
（HMGR、PAL、4-CL、C4H、GDPS、PGT）的表达水平除个别时间段的个别基因外，红色高产系生长周期内紫
草素生物合成关键酶基因的表达量均远大于白色低产系，其中以生长旺盛的第5-17天尤为明显。在不同生长时期
其关键酶基因的表达随生长周期时间变化而波动，红色高产系中关键酶基因的表达随时间变化的曲线为倒U型，
而白色低产系中此曲线呈U型趋势。结论：新疆紫草白色低产系同样具备有合成紫草素类化合物的潜力，并且白
色系紫草素类生物合成途径的障碍发生位置应当在PGT酶促反应的下游。
关键词：新疆紫草；紫草素；生物合；关键酶
基金资助：国家自然科学基金（No.81130070，No.81072989），国家科技支撑项目（No.2012BAI29B02，
No.2012BAI28B002），2012年北京市优秀博士学位论文指导教师资助项目，科学研究和研究生培养-优秀博士论
文共建项目
Different expression of key enzyme genes involved in shikonin biosynthesis of red
shikonin-profi cient and white shikonin-defi cient cultures of
Arnebia euchroma (Royle) Johnst
WANG Sheng1, XIE Teng1,2, ZHOU Liang-yun1, WU Zhi-gang1, ZHANG Yan1, CHEN Mei-lan1,
HUANG Lu-qi1, GUO Lan-ping1
( 1State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy
of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 2College of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University,
Chengdu 610031, China )
Abstract: Objective: To Analysis the cause about high-yielding of red shikonin-profi cient line and low-yielding of white
shikonin-defi cient line in terms of genetic expression. Method: The expression diff erences of HMGR, PAL, 4-CL, C4H, GDPS
and PGT, which involved in shikonin biosynthesis, in diff erent cultures and diff erent growth stages cultured in fresh medium
were detected by Real-time PCR method. Result: It is found that the expression level of key enzyme genes (HMGR, PAL, 4-CL,
C4H, GDPS, PGT) in red shikonin-profi cient line was much higher than the white shikonin-defi ceint line mostly, except some
individual genes in the individual time periods and it was much higher especially at 5 to 17 days with vigorous growth. And the
relative expression level of genes in shikonin-profi cient and defi cient lines of A. euchroma fl uctuate over time during the growth
cycle. Separately, relative expression level of genes in red shikonin-profi cient line changed with time as an inverted U-curve, but
this curve was U-shaped in white shikonin-defi ciect line. Conclusion: It could be inferred that white line of Arnebia euchroma
had potential for shikonin synthetizing and its barriers might located at somewhere downstream after PGT enzymatic reaction of
shikonin biosynthetic pathway. This study made the foundation of gene discovering in shikonin biosynthesis pathway, as well as
molecular biology regulation of shikonin production.
·论著·
通讯作者：郭兰萍，北京市东城区东直门内南小街16号中国中医科学院，邮编：100700，电话：010-64011944，E-mail：glp01@126.com
黄璐琦，北京市东城区东直门内南小街16号中国中医科学院，邮编：100700，电话：010-64011944，E-mail：huangluqi@263.com
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新疆紫草[Arnebia euchroma（Royle）Johnst]是传
统中药材紫草（Arnebiae Radix）的重要来源，具有
清热凉血，活血解毒，透疹消斑等功效[1]。新疆紫草
的主要有效成分为紫草素类萘醌类化合物，其具有
抑制DNA拓扑异构酶[2]、抗肿瘤[3]、抗HIV活性、抗血
栓、抗生育、抗氧化、镇静、抗炎、促进伤口愈合等药
理作用[4]。另外紫草素类化合物作为一种天然色素被
誉为天然红色素之王。正是由于新疆紫草具有非常
重要的药用价值和经济价值，近年来被大量采集，加
之过度放牧和生态环境破坏等因素的影响，使本来
分布狭窄、数量稀少的新疆紫草野生资源受到了严
重破坏[5]。近几十年来，为了应对这一资源问题，国内
外学者致力于利用植物细胞培养技术生产紫草素的
研究，以期缓解野生资源的压力。本实验前期获得了
来源一致的红色高产和白色低产两中新疆紫草悬浮
细胞系，但是红色系高产和白色系低产的原因并不
清晰，而红色系高产和白色系低产的原因很可能是
研究紫草素类化合物生物合成的一把“金钥匙”。红
色高产和白色低产细胞系结合研究，不仅可以为提
高细胞培养生产紫草素类次生代化合物的产量提供
依据，还可能为紫草素及其衍生物生物合成积累及
其调控的规律研究开辟一条蹊径。本研究以新疆紫
草悬浮细胞红色高产系和白色低产系为材料，从紫草
素生物合成关键酶基因表达的角度出发，对这两种
悬浮细胞不同生长时期紫草素生物合成关键酶基因
（见图1）的表达量进行差异分析，以期在遗传表达
方面找到来源一致的两种新疆紫草细胞系中紫草素
类化合物红色系高产和白色系低产的原因，为紫草素
类化合物生物合成关键酶基因的挖掘，以及利用分
子生物学的方法调控紫草素的生物合成打下基础。
材料
1. 细胞系　新疆紫草愈伤细胞红色高产系和白
色低产系取自中国科学院植物研究所叶和春研究员
处，由新疆紫草胚轴诱导并人工筛选获得，悬浮细胞
培养体系由本实验室建立，红色高产系细胞紫草素
类含量可达到干重的6.95%，白色低产系细胞不产生
紫草素类化合物[6]。
2. 仪器　Real-time PCR仪：ABI PRISM 7700
SDS；普通PCR仪；核酸蛋白分析仪ND-1000 V3.5.2；
人工培养箱：Conviron Adaptis CMP6010；摇床：
TCYQ超大型摇床；冰箱：Haier BCD-290W；电子精
密天平：Sartorius BS 2202S；超净工作台：SW-CJ-2FD
型双人单面净化工作台；全自动高压灭菌锅：TOMY
SS -325；微波炉：格兰仕微波炉；分析型酸度计：
JENWAY 3510；其它常规组培设备。
3. 试剂　Trizol reagent（invitrogen），PrimerScript
1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），Power SYBR
Green PCR Master Mix，Ex Tag酶及其反应缓冲液，
DNAmarker，氯仿，乙醇，异戊醇，焦碳酸二乙酯
（diethylpyrocarbonate，DEPC），超纯水，琼脂糖，溴
化乙锭（ethidium bromide，EB），电泳缓冲液。培养
基母液配制所需固体无机试剂均为国药集团化学试
剂有限公司产品。
方法
1. 悬浮细胞的培养 将生长速度快，具有良好
分散性，细胞团大小均一的悬浮细胞系继代（接种
量为3g）于装有30mL改良LS液体培养基的100mL三
角瓶中，置于摇床上进行悬浮培养，摇床转速设定为
120r/min，培养温度为25℃，全天黑暗培养[7]。根据
新疆紫草细胞生长曲线，选择新疆紫草红色高产系
紫草素合成旺盛期的细胞以及接种后同一时期的白
色低产系作为实验材料，分别于继代后1、3、5、7、9、
11、13、15、17、20、22d取样，每个细胞系每个时间点
取3个重复。
2. 引物设计与合成 选择相应的基因，在NCBI
中获得此基因的已知序列，根据Real-time PCR引物
设计需满足的条件在premier 5中寻找合适的引物
对，然后合成相应的引物。
3. 总RNA的提取 总RNA的提取参照Trizol
Key words: Arnebia euchroma; Shikonin; Biosynthesis; Key enzyme
Fund assistance: National Natural Science Foundation of China (No.81130070, No.81072989), National Key
Technology R&D Program (No.2012BAI29B02, No.2012BAI28B002), Supported by Excellent Doctoral Thesis Guidance Tutors
of Beijing in 2012, Development of Scientifi c Research and Postgraduate Doctoral Thesis Cooperation Project
图1 紫草素生物合成途径简图
注：3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3 -hydroxy-
3-methylglutarylcoenzyme A reductase，HMGR）；香叶基焦磷
酸合酶（geranyldiphosphate synthase，GDPS）；苯丙氨酸解氨
酶（phenyla lanine ammonia lyase，PAL）；肉桂酸-4-羟化酶
（cinnamic acid4 -hydroxylase，C4H）；4-香豆酸-CoA连接酶
（4-coumaroyl-CoAligase，4-CL）；对-羟基苯甲酸-香叶基转移酶
（p-Hydroxybenzoate-3-geranyl transferase，PGT）。
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reagent试剂盒说明，液氮速冻并研磨新鲜新疆紫草
愈伤组织，向液氮研磨后的样品中加入1mL Trizol
reagent，混匀，静置。然后，向均一化的样品中加
入氯仿，混匀，静置，离心。吸取上层水相，并加入
0.5mL异丙醇使RNA悬浮，静置后再离心使RNA沉
淀。75%乙醇洗涤沉淀。最后加入20μL RNase-free
水溶解RNA，检测后将高质量的RNA（OD260/280=1.8-
2.2）置于-80℃冰箱保存，留用。
4. 反转录生成cDNA第一条链 利用TaKaRa的
Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit将刚从新
疆紫草细胞中提取出来的RNA进行反转录，生成单
链cDNA。20μL反应体系如下：10μL变性退火反应
（1μL Oligo dT Primer，2μL Random Primer，1μL
dNTP Mixture，1μg总RNA，5μL RNase free dH2O）；
10μL延伸反应液[4μL 5×Prime Script Buffer，0.5μL
RNase Inhibitor，Prime Script Reverse Transcriptase
（200U/μL），RNase free dH2O]。
5. 引物特异性检验 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
检测：引物合成以后根据扩增片段的长度，引物的Tm
值等设计PCR扩增的条件（优化条件）对新疆紫草红
色高产系的RNA反转成的cDNA第一条链进行普通
PCR的扩增，检查引物的特异性。Real-time PCR溶解
曲线检验：Real-time PCR后设置溶解程序，扩增反应
完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光
信号来产生溶解曲线，根据溶解曲线峰的数目和溶
解的Tm值的大小可以判断引物的扩增产物的条带数
以及是否存在引物二聚物。
6. Real-time PCR反应标准曲线 取反转录获得
cDNA模板，用连续稀释法分别依据浓度梯度（20、
22、24、26、28、210倍）稀释获得一系列相应浓度的
cDNA模板。以梯度浓度的cDNA溶液为模板，进行
Real-time PCR反应扩增，获得相应的Ct值。依据稀释
浓度及其对应的Ct值计算获得目标基因和内参基因
的标准曲线及扩增效率。以Lg（起始cDNA浓度的稀
释倍数）与Ct值之间的直线关系等式做成标准曲线。
扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增
效率（E）＝10-1/斜率。
7. Real-time PCR表达差异分析　Real-time PCR
反应条件：指定目标（HMGR，PAL，C4H，4 - CL，
GDPS，PGT）、内对照（18S RNA）和重复反应孔
（3-4）。反应体系：10μL：5μL 2×Power SYBR
Green PCR Master Mix，0.125μL Primer-S，0.125μL
Primer-A，0.25μL cDNA模板，4.5μL灭菌ddH2O。
扩增程序：酶活化（95℃，10min）→[变性（95℃，
15sec）→退火/延伸（60℃，60sec）]40 cycle，反应结
束后添加溶解曲线设置。基因表达差异计算：本实
验数据结果采用相对定量表达分析，进行相对基因
表达分析普遍采用2-△△Ct法[8-10]。
8. 统计学方法 实验结果使用Excel 2010和SPSS
17.0进行数据分析。相关分析使用单因素方差分析，
多重比较使用Duncan多重比较分析法（DMRT）。7500
Software v2.0.1用于Real-time PCR结果分析。
结果
1. Real- t ime PCR引物设计 依据新疆紫草
H M G R、PA L、C4 H、4 - C L、G D P S、P G T以及18S
RNA的cDNA序列，设计并合成了新疆紫草紫草素类
化合物生物合成过程中的相关基因cDNA扩增特异性
引物（见表1）。HMGR、PAL、C4H、4-CL、GDPS、
PGT为紫草素合成过程的相关基因，有研究表明[12]
这些基因的表达量与紫草素类化合物的合成显著相
关。紫草素新疆紫草18S RNA作为RNA差异表达的内
参基因。
目标基因 引物名称 Tm值 片段长度
HMGR 5’-3’GGC TAC TAC CGA AGG GTG C 57.2 130
3’-5’GGT GCC AAA CCT CAC GAC A 59.5
PAL TGG CTC GGT CCT CTT ATT GA 58.1 141
AAT AGG CGT GCC CTG GAA 58.6
4-CL AGG AGC ATG TGG TAC AGT CGT TA 59.1 65
AGA CAC CAG TTT CGG TAT CTA TGA 57.7
C4H CGT CGT TTC GTC CCC TGA T 60.4 115
CAT GTC TTG TCC TTT ACC TGT GA 57.1
GDPS GCG GGG AAG GAT GTG GTA 58.5 203
AAA TGG AAG GGG AGC GAA T 58.6
PGT GTC CAA GCA AGC ACA GCA G 57.2 214
CCA AAC TGC CCA CCA TCC 58.8
18S TGT TGG ATG TGG TGG ATT GTG 59.4 176
AAC GAA CGA GTT GGA AAG CA 58.3
表1 Real-time PCR引物列表
2. Real-time PCR引物特异性评价 琼脂糖凝胶
电泳检测：以cDNA为模板，设计的目的基因引物，
在优化条件下进行普通PCR特异性扩增，PCR产物
电泳后凝胶结果如图2。HMGR、PAL、C4H、4-CL、
GDPS、PGT以及18S在上述体系下扩增，能获得单一
特异条带，且条带的长度（bp数）与原设计相符，确
定无非特异性扩增。
溶解曲线检测：溶解曲线所示，HMGR、PAL、
C4 H、4 - CL、G D P S、P G T以及18S，均只有1个单
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3. Real-time PCR扩增效率评价 Real-time PCR
所用引物的扩增的标准曲线、扩增效率及Ct值范围
如表2所示。其中HMGR、PAL、C4H、4-CL、GDPS、
PGT以及18S的扩增效率基本接近90%-105%的区
间，可以2-△△Ct法进行基因表达量差异倍数的计算。
其中PAL可能由于扩增效率太低，无法通过这种方
法获得相应的标准曲线，不能准确定量。前文所述，
PAL的Real-time PCR扩增反应为特异性扩增，所以
虽然2-△△Ct法不能对其进行基因表达量差异倍数的
准确相对定量，但是也能代表其差异表达的趋势。
图3 不同生长时期新疆紫草红色高产系和白色低产系紫草素
生物合成过程关键酶基因HMGR、PAL、4-CL、C4H、GDPS、
PGT相对表达
注：W. 白色低产系组；R. 红色高产系组。18S为内参基因；白
色低产系15d样本为校准样本。横坐标为红色高产系和白色低产
系继代到新鲜的培养基中后的生长时间；纵坐标为目标基因的表
达量相对于第15天白色低产系相应的基因表达量的倍数的10的对
数即log10（相对表达水平），其中白色低产系15d的基因表达量为
log10(1)=0。原代于生长第15天进行继代，即原代第15天为子代的第
0天。误差线为SE。
图2 特异性扩增电泳图
HMGR PAL 4-CL C4H GDPS PGT 18S M
2 000bp
1 000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
峰，单峰的Tm值分别为：HMGR，80.24℃；PAL，
78.35℃；4 - CL，73.24℃；C4H，77.22℃；GDPS，
79.49℃；PGT，80.81℃；18S，81.38℃。
基因 扩增曲线 R2 扩增效率 稀释梯度 Ct范围
HMGR Y=-2.988X+35.547 0.9738 2.16 4倍 16.9-33.9
4-CL Y=-4.0199X+34.311 0.9995 1.77 4倍 22.3-34.4
C4H Y=-3.5536X+27.004 0.9991 1.91 4倍 16.4-27.1
GDPS Y=-3.224X+33.322 0.9985 2.04 4倍 23.8-33.4
PGT Y=-3.514X+31.18 0.9986 1.93 4倍 18.7-31.4
18S Y=-3.6876X+23.595 0.9958 1.87 4倍 12.8-24.0
表2 Real-time PCR所用引物的扩增曲线及扩增效率
4. 紫草素生物合成过程关键酶基因表达差异分
析 不同生长时期新疆紫草红色高产系和白色低产
系紫草素生物合成过程关键酶基因HMGR、PAL、
C4H、4-CL、GDPS、PGT相对表达结果如图3所示，
不同生长时期两种细胞系中紫草素相关基因的表达
都大不相同，随时间不断变化。
如图3黑/灰色柱状图所示，不同生长时期红色高
产系中HMGR、PAL、C4H、4-CL、GDPS、PGT基因
的表达随时间表现出一致的规律（倒U形），在生长
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比较旺盛的5-17d基因的表达也处于比较高的水平，
其余时间表达表达量较少，C4H则在整个生长时期
相对平稳的表达。具体而言，红色高产系与白色低产
系中GDPS表达量差异最小（3倍以内的差异），其次
是PGT（10倍以内的差异），PAL和4-CL较大（可达
到10-100倍），HMGR和C4H中的表达量差异最大，
红色高产系与白色低产系的某些生长时期可达到超
过100倍的表达差异。整体而言，不同基因的表达随
时间变化的规律虽然均为倒U型，但不同的基因分
别于不同的生长时期达到表达最高峰，HMGR于第9
天，PAL、4-CL于第5天，GDPS于第7天，PGT于第15
天达到生长周期内表达的最高值。
如图3白色柱状图所示，不同生长时期白色低产
系中HMGR、PAL、C4H、4-CL、GDPS、PGT基因的
表达随时间表现出一致的U形变化规律（PAL出现W
型的变化），在刚继代到新培养基中的前几天和细胞
进入生长平台期后的几天，如3d前和17d后，白色低
产系中紫草素相关基因的表达相对5-17d都急剧的上
调，表达量甚至高于相应时间点红色高产系中相关
基因的表达，这些时间段白色低产系次生代谢相关
基因的高表达可能与细胞本身对新环境或者不利环
境的适应有关。同时不难发现，白色低产系第22天的
各相关基因的表达都出现异常增高，这可能与白色
低产系细胞在第22天时自身正处于开始大量衰老死
亡的状况有关，此时可能次生代谢相关基因已经开
始异常表达。
红色高产系与白色低产系相比较，不同生长时
期红色高产系中紫草素合成相关基因HMGR、PAL、
C4H、4-CL、GDPS、PGT的表达大多都显著高于白
色低产系，生长旺盛的5-17d内尤为明显。同时，红色
高产系和白色低产系中紫草素相关基因的表达差异
随时间变化波动较大，不同生长时期两种细胞系中
紫草素合成相关基因的表达差异不同。
讨论
本研究建立了一套HMGR、PAL、C4H、4-CL、
GDPS、PGT等6个基因的实时Real-time PCR的方法，
并对其进行了详细的方法学考察。利用建立的方法获
得了红色高产系和白色低产系之间不同生长时期紫草
素合成关键酶基因的相对表达的差异，首先，除个别
时间段的个别基因外，红色高产系中紫草素生物合成
关键酶基因的表达量均远大于白色低产系，这与红色
高产系和白色低产系中的次生代谢化合物差异完全
一致[6]；其次，红色高产系和白色低产系在不同生长时
期其关键酶基因的表达随时间变化的波动较大，红色
高产系中关键酶基因的表达随时间变化的曲线呈倒U
型，白色低产系中此曲线则呈U型趋势。
HMGR、PAL、C4H、4 - CL、GDPS、PGT 6个基
因分别为紫草素生物合成途径的MVA途径和PP途径
的关键酶，以及两个途径的连接转移酶的基因，与
紫草素的生物合成密切相关[11-12]。研究发现，黑暗和
M9生产培养基均可在6h内有效的诱导PAL、4CL、
HMGR、PGT等基因的转录表达，与紫草素的诱导
积累一致[13]。另有研究发现，在NO诱导调控滇紫草
悬浮细胞中紫草素类化合物的形成过程中，PAL、
PGT、HMGR的表达显著上调[9]。整体而言，红色高
产系中关键酶基因的表达量显著高于白色低产系，
这与两种细胞系中紫草素类化合物的积累有关。然
而，在无紫草素类化合物产生的白色低产系中也同
样能检测到这些紫草素生合成相关基因的表达，可
见白色低产系具备合成紫草素类化合物的潜力，同
时，白色系紫草素类生物合成途径的障碍发生位置
应当在PGT酶促反应的下游。
红色高产系和白色低产系的生长和紫草素积累
的动力学研究中发现，新疆紫草红色高产系细胞增
长速率的变化趋势与紫草素类化合物的含量变化
趋势恰好相反，认为新疆紫草悬浮细胞的生长和紫
草素合成呈非生长偶联型，新疆紫草悬浮细胞红色
高产系生物量快速增长时不利于紫草素的合成与积
累[6]。这一规律与白色低产系中紫草素生物合成关键
酶基因的表达相吻合，但是与红色高产系中紫草素类
化合物的生物合成关键酶基因的表达相反，即生长
期内红色高产系细胞增长速率的变化曲线与紫草素
合成关键酶基因的表达变化曲线相一致，但是与紫
草素类化合物的积累的变化曲线不同。因此，新疆紫
草红色高产系细胞的生长与紫草素生物合成关键酶
基因呈生长偶联型，而白色低产系细胞的生长与紫草
素生物合成关键酶基因呈非生长偶联型，导致这种
区别的原因尚有待研究。
参 考 文 献
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白术提取物对IEC-6细胞迁移过程多胺信号通路
钙离子调控的影响
宋厚盼，李茹柳，王一寓，曾丹，张磊，邓娇，陈炜璇，陈蔚文
（广州中医药大学脾胃研究所，广州 510405）
摘要：目的：考察白术提取物（AMK）对小肠上皮IEC-6细胞迁移过程多胺介导信号通路中钙离子调控的
影响，探讨白术促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法：在刀片划痕法细胞迁移模型上观察白术提取物对细
胞迁移的影响；流式细胞仪检测细胞质游离钙离子水平 ( [Ca2+]cyt )；荧光定量PCR法检测钙通道蛋白瞬时受体
电位阳离子通道1（TRPC1）mRNA表达；Western Blot法检测TRPC1蛋白表达。结果：①白术提取物（100mg/L
和200mg/L，下同）能促进IEC-6细胞迁移、增加[Ca2+]cyt、提高TRPC1 mRNA和蛋白表达（P<0.05，P<0.01）。
②白术提取物可逆转多胺合成抑制剂（DFMO）所致的细胞迁移抑制、[Ca2+]cyt降低、TRPC1 mRNA和蛋白表达
降低（P<0.01）。③若去除了细胞外的Ca2+（使用无Ca2+培养液），则不但空白对照组出现显著的细胞迁移抑制
（P<0.01），且白术提取物促进细胞迁移的作用程度也明显弱于使用含Ca2+培养液时（P<0.01）。结论：白术提
取物促进小肠上皮细胞迁移的作用与影响多胺介导信号通路中钙离子调控有关，主要作用途径可能是通过促进细
胞外Ca2+内流而增加[Ca2+]cyt，另一较弱的作用途径可能是增加细胞内钙库释放Ca2+。
关键词：白术；多胺；细胞迁移；细胞质游离钙离子；瞬时受体电位阳离子通道1
基金资助：国家自然科学基金项目（No.30772753，No.81173254），广州中医药大学中医内科学特色重点学
科建设项目（财教[2010]353号）
·论著·
通讯作者：李茹柳，广州市机场路12号广州中医药大学脾胃研究所，邮编：510405，电话：020-36585444，E-mail：lrl@gzucm.edu.cn