全 文 : 张璞 等/真菌诱导子与吸附树脂对新疆紫草毛状根中萘醌积累的影响
Chinese Journal of Biotechnology February 25, 2013, 29(2): 214−223
http://journals.im.ac.cn/cjbcn ©2013 Chin J Biotech, All rights reserved
Received: September 22, 2012; Accepted: November 19, 2012
Supported by: Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region of China (No. 200821170).
Corresponding author: Fang Wang. Tel: +86-991-8762261; E-mail: Wangfang1hao@126.com
新疆维吾尔自治区自然科学基金 (No. 200821170) 资助。
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生 物 工 程 学 报
真菌诱导子与吸附树脂对新疆紫草毛状根中萘醌积
累的影响
张璞,王芳,朱查山
新疆农业大学农学院,新疆 乌鲁木齐 830052
张璞, 王芳, 朱查山. 真菌诱导子与吸附树脂对新疆紫草毛状根中萘醌积累的影响. 生物工程学报, 2013, 29(2): 214−223.
Zhang P, Wang F, Zhu CS. Influence of fungal elicitor and macroporous resin on shikonin accumulation in hairy roots of
Arnebia euchroma (Royle) Johnst. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 214−223.
摘 要 : 通过考察真菌诱导子与吸附树脂对新疆紫草毛状根中萘醌积累的影响,获得真菌诱导子与吸附树脂
对萘醌类物质积累的最佳处理,为规模化生产提供依据。以新疆紫草毛状根为试验材料,将黑曲霉、米曲霉诱
导子及其混合诱导子、大孔吸附树脂添加到 M-9 培养基中,采用分光光度法测定毛状根总萘醌含量。试验结
果表明:在毛状根培养 10 d时以 2.5∶50的比例添加混合诱导子,总萘醌含量是对照的 2.28倍;在此结果基
础上,在培养第 0天添加大孔吸附树脂 NKA-9,总萘醌含量最高是对照的 3.71倍;黑曲霉诱导子与米曲霉诱
导子有协同效应;在生物反应器中添加混合诱导子及大孔吸附树脂 NKA-9,其总萘醌含量是对照的 4.17 倍。
米曲霉诱导子、混合诱导子对毛状根增殖有促进作用;同时添加大孔吸附树脂 NKA-9 及混合诱导子能提高毛
状根总萘醌含量。生物反应器培养毛状根为今后利用新疆紫草毛状根规模化生产总萘醌提供了理论参考。
关键词 : 新疆紫草,毛状根,总萘醌,真菌诱导子,大孔吸附树脂
Influence of fungal elicitor and macroporous resin on
shikonin accumulation in hairy roots of Arnebia euchroma
(Royle) Johnst
Pu Zhang, Fang Wang, and Chashan Zhu
College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China
Abstract: In order to investigate the effects of fungal elicitor and macroporous adsorption resin on shikonin accumulation
组织工程与细胞培养
DOI:10.13345/j.cjb.2013.02.006
张璞 等/真菌诱导子与吸附树脂对新疆紫草毛状根中萘醌积累的影响
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in hairy roots of arnebia euchroma (Royle) Johnst, we used spectrophotometry to determine the total naphthoquinone
content of the hairy roots, by adding different volume ratio of Aspergillus niger elicitor, Aspergillus oryzae elicitor, and the
macroporous resin into the M-9 liquid medium at different culture time. The results show that the total naphthoquinone
content was 2.28 times higher than the control when we added mixed elicitors of Aspergillus niger and Aspergillus oryzae
at the ratio of 2.5:50 in the 10th day of hairy roots cultivating. The total naphthoquinone content was 3.71 times higher than
that of the control, when we added macroporous adsorption resin NKA-9. Aspergillus niger elicitor exhibited synergistic
effect with Aspergillus oryzae elicitor to enhance the naphthoquinone. Also, the total naphthoquinone level was 4.17 times
higher than that of the control by adding mixed fungal elicitor and macroporous adsorption resin NKA-9 in the bioreactor.
Aspergillus oryzae and mixed elicitor could promote the hairy roots proliferation, and macroporous adsorption resin NKA-9
and mixed elicitor increased the total naphthoquinone content. In summary, the measure developed for Arnebia euchroma
(Royle) Johnst hairy roots cultivating in bioreactors may potential for large-scale production of naphthoquinone.
Keywords: Arnebia euchroma (Royle) Johnst, hairy roots, shikonin, fungal elicitor, macroporous adsorption resin
新疆紫草 Arnebia euchroma (Royle) Johnst
是我国传统药用紫草类植物中临床药效最好的
一种[1-2],主要化学成分为萘醌类色素、多糖及
脂肪酸,具有抗生育、抗炎、抗肿瘤、杀菌、抗
病毒和免疫调节等作用[3]。由于多年的滥采滥挖,
新疆紫草野生资源日益减少,造成目前市场供不
应求的局面,给临床使用、中成药加工等带来很
大影响。毛状根是利用发根农杆菌 Ri 质粒诱发
的结果,具有生长迅速、分支多,在无激素培养
基上能够自主、持续生长,有效成分高且含量稳
定的特性,是大量生产药用植物有效成分的新方
法。新疆紫草毛状根[4]提取物具有抑菌[5]、抗氧
化[6]作用,可作为原料进行开发利用。因此,对
新疆紫草毛状根的培养条件进行研究具有重要
的现实意义。研究表明真菌诱导子能够促进和提
高紫草细胞[7-11]的萘醌含量,刘长军等[12]在新疆
紫草细胞培养中添加真菌诱导子,发现黑曲霉诱
导子促进紫草素合成效果最好,并且能够促进细
胞紫草素的外排。傅旭庆等[13]在紫草细胞培养
中,加入米根霉粗提物可显著提高紫草宁色素产
量,并可加快胞内色素分泌到培养液中的速率和
数量。大孔吸附树脂具有较强的吸附能力,能够
减弱对次生代谢物反馈抑制作用。罗雪梅等[14]
在硬紫草细胞培养中添加大孔吸附树脂,发现其
对紫草素具有良好的吸附能力,可用于细胞培养
中紫草素的提取。吴频梅等[15]采用大孔吸附树脂
吸附分离藏红花培养液中藏红花苦素,认为方法
可行,前景广阔。目前还未见到大孔吸附树脂及
真菌诱导子用于新疆紫草毛状根的研究报道。本
研究主要考察了真菌诱导子与大孔吸附树脂的
添加时间、添加量对毛状根的增殖及总萘醌的积
累,对生物反应器放大培养新疆紫草毛状根进行
了初探,旨在为新疆紫草毛状根的规模化生产提
供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料与菌株
新疆紫草毛状根[4]由本课题组提供;黑曲霉
Aspergillusniger与米曲霉 Aspergllus oxyzae由新
疆农业大学农学院病理实验室提供。
1.1.2 培养基及试剂
SH培养基[16],M-9培养基[16],PDA马铃薯
真菌培养基,NKA-9 大孔吸附树脂 (日本三菱
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产),丙酮,无水乙醇、4% NaOH和 5 mol/L HCl
溶液等。
1.1.3 主要试验仪器
721-型紫外分光光度计 (武汉爱斯佩科学仪
器有限公司),高压灭菌锅 (上海博迅实业有限公
司 ),超净工作台 (苏州净化 ),微量移液器
(DRAGONMED PROLINE) , 电 子 天 平
(METTLER TOLEDO),温控气浴摇床 (金坛市
精达仪器制造有限公司),电热鼓风干燥箱 (上海
博迅实业有限公司),循环水式多用真空泵 (郑州
长城科工贸有限公司),2 L 气升式生物反应器
(购于中国科学院过程工程研究所)。
1.2 方法
由于紫草素及其衍生物的合成呈非偶联型,
即紫草素及其衍生物是在毛状根生长停止后才
进行合成的,因此,新疆紫草毛状根的液体培养
采用“二阶段培养法”:第一阶段以毛状根生物
学产量的增殖为目的,第二阶段以毛状根生产紫
草素及其衍生物为目的。具体参见芦苇华等[16]
的方法。
1.2.1 毛状根扩繁
将 2~4 cm的毛状根接种在装有 50 mL SH培
养基的 250 mL 锥形瓶中,蔗糖 30 g/L,肌醇
1 g/L,水解酪蛋白 0.5 g/L。培养液 pH 5.8,在
20~25 ℃,摇床速度 (100±10) r/min,暗培养条
件下进行振荡培养 15 d收获,备用。
1.2.2 毛状根生产阶段
将 1.2.1 培养的毛状根接种在装有 100 mL
M-9培养基的 250 mL锥形瓶中,接种量 2 g/瓶,
培养基 pH 5.8,蔗糖 30 g/L。在 20~25 ℃、摇床
转速为 (100±10) r/min下暗培养。培养25 d收获,
灭菌吸水纸吸干其表面水分,称重,计算毛状根
增殖倍数。增殖倍数=(M2−M1)/M1,M1为接种时
毛状根鲜重,M2为培养一定时间后毛状根鲜重。
提取毛状根总萘醌并测定 A516,计算其平均含量。
每个处理 3次重复,计算平均值。
1) 真菌诱导子添加量摇瓶试验。在接种时,
分别将米曲霉、黑曲霉按照诱导子匀浆液/M-9
培养基体积比为 0.5 mL∶50 mL、1 mL∶50 mL、
1.5 mL∶50 mL、2 mL∶50 mL和 2.5 mL∶50 mL
的梯度比例添加至 M-9培养基中,不添加真菌诱
导子为对照 (CK),对照同样分做两组,用于确
定未处理同批接种物之间是否存在差异。
2) 真菌诱导子添加时间摇瓶试验。将黑曲
霉按照诱导子匀浆液 /M-9 培养基体积比为
1.5 mL∶50 mL添加。混合曲霉诱导子按照 (米
曲霉诱导子匀浆液+黑曲霉诱导子匀浆液)/M-9
培养基体积比为 (1+1.5) mL∶50 mL添加。添加
时间梯度为培养 0 d、5 d、10 d、15 d和 20 d。
3) 大孔吸附树脂 NKA-9添加量摇瓶试验。
按照质量梯度 2 g/瓶、4 g/瓶和 6 g/瓶添加大孔吸
附树脂 NKA-9于 M-9培养基中。混合曲霉诱导
子按照 (米曲霉诱导子匀浆液+黑曲霉诱导子匀
浆液)/M-9 培养基体积比为(1+1.5) mL∶50 mL
在培养 10 d添加。
4) 真菌诱导子和大孔吸附树脂的反应器试
验。将毛状根接种在装有 1 700 mL M-9培养基
的 2 L气升式反应器中,培养基 pH 5.8,培养温
度 20~25 ℃,通气量 0.4 vvm,接种量 90 g,培
养第 0 d加入 51 g活化好的吸附树脂 NKA-9。
混合曲霉诱导子按照 (米曲霉诱导子匀浆液+
黑曲霉诱导子匀浆液 )/M-9 培养基体积比为
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2.5 mL∶50 mL、培养 10 d添加 (依据真菌诱导
子添加量摇瓶试验结果)。不添加为对照 (CK)。
暗培养 25 d 收获,称重、计算增殖倍数,测定
A516,计算总萘醌含量。
1.2.3 真菌诱导子制备
刮取米曲霉、黑曲霉少量孢子分别接种于
PDA 真菌液体培养基中,在 25~26 ℃、
(120±5) r/min、暗培养 5 d 收获菌球,将菌球用
蒸馏水充分洗涤后,匀浆 2 980×g离心 5 min,
取沉淀加入 10 倍体积的蒸馏水,放入灭菌锅中
121 ℃灭菌 20 min后抽滤,滤液即为真菌诱导子
粗提物。分装滤液,冷藏于冰箱。
1.2.4 大孔吸附树脂处理
将未使用过的大孔吸附树脂在丙酮溶液中
浸泡 5 h,过滤后加入 1.5倍的丙酮进行淋洗,
然后用蒸馏水冲洗至无色并使溶液显中性,再用
4% NaOH溶液和 5 mol/L HCl溶液分别冲洗树
脂,每次都用蒸馏水冲洗至中性,湿法保存待用。
1.2.5 大孔吸附树脂洗脱及总萘醌含量测定
将吸附了总萘醌的大孔吸附树脂浸入
100 mL无水乙醇中,在 25 ℃、100 r/min条件下
振摇 10 h,用双层纱布过滤,滤液补充至 100 mL,
精密量取滤液 5 mL,置 25 mL量瓶中,加无水
乙醇至刻度,摇匀。采用分光光度法测定 A516。
萘醌含量=(A516/242)×10×V×n,其中,V为培养液
的体积(mL);n为稀释倍数。每个处理 3次重复,
计算平均值及标准差。
1.2.6 毛状根总萘醌提取及其含量测定
采用中国药典中记载的测定羟基萘醌总色
素的方法进行测定。具体方法:取培养一定时间
的毛状根适量,于 50 ℃干燥 3 h,粉碎 (过三号
筛) 精密称取约 0.5 g,置 100 mL 量瓶中,加
95%无醇至刻度,4 h内时时振摇,过滤,精密
量取续滤液 5 mL于 25 mL容量瓶中,加无水乙
醇至刻度,摇匀。采用分光光度法在 516 nm的
波长处测定吸光度 A516,按左旋紫草素
(C16H16O5) 的吸收系数为 242 计算,即得毛状根
萘醌含量 (%)=(A516/242)×10×100%。每个处理 3
次重复,计算平均值及标准差。
1.2.7 培养液中紫草素及其衍生物的萃取及含
量测定
将培养一定时间的毛状根培养液与等体积
的石油醚混合,在分液漏斗中振荡,静置,分液,
反复萃取至无色,合并萃取液,采用分光光度法
测定萃取液的 A516,培养液中萘醌含量 =
(A516/242)×10×V×n,其中,V 为培养液的体积
(mL);n 为稀释倍数。总萘醌含量=毛状根萘醌
含量+培养液萘醌含量。每个处理 3 次重复,计
算平均值及标准差。
所有数据采用 SPSS19进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 真菌诱导子添加量对摇瓶培养的毛状根
增殖倍数的影响
图 1结果显示,米曲霉诱导子不同添加量其
毛状根增殖倍数均较对照及黑曲霉诱导子高,米
曲霉诱导子粗提物 /M-9 培养基体积比为
0.5 mL∶50 mL时,毛状根增殖倍数达峰值,为
2.55倍;黑曲霉诱导子粗提物/M-9培养基体积比
为 1.5 mL∶50 mL时,毛状根增殖倍数达峰值,
为 1.28倍。表明低浓度的米曲霉诱导子对毛状根
增殖有较明显促进效应。方差分析结果表明两种
诱导子之间无显著差异,但与对照均具有显著差
异 (P=0.05)。
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2.2 真菌诱导子添加量对摇瓶培养的总萘醌
含量的影响
图 2结果显示,凡添加真菌诱导子的总萘醌
含量均较对照高,并且随着添加量的增加,两种
真菌诱导子的总萘醌含量均呈先升后降趋势,但
达峰值的添加量有所不同,且浓度均较低。黑曲
霉诱导子添加量在 1.5 mL∶50 mL时总萘醌含量
为 0.85%,米曲霉诱导子添加量在 1 mL∶50 mL
时为 0.81%,两种诱导子之间无显著性差异,但
图 1 不同诱导子对毛状根增殖的影响
Fig. 1 Effects of different elicitors on hairy roots
proliferation. CK: control.
图 2 真菌诱导子添加量对总萘醌含量的影响
Fig. 2 Effects of fungal elicitor adding quantity on
total naphthoquinone content. CK: control.
与对照均具有显著差异 (P=0.05)。表明两种真菌
诱导子在低浓度时均可促进萘醌的积累。
2.3 真菌诱导子添加时间对摇瓶培养的毛状
根增殖倍数的影响
在上述试验结果基础上,图 3结果显示,随
着真菌诱导子添加时间的延迟,两种真菌诱导子
的毛状根增殖倍数均呈先升后降趋势,且均在培
养 15 d时添加达峰值,添加黑曲霉诱导子、混合
诱导子的毛状根增殖倍数分别为 7.03 倍、6.34
倍,方差分析表明,黑曲霉诱导子促进毛状根增
殖效果优于混合诱导子 (P=0.01)。表明真菌诱导
子具有促进毛状根增殖的效果。
2.4 真菌诱导子添加时间对摇瓶培养的总萘
醌含量的影响
在上述试验基础上,图 4结果显示,随着添
加时间的延迟,两种真菌诱导子的总萘醌含量均
呈先升后降趋势,但达峰值的时间有所不同,混
合诱导子在培养 10 d 时添加其总萘醌含量达峰
值为 1.55%,黑曲霉诱导子在培养 5 d时添加总
萘醌含量达峰值为 1.50%,两者之间无显著差
图 3 真菌诱导子添加时间对毛状根增殖的影响
Fig. 3 Effects of fungal elicitor adding time on hairy
roots proliferation.
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异,但两者与对照相比均有显著差异 (P=0.05),
分别较对照高 0.87%、0.42%。即黑曲霉诱导子
处理的萘醌积累时间长,要早添加,如果延迟添
加,萘醌含量下降但幅度较小。混合诱导子处理
的萘醌积累所需时间稍短,如果延迟添加,萘醌
含量下降且幅度较大。表明黑曲霉诱导子的作用
效应较混合诱导子的弱,黑曲霉诱导子与米曲霉
有协同效应。
试验发现,当培养 5 d时添加真菌诱导子,
两种处理的培养液萘醌含量基本一致,总萘醌含
量以黑曲霉诱导子处理的效果优于混合诱导子
的处理 (图 4),进一步说明黑曲霉诱导子与米曲
霉具有协同效应,混合诱导子中的米曲霉诱导子
具有促进萘醌类物质向细胞外释放的作用。
2.5 大孔吸附树脂添加量对摇瓶培养的毛状
根增殖及总萘醌含量的影响
在 2.4试验结果的基础上,图 5结果显示,
随着大孔吸附树脂添加量的增加,毛状根增殖倍
数呈下降趋势,添加量为 2 g/瓶时毛状根增殖倍
图 4 真菌诱导子添加时间对总萘醌含量的影响
Fig. 4 Effects of fungal elicitor adding time on total
naphthoquinone content.
图 5 大孔吸附树脂添加量对毛状根增殖和萘醌积累
的影响
Fig. 5 Effects of macroporous adsorption resin adding
quantity on hairy roots proliferation and total
naphthoquinone content.
数最高为 8.17 倍,明显较对照高 (P=0.05),是
对照的 1.38倍。添加树脂的 3个处理总萘醌含量
均明显较对照高,大孔吸附树脂添加量为 4 g/瓶
时总萘醌含量最高为 5.49%,是对照的 3.71倍。
表明添加树脂明显促进萘醌类物质的合成和积
累,综合考虑毛状根增殖及萘醌含量,以添加
2 g/瓶的树脂为宜。3 个处理间萘醌含量无明显
差异。
2.6 混合诱导子、大孔吸附树脂对反应器中的
毛状根增殖倍数及总萘醌含量的影响
在上述试验结果的基础上,单独添加混合诱
导子及混合诱导子与大孔吸附树脂同时添加,图
6 结果显示,毛状根增殖倍数及总萘醌含量均高
于对照,以混合诱导子与大孔吸附树脂同时添加
的毛状根增殖倍数及总萘醌含量最高,分别为
4.23 倍、4.5%,总萘醌含量是对照的 4.17 倍。
表明混合诱导子与大孔吸附树脂共同作用有利
于毛状根萘醌类物质在反应器中的合成及向培
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养液中分泌。至于总萘醌含量较摇瓶培养低的原
因可能是毛状根在反应器中的各项参数不同所
致,有待进一步研究。
图 6 不同处理对毛状根增殖、萘醌积累的影响
Fig. 6 Effects of different treatment on hairy roots
proliferation and naphthoquinone accumulation. CK:
control.
3 讨论
3.1 真菌诱导子与植物次生代谢物
许多研究表明,真菌诱导子的种类、浓度及
添加时间影响植物次生代谢物的产量。刘峻等[9]
研究认为黑曲霉诱导子能提高人参毛状根总苷
含量,并可促进人参毛状根的生长。王剑文等[17]
采用黄花蒿内生炭疽菌细胞壁寡糖提取物处理
可促进毛状根青蒿素的合成,青蒿素含量较对照
高出 64.29%。晏琼等[18]、王学勇等[19]认为酵母
提取物与非生物诱导子具有协同作用,其诱导效
果比单独使用某一种诱导子的诱导效果更好,这
种相互作用可以更有效地促进次生代谢产物的
合成。在紫草细胞培养的研究中,刘长军等[12]
对 4 种真菌诱导子的作用研究认为,黑曲霉诱
导子对紫草细胞次生代谢产物效果最好,而宁文
等[20]则认为米曲霉诱导子效果最好。本研究中,
单独使用黑曲霉诱导子及添加混合曲霉诱导子
均能促进萘醌的积累,这一结果与刘峻等[9]、晏
琼等[18]、刘长军等[12]、宁文等[20]的一致。可见
不同种类的真菌诱导子适合不同的培养材料,真
菌诱导子促进细胞次生代谢物含量的提高具有
普遍性。
在毛状根培养过程中,真菌诱导子的诱导效
果与诱导子浓度、作用时间密切相关[18],这可能
与真菌诱导子的组分[21]抑或含量有关,而这又取
决于真菌的培养时间及培养条件。王红等[22]采用
大丽花轮枝孢、葡枝根霉和束状刺盘孢等 3种真
菌诱导子处理青蒿毛状根,均能促进毛状根中青
蒿素的积累,在加入诱导子 4 d后毛状根中的青
蒿素含量最高。宁文等[21]在颠紫草细胞培养第
8 d时加入米曲霉诱导子,12 h后细胞内的紫草
素含量即开始增加。傅旭庆等[13]在 6 d加入米根
霉,促进紫草细胞中紫草素含量提高的作用最
大,较对照高 2.24倍。本研究中采用培养 5 d的
米曲霉、黑曲霉诱导子,在毛状根培养 5 d、10 d
时添加,总萘醌含量均达最高,此结果与宁文
等[21]、傅旭庆等[13]类似,表明不适宜的添加时间
影响毛状根的生长代谢,从而影响总萘醌的合成。
3.2 大孔吸附树脂的作用
罗雪梅等[14]在硬紫草细胞培养 4 d 时加入
R-A树脂色素产量提高两倍;谢文化等[23]认为树
脂的添加量为 6.7%时,色素的产量比常规培养
分别增加了 5.2倍、6倍。反应器与 AB-8树脂柱
相偶联进行同时分离色素的培养实验,结果使色
素产量增加了 5.3倍。孟琴等[24]在培养硬紫草细
胞 8 d时加入大孔吸附树脂,继续培养 6 d后,
紫草素产率提高了 76.4%;曹琳等[25]在丹参毛状
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根培养生产丹参酮的研究中认为大孔树脂 X-5
可以在丹参毛状根培养生产丹参酮的过程中有
效地对丹参酮进行原位富集,总丹参酮吸附率达
到 92.4%。上述研究表明,无论是细胞培养还是
毛状根培养,大孔吸附树脂均具有使细胞内次生
代谢物向外不断排放、从而使其产量提高的作
用。芦韦华等[26]单独添加大孔吸附树脂 NKA-9
总萘醌含量为 3.64%。本研究添加大孔吸附树脂
NKA-9 同时加入混合诱导子总萘醌含量较对照
增加了 3.71倍,表明大孔吸附树脂与真菌诱导子
具有协同作用。当培养 25 d后毛状根呈无色半透
明状,培养液为淡黄色,NKA-9树脂呈紫红色,
说明总萘醌在新疆紫草毛状根和培养液中的含
量极低,表明大孔吸附树脂 NKA-9 具有降低细
胞内萘醌浓度的作用,这与罗雪梅[14]、谢文化[23]、
孟琴[24]、曹琳[25]等的研究结果一致。试验过程中
发现,对照的培养液中萘醌含量不到 0.1%,说
明萘醌主要积累在毛状根内,添加树脂的毛状
根、培养液中萘醌含量均为 0,说明毛状根合成
的所有萘醌被大孔吸附树脂所吸附,萘醌未在毛
状根内产生积累,表明新疆紫草毛状根在培养过
程中添加大孔吸附树脂及真菌诱导子可有效克
服萘醌的反馈抑制现象,从而大幅度提高萘醌产
量。本研究采用 3种真菌诱导子及大孔吸附树脂
进行研究,结果表明混合曲霉诱导子 10 d添加的
萘醌含量略高于黑曲霉诱导子 5 d添加的,笔者
推测米曲霉诱导子具有促进毛状根萘醌的释放
效果,因此认为混合曲霉诱导子效果最好,但其
成分及最适比例有待进一步研究。
根据本研究结果综合考虑,毛状根生产萘醌
过程中大孔吸附树脂与真菌诱导子具有协同作
用,且添加大孔吸附树脂尤为重要。试验表明过
量的树脂影响毛状根生长,降低萘醌总产量,增
加成本,因此综合考虑大孔吸附树脂 NKA-9 添
加量不超过 4 g/100 mL为宜。
4 结论
毛状根培养 10 d 时按照混合诱导子与 M-9
培养基为 2.5 mL∶50 mL的体积比添加可促进萘
醌积累。大孔吸附树脂与真菌诱导子具有协同
作用,可大幅提高新疆紫草毛状根萘醌含量
(5.49%),此结果为新疆紫草毛状根规模化生产
奠定了理论基础。
致谢:感谢新疆农业大学农学院罗明教授在翻译
修改上所提供的帮助。
REFERENCES
[1] Xiao J, Yang YG, Guo YM, et al. Advances in
tissue culture of Arnebia euchroma. Acta Bot
Boreal-Occid Sin, 2004, 24(8): 1560−1564 (in
Chinese).
肖洁, 杨映根, 郭奕明, 等. 新疆紫草组织培养
的研究进展 . 西北植物学报 , 2004, 24(8):
1560−1564.
[2] Ge F, Wang XD, Wang YC. Advances in studies on
medicinal Radix Arnebiae Seu Lithospermi. Chin
Trad Herbal Drugs, 2003, 34(9): 6−10 (in Chinese).
葛锋 , 王晓东 , 王玉春 . 药用紫草的研究进展 .
中草药, 2003, 34(9): 6−10.
[3] Zhang XJ, Mu K, Yang SS, et al. Influence of
polysaccharides of lithospermum erythrorhizon on
fluidity and band-3 protein level of red cells
membrance of S180 mice. Asia-Pacific Trad Med,
2007, 3(9): 32−35 (in Chinese).
张秀娟, 穆坤, 杨姗姗, 等. 紫草多糖对 S180荷瘤
小鼠红细胞膜流动性与带 3 蛋白的影响. 亚太传
统医药, 2007, 3(9): 32−35.
[4] Chen YF, Lu WH, Wang F, et al. Induction and
culture of hairy roots from Arnebia euchroma
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2013 Vol.29 No.2
http://journals.im.ac.cn/cjbcn
222
(Royle) Johnst. Acta Bot Boreal-Occid Sin, 2008,
28(12): 2423−2428 (in Chinese).
陈永芳, 芦韦华, 王芳, 等. 新疆紫草毛状根的
诱导及培养 . 西北植物学报 , 2008, 28(12):
2423−2428.
[5] Li CF, Wang F, Ma H, et al. Study on antibacterial
activity of Arnebia euchroma (Royle) Johnst hairy
roots extract. J Agri Univ Hebei, 2010, 33(3):
92−96 (in Chinese).
李翠芳, 王芳, 麻浩, 等. 新疆紫草毛状根提取
物的抑菌活性研究 . 河北农业大学学报 , 2010,
33(3): 92−96.
[6] Li CF, Wang F, Ma H, et al. Study on antioxidant
activity of Arnebia euchroma (Royle) Johnst hairy
roots. Xinjiang Agri Sci, 2010, 47(2): 291−295 (in
Chinese).
李翠芳, 王芳, 麻浩, 等. 新疆紫草毛状根提取
物的抗氧化活性研究 . 新疆农业科学 , 2010,
47(2): 291−295.
[7] Li CF, Li XR, Wang F, et al. Analysis on content of
Total sugar and polysaccharides from Arnebia
euchroma (Royle) Johnst hairy roots. Acta Bot
Boreal-Occid Sin, 2010, 30(1): 180−183 (in
Chinese).
李翠芳, 李新仁, 王芳, 等. 新疆紫草毛状根总
糖及多糖含量分析. 西北植物学报, 2010, 30(1):
180−183.
[8] Zhai XL, Fan GZ, Zhan YG. Accumulation of
triterpenoids in Betula platyphylla suspension
culture induced by a fungal elicitor. Sci Silvae Sin,
2011, 47(6): 42−47 (in Chinese).
翟俏丽, 范桂枝, 詹亚光. 真菌诱导子促进白桦
悬浮细胞三萜的积累 . 林业科学 , 2011, 47(6):
42−47.
[9] Liu J, Ding JY, Zhou QG, et al. Studies on
influence of funal elicitor on hairy root of Panax
ginseng biosynthesis ginseng saponin and biomass.
China J Chin Mater Med, 2004, 29(4): 18−21 (in
Chinese).
刘峻, 丁家宜, 周倩耘, 等. 真菌诱导子对人参
毛状根皂苷生物合成和生长的影响. 中国中药杂
志, 2004, 29(4): 18−21.
[10] Zhang XF, Zhang RT, Wang NN, et al. Effects of
fungal elicitors on accumulation of indole alkaloids
in Catharanthus roseus calli. Chin Trad Herbal
Drugs, 2004, 35(2): 201−204 (in Chinese).
张向飞, 张荣涛, 王宁宁, 等. 真菌诱导子对长
春花愈伤组织中吲哚生物碱积累的影响 . 中草
药, 2004, 35(2): 201−204.
[11] Chen C, Fu CH, Jiang GM, et al. Relationship
between phenolics content and Taxol production in
Taxus cells. J Huazhong Agri, 2005, 24(1): 83-87
(in Chinese).
陈超, 付春华, 姜革民, 等. 红豆杉细胞中的酚
类化合物含量与紫杉醇产量之间的关系. 华中农
业大学学报, 2005, 24(1): 83-87.
[12] Liu CJ, Hou SS. Effects of fungal encitors on the
cell growth and the shikonin biosynthesis in Amebta
euchroma cells in suspen-sion culture. Acta
Photophys Sin, 1998, 24(1): 6−10 (in Chinese).
刘长军, 侯嵩生. 真菌诱导子对新疆紫草悬浮培
养细胞的生长和紫草素合成的影响. 植物生理学
报, 1998, 24(1): 6−10.
[13] Fu XQ, Lü DW. Effects of rhizopus oryzae elicitor
on shikonin secretion in suspension cultures of
Arnebia euchroma. Acta Photophys Sin, 1998,
24(4): 380−384 (in Chinese).
傅旭庆, 吕德伟. 米根霉诱导因子对紫草细胞培
养中紫草宁色素分泌的影响 . 植物生理学报 ,
1998, 24(4): 380−384.
[14] Luo XM, Yuan LH, Zhou ML, et al. Enhanced
productions of shikonin derivatives of
Lithospermum erythrorhizon cell suspension
cultures in situ extraction. J Nanjing Univ Chem
Technol, 1996, 18(2): 12−16 (in Chinese).
罗雪梅, 袁丽红, 周名立, 等. 吸附树脂对紫草
细胞培养生产紫草色素的原位提取. 南京化工大
学学报, 1996, 18(2): 12−16.
[15] Wu PM, Yuan LH, Huang J, et al. Separation of
crocin and picrocrocin from saffron cell culture
broth by macroporous resin adsorption. Food Sci,
2011, 32(24): 7−12 (in Chinese).
吴频梅, 袁丽红, 黄晶, 等. 利用大孔吸附树脂
吸附分离藏红花细胞培养液中藏红花素和藏红
张璞 等/真菌诱导子与吸附树脂对新疆紫草毛状根中萘醌积累的影响
cjb@im.ac.cn
223
花苦素. 食品科学, 2011, 32(24): 7−12.
[16] Lu WH, Chen YF, Wang F, et al. Effects of
physical and chemical conditions on Arnebia
euchroma (Royle) Johnst hairy roots and Shikonin
and its derivatives. J Huazhong Agri Univ, 2012,
31(1): 50−54 (in Chinese).
芦韦华, 陈永芳, 王芳, 等. 理化条件对新疆紫
草毛状根培养及紫草素含量的影响. 华中农业大
学学报, 2012, 31(1): 50−54.
[17] Wang JW, Zheng LP, Tan RX. The preparation of
an elicitor from a fungal endophyte to enhance
artemisinin production in hairy root cultures of
Artemisia annua L. Chin J Biotech, 2006, 22(5):
829−834 (in Chinese).
王剑文, 郑丽屏, 谭仁祥. 促进黄花蒿发根青蒿
素合成的内生真菌诱导子的制备 . 生物工程学
报, 2006, 22(5): 829−834.
[18] Yan Q, Hu ZD, Wu JY. Synergistic effects of biotic
and abiotic elicitors on the production of
tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root
culture. China J Chin Mater Med, 2006, 31(3):
14−17 (in Chinese).
晏琼, 胡宗定, 吴建勇. 生物与非生物诱导子协
同作用对丹参毛状根培养生产丹参酮的影响. 中
国中药杂志, 2006, 31(3): 14−17.
[19] Wang XY, Cui GH, Huang LQ, et al. Effects of
elicitors on tanshinone class composition
accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy roots.
China J Chin Mater Med, 2007, 32(10): 106−108.
王学勇, 崔光红, 黄璐琦, 等. 诱导子对丹参毛
状根中丹参酮类成分积累影响. 中国中药杂志,
2007, 32(10): 106−108.
[20] Ning W, Cao RQ. Fractionation and biological
activity of aspergillus oryzae elicitor promoting
biosynthesis of shikonin derivative. Acta Bot Sin,
1996, 38(5): 32−39 (in Chinese).
宁文, 曹日强. 促进紫草色素合成的米曲霉诱导
子的纯化和活性鉴定 . 植物学报 , 1996, 38(5):
32−39.
[21] Ning W. Study on the mechanisms of regulating
shikonin derivatives in onosma paniculatum cell
cultures by Aspergillus oryzae elicitors[D].
Nanjing: Nanjing University, 1995 (in Chinese).
宁文. 米曲霉诱导物调节滇紫草细胞紫草色素合
成机制的研究[D]. 南京: 南京大学, 1995.
[22] Wang H, Ye HC, Li GF, et al. Effects of fungal
elicitors on cell growth and artemisinin
accumulation in hairy root cultures of Artemisia
annua. Acta Bot Sin, 2000, 42(9): 905−909 (in
Chinese).
王红, 叶和春, 李国凤, 等. 真菌诱导子对青蒿
发根细胞生长和青蒿素积累的影响. 植物学报,
2000, 42(9): 905−909.
[23] Xie WH, Liang SZ, Yu RQ, et al. Shikonin
production by cell culture of Lithospermum
erythrorhizon with resin adsorbent. J South China
Univ Technol: Nat Sci, 1999, 27(6): 27−31 (in
Chinese).
谢文化, 梁世中, 余若黔, 等. 添加吸附树脂紫
草细胞培养生产紫草色素. 华南理工大学学报:
自然科学版, 1999, 27(6): 27−31.
[24] Meng Q, Xue L. Investigation on adsorption of
lithospermum erythrorhizon onto fungal cell wall
polysaccharides. Chin J Chem Engin, 2003, 11(4):
464−466.
[25] Cao L. In situ extraction effect of macroporous
resins on tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy
root culture. China J Chin Mater Med, 2007,
32(17): 1752−1754 (in Chinese).
曹琳. 大孔树脂在丹参毛状根培养生产丹参酮过
程中的原位富集. 中国中药杂志, 2007, 32(17):
1752−1754.
[26] Lu WH, Pan Q, Wang F, et al. Influence of culture
conditions on Arnebia euchroma hairy roots growth
and shikonin content. Acta Botan Boreali-Occident
Sin, 2012, 32(8): 1686−1691(in Chinese).
芦韦华, 潘颀, 王芳, 等. 培养条件对新疆紫草
毛状根生长及紫草素含量的影响 . 西北植物学
报, 2012, 32(8): 1686−1691.
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