全 文 ：编码大陆株日本血吸虫天冬酰胺
肽链酶 cDNA的克隆及其在 BALB /c小鼠体内的表达*
同济医科大学寄生虫学教研室 武汉 430030 李传明 石佑恩
血吸虫成虫 31 /32 kDa蛋白除具有公认的免疫学诊断
价值外 ,作为疫苗抗原的候选分子也有潜在价值 [1]。 我们对
编码大陆株日本血吸虫 32 kDa天冬酰胺肽链酶 ( Sj 32)进行
了克隆、测序鉴定、构建真核表达载体 ,并在小鼠骨骼肌细胞
得到表达 ,为该抗原的 DN A疫苗研究打下了基础。
材料与方法
Sj 32 cDNA的克隆、鉴定
日本血吸虫成虫 RN A的分离纯化 , cDN A合成等参见
文献 [2 ]。 根据文献 [3]报道的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,
P1: 5’ -CTCGGATCCAAGAGAAATAATGTTT TAT TC-3’
P2: 5’ -CGCAAGCT TGAATT ATT TTAAC TTAACCGCA
-3’ , P1和 P2分别在其 5’端设有 BamHI和 HindⅢ酶切位点 ,
常规 RT-PCR制备 Sj32编码区 cDN A。 PCR产物经 BamHI
和 HindⅢ 双酶切后 ,在 T4 DN A连接酶作用下 ,克隆到
pBluescript,构建重组 p Sj 32,转化大肠杆菌 TG1,酶切图谱
法筛选鉴定阳性克隆 ,并采用 DN A测序酶 2. 0版试剂盒
( USA ) ,对 Sj 32 cDNA进行核苷酸序列测定。
真核表达载体 PCD-Sj 32的构建
另设计一条 5’ 端带 XbaI酶切位点的引物 P3: 5’ -
C TCTCTAGAGAATTAT TT TAACT TAACCGCA-3’ , 与
P1一起以 p Sj 32为模板 ,扩增出 Sj 32cDN A,经 BamHI和
Xba I双酶切后 ,亚克隆入 PCD载体 ,构建重组真核表达载
体 PCD-Sj 32,常规转化、筛选、鉴定阳性克隆。
Sj 32在小鼠骨骼肌细胞的表达及检测
将制备纯化的 PCD-Sj 32溶于无菌生理盐水 ,调整浓度
为 1μg /μl,取 50μl直接注射于 5 w k龄雄性 BALB /c小鼠
股四头肌 ,做好标记 , 10 d后处死小鼠 ,取注射部位肌肉进行
冰冻切片。多聚甲醛固定切片 , PBS洗 3次 ,每次 3 min,加抗
Sj 31 /32的 McAb在室温下孵育 1 h或 4℃过夜。 PBS洗 3
次后 ,加 F ITC标记的羊抗鼠 Ig G室温下孵育 1 h, PBS洗涤
后 ,吹干 ,滴加甘油封片 ,荧光显微镜下观察结果。
结 果
重组 DNA pSj 32的构建及鉴定
用 1μg血吸虫成虫的总 RN A,在逆转录酶作用下 ,合
成 cDNA第一链 ,采用 RT-PCR方法成功扩增出 1 312 bp
的 Sj 32编码区 cDNA。重组 pSj 32测序结果 ,在 cDN A编码
区 5’ 端可见 ATG起始密码子及其前面的 BamHI位点 ,在
3’ 端可见 TAA终止密码子及其后面的 HindⅢ位点 ,均与预
期结果一致。
真核重组表达载体 PCD-Sj 32的鉴定
PCD-Sj 32经 BamHI和 XbaⅠ 双酶切后可得到 1 312
bp的 Sj 32cDN A片段。 以该重组 DN A为模板进行 PCR扩
增 ,可得到以 cDN A为模板同样大小的 DNA片段。
Sj 32在小鼠骨骼肌细胞的表达
免疫组化结果显示 Sj 32能在小鼠体内表达 ,表达产物
主要见于骨骼肌细胞胞浆内 ,在肌细胞间也可见到表达产
物。 空白载体和生理盐水对照组均未见阳性表达产物。
讨 论
过去认为 Sm 32即血红蛋白酶 ,现发现具有血红蛋白酶
活性的是 Sm31 [4]。 Sm32与编码豆荚天冬酰胺肽链酶的 cD-
N A具有同源性。因此 ,血吸虫的 32 kDa蛋白应为天冬酰胺
肽链酶 ,归类于新的半胱氨酸家族。 该酶主要作用于天冬酰
胺残基的羧基端肽链 [5]。该酶在血吸虫生活史中的重要生物
学功能有待进一步阐明。
参 考 文 献
1 沈淀文 ,李雍龙 ,韩定俊 ,等 .日本血吸虫成虫 31 /32 kDa蛋白的
纯化及保护性免疫力的研究 .中国寄生虫学与寄生虫病杂志
1993; 11∶ 241～ 243
2 李传明 ,石佑恩 .日本血吸虫大陆株 26 kDa谷胱甘肽 S-转移酶
编码区基因的克隆及序列测定 .寄生虫与医学昆虫学报 1997;
4∶ 6～ 11
3 M erck elbach A, Has se S, Del l R, et al. cDNA sequences of Schis-
tosoma japonicum coding for tw o cathepsin B-like proteins and
Sj32. Trop M ed Parasitol 1994; 45∶ 193～ 198
4 Gotz B, Klin kert MQ. Expression and partial characteri zation of a
cath epsin B-like enzyme ( Sm31 ) and a proposed ` haemoglobi-
nase’ ( Sm 32) . Bioch em J 1993; 229∶ 801～ 806
5 Dal ton JP, Hola-Jam riska L, Brindley PJ. Asparaginyl endopepti-
dase activi ty in adul t S ch istosoma mansoni . Parasi tology 1995;
111∶ 575～ 580
6 李传明 ,石佑恩 .日本血吸虫 26 kDa谷胱甘肽 S-转移酶 DN A疫
苗的研究及其保护性免疫效果观察 .中国寄生虫病防治杂志
1998; 11∶ 207～ 211
* 此研究项目获卫生部总理基金资助 ( No. 94-y-19)
1997年 3月 27日收稿 1998年 8月 20日修回
(编辑: 任燕芬 )
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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1999; 17( 3)∶ 190
Chinese Journa l o f Par asito lo gy and Pa rasitic Diseases