全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2010, 22:460-465
文章编号:1001-6880(2010)03-0460-06
　
　
　收稿日期:2008-09-27　　　接受日期:2008-12-09
　基金项目:云南省科技计划项目(2009ZC046M);云南省教育厅基
金资助项目(07C40780)
＊通讯作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:gefeng79@yahoo.com.cn
新疆紫草细胞悬浮培养过程研究
葛　锋 1＊ ,王剑平 1 ,王晓东 2 ,赵　兵 2 ,王玉春 2
1昆明理工大学生命科学与技术学院 ,昆明 650224;
2中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 ,北京 100080
摘　要:新疆紫草细胞生长和紫草素合成之间属非生长偶联型 ,所以采用二步培养法研究悬浮培养过程。新疆
紫草细胞悬浮培养的生长周期约为 21d, 紫草素合成周期约为 16d。新疆紫草细胞生长阶段培养液的电导率与
生物量呈线性负相关 ,随着生物量的增加 , 培养液的电导率降低。因此 ,可以通过测量电导率来预测培养体系
中生物量的变化情况。细胞生长过程中硝酸盐 、铵盐和可溶性糖的消耗与生物量的变化具有很好的线性相关
性 , 基于硝酸盐 、铵盐和可溶性糖的细胞收率系数分别为 8.64、104.3和 0.68 g/g。
关键词:新疆紫草;紫草素;悬浮培养;二步培养;电导率
中图分类号:Q943.1;R284.1 文献标识码:A
ProcessStudyofArnebiaeuchromaCelsinSuspensionCulture
GEFeng1＊ , WANGJian-ping1 , WANGXiao-dong2 , ZHAOBing2 , WANGYu-chun2
1ColegeofLifeScienceandTechnology, KunmingUniversityofScienceandTechnology, Kunming, Yunnan
650224 , China;2StateKeyLaboratoryofBiochemicalEngineering, InstituteofProcess
Engineering, ChineseAcademyofSciences, Beijing100080 , China
Abstract:Thetwo-stagedsuspensionculturesystemwasusedbecausethecellgrowthwasnon-associatedwithshikonin
biosynthesis.ThegrowthperiodofArnebiaeuchromacellsinsuspensionculturewasabout21 dandtheshikoninbiosyn-
thesisperiodwasabout16 d.Thenegativecorrelationbetweenconductivityandbiomassexistedduringthecelgrowth
stage.Withincreaseofthebiomass, conductivityoftheculturemediumdecreased;therefore, thebiomasscouldbepre-
dictedbymeasuringtheconductivity.Duringthecelgrowthstage, thelinearcorrelationsbetweenbiomassandtheutili-
zationsofnitrate, ammoniaandsolublesugarwereperfect.Thecelyieldcoeficientsbasedonnitrate, ammoniaandsolu-
blesugarwere8.64, 104.3 and0.68g/grespectively.
Keywords:Arnebiaeuchroma;shikonin;suspensionculture;two-stagedculture;conductivity
　　新疆紫草 (Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.)
为紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物 , 其根药
用 ,有效药用成分是紫草素及其衍生物 ,这些成分不
但具有抗菌 、抗炎 、抗癌等多种药理作用 ,而且还作
为天然色素广泛用于医药 、化妆品和印染工业中[ 1〗。
《中华人民共和国药典 》收录的中药紫草中 ,以新疆
紫草品质最佳[ 2〗 ,为主要的商品药用紫草 。目前 ,新
疆紫草的野生资源破坏严重 ,自然生态环境恶化 ,而
旺盛的市场需求凸显了供需矛盾 。从长远考虑 ,通
过细胞的大规模培养直接生产紫草素来满足药用需
求是比较有潜力的途径。
国内外对新疆紫草细胞和组织培养的研究主要
集中在愈伤组织的诱导 、愈伤组织培养基和培养条
件的优化以及各种物理 、化学或生物刺激因子对新
疆紫草细胞有效次生代谢产物的影响研究等方
面[ 3, 4〗。我们已经对新疆紫草愈伤组织的诱导条
件[ 5〗、稀土元素和超声波对新疆紫草细胞生长和药
用次生代谢产物积累等进行了研究[ 6, 7〗。植物细胞
悬浮培养过程中 ,营养物质的消耗 、细胞的生长和次
生代谢产物的积累 、细胞的生长速率是植物由摇瓶
培养放大到生物反应器培养的关键参数 。而生物反
应器技术是实现植物细胞大规模培养生产药用次生
代谢产物的关键工业化技术 。本文对新疆紫草细胞
悬浮培养过程进行了研究 ,为新疆紫草细胞生物反
应器的大规模培养提供理论依据 。
DOI :10.16333/j.1001-6880.2010.03.012
1　材料与方法
1.1　实验材料
将由外植体诱导得到的新疆紫草愈伤组织[ 5〗 ,
在液体培养基中进行悬浮培养 ,得到分散的新疆紫
草细胞及聚集体 。葡萄糖 、硝酸钾和硝酸铵等化学
试剂均为分析纯 。
1.2　实验方法
2.2.1　新疆紫草细胞悬浮培养方法
前期研究表明[ 5-7〗,新疆紫草细胞中紫草素的生
物合成属非生长偶联型 ,而且细胞生长和紫草素合
成所使用的培养基也不同 ,因此采用二步培养法 ,把
细胞生长阶段和紫草素合成阶段分开单独进行研
究 。新疆紫草细胞生长的悬浮培养采用 N6培养
基 [ 7〗,接种量为 2%;紫草素合成的悬浮培养采用
M10培养基 [ 7〗 ,接种量为 7.5%。所有实验均在装
有 40mL液体培养基的 100 mL三角瓶中进行 。 N6
培养基中添加 1mg/LKT。培养温度为(25±1)℃,
摇床转速 120 r/min,暗培养 。细胞生长的培养周期
为 21d;紫草素生物合成的培养周期为 16d。
1.2.2　细胞干重测定方法
取新疆紫草细胞悬浮培养液 ,用滤纸过滤 ,将细
胞置于烘箱中 , 55 ℃烘约 24 h至恒重 ,称得其干重
即为生物量(g/L)。
1.2.3　紫草素含量测定方法
紫草素在 520 nm处有最大吸收峰 。由此可进
行标准曲线的绘制 ,曲线方程为:
C=187.85 OD520nm-2.09, r=0.9995
其中 , C为紫草素石油醚溶液中的紫草素浓度
(mg/L), OD520nm为该测定溶液的吸光度值 。
取新疆紫草细胞培养液 , 3500 r/min离心 20
min,回收的沉淀物为鲜细胞 。将鲜细胞转移至三角
瓶中 ,加入一定量的石油醚(沸点 30 ～ 60 ℃),三角
瓶放入超声场中进行细胞破碎 ,然后在室温下振荡
(110r/min)提取 24h,提取液用于测定细胞中的紫
草素含量(%)[ 6〗。
紫草素产量(g/L)=紫草素含量(%)×细胞干
重(g/L)
1.2.4　培养液电导率 、pH值的测定
将过滤后的细胞培养液用 DDS-11A型电导率
仪测定电导率。 pH测定采用 BeckmanpHmeter。
1.2.5　培养液中 NO-3 、NH+4 、PO3-4 、可溶性糖含量
的测定
NO-3 含量采用苯酚二磺酸法测定 [ 8〗 , NH+4 含
量采用靛定酚蓝比色法测定 [ 8〗, PO3 -4 含量采用钼酸
盐-钒酸盐试剂测定 [ 8〗,可溶性糖含量采用苯酚-硫
酸法测定 [ 9〗。
2　结果与讨论
2.1　新疆紫草细胞悬浮培养时细胞生长和紫草素
合成过程
由于新疆紫草细胞的生长和紫草素的合成属于
非生长耦联型 ,而且细胞生长阶段和紫草素合成阶
段所用培养基成分差异较大 ,为此 ,我们把这两个阶
段分开单独进行实验 ,以便探究有关细胞生长和紫
草素合成的一些基本情况。
当接种量为 2%时 ,新疆紫草细胞悬浮培的 0 ～
3d为细胞生长的延滞期 ,此阶段细胞主要进行初
级代谢活动 ,同时适应新的培养环境 ,为即将到来的
细胞分裂旺盛期做物质上的准备。第 3 d后 ,细胞
生长进入指数生长期 ,这个时期细胞分裂速度快 ,生
长活跃 ,细胞的鲜重和干重都显著增加 ,培养到第
15d时 ,培养体系获得最大生物量为 12.2 gDW/L。
随后生长曲线很快进入衰亡期 , 细胞逐渐褐化 、死
亡。
由于紫草素合成的培养基 M10不适合细胞的
生长 ,所以当接种量为 7.5%时 ,在整个紫草素合成
阶段 ,细胞的生物量只有 1倍左右的增长。但是
M10培养基非常适合紫草素的合成 ,从接种当天开
始 ,细胞就开始迅速合成紫草素 ,基本上没有延滞
期。紫草素含量迅速增长阶段一直持续到第 12 d,
此时获得了最高的紫草素含量 2.13%和紫草素产
量 243.1 mg/L,其中紫草素产量比接种时增长达
12.2倍 。 12 d以后 ,细胞开始衰亡 。
2.2　新疆紫草细胞悬浮培养生长阶段 pH值和电
导率的变化
新疆紫草悬浮培养细胞生长阶段 pH值和电导
率的变化如图 1所示。由图可知 ,在新疆紫草悬浮
培养的整个过程中 , pH值的变化不大 ,大致在 5.2
～ 5.8之间小幅波动 ,培养后期的 pH值比培养初期
略微偏高;培养液的电导率与细胞生物量呈负相关 ,
随着生物量的增加 ,培养液的电导率降低。出现这
种现象的原因是细胞在生长过程中要吸收大量的无
机导电离子作为营养物质 ,导致培养液电导率下降 ,
培养到第 15 d时 ,细胞的生物量达到最大 ,培养液
中的营养物质被最大限度的吸收 ,导电离子浓度最
461Vol.22 　　　　　　葛　锋等:新疆紫草细胞悬浮培养过程研究 　
低 ,因此表现出电导率下降到最小值 ,随后 ,细胞进
入衰亡期 ,部分种龄大的细胞出现褐化 、死亡 ,衰亡
的细胞中释放出了部分导电离子 ,使得培养液电导
率出现小幅增长 。
图 2为悬浮培养细胞生长过程中第 5 ～ 13 d期
间 ,生物量增长和培养液电导率降低的关系。第 5
～ 13 d为细胞的指数生长期 ,细胞生长和增殖处于
旺盛期 ,考察此阶段细胞生物量和电导率的相关性
相对整个培养周期而言最具代表性。回归分析获得
指数生长期生物量和电导率的关系式为:C=4525
-76.72Y, r=0.999,其中 , C为电导率(us/cm), Y
为生物量(g.DW/L)。由于电导率的测量比较容
易 ,方便 、快捷 ,因此 ,利用电导率和生物量之间的良
好的线性相关可以迅速地通过培养液电导率的测定
来分析细胞的生长情况 ,这种间接测定细胞生物量
的方法用在生物反应器的大规模培养过程中具有较
高的实际应用价值。
2.3　新疆紫草细胞紫草素合成阶段 pH值和电导
率的变化
由图 3可知 ,在新疆紫草悬浮培养的整个过程
中 , pH值的变化不大 ,大致在 5.8附近小幅波动;培
养液的电导率与紫草素合成量成负相关。培养过程
中的 8 ～ 12 d,电导率无明显变化 ,而紫草素的合成
迅速增加 ,并在第 12 d达到最大值 。出现这种现象
的原因可能是在紫草素的生成是细胞一系列生理生
化反应的结果 ,这其中必然伴随有培养液中无机离
子的消耗 ,使得培养液电导率下降;同时当培养时间
超过第 8 d时 ,虽然整个培养体系的紫草素合成量
是增加的 ,但少量种龄较大的细胞开始出现裂解 ,一
些导电离子从细胞中释放出来 ,导致培养液的电导
率增加。上面两个对于电导率变化相反的作用过程
达到动态平衡时 ,培养液中的电导率值将近似保持
恒定 。新疆紫草细胞在生长培养基中进行悬浮培养
时没有出现一个电导率相对恒定的时间进程(图
1),而在紫草素合成过程中却有一个电导率变化的
平台期 ,这可能是因为在细胞生长培养基中(N6培
养基),细胞生长旺盛 ,良好的生长环境使得细胞发
生程序性凋亡的时间后延 ,大部分细胞集中在指数
生长期结束的时候出现裂解 、死亡 ,整个细胞生长周
期的进程比较一致 ,因此没有电导率恒定期;而在紫
草素合成培养基中(M10培养基),培养条件适合紫
草素的合成 ,不利于细胞的生长 ,培养一段时间后 ,
少部分细胞就出现了群体性死亡 ,直接导致电导率
变化平台期的出现 。
图 3　新疆紫草悬浮培养紫草素合成过程中 pH值 、电
导率 、紫草素产量的变化
Fig.3　ChangesofpHvalue, conductivityvalueandshiko-
ninproductioninthecellsuspensioncultureofA.
euchroma
2.4　新疆紫草细胞生长过程中硝酸盐和可溶性糖
的消耗情况
新疆紫草细胞悬浮培养生长阶段硝酸盐和可溶
性糖的消耗情况如图 4所示。新疆紫草细胞生长培
养基的碳源为蔗糖 ,氮源为硝酸盐和氨盐 ,其它的营
养物质还有钾盐 、钠盐 、钙盐 、硫酸盐和磷酸盐等。
在培养过程中 ,蔗糖分解为葡萄糖和果糖 ,果糖再转
变为葡萄糖 ,然后葡萄糖被植物细胞所利用。葡萄
糖进入植物细胞后 ,一部分组成细胞的结构物质 ,一
462 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22
部分通过呼吸作用为细胞的生命活动提供能源 。培
养过程中 NO-3 和蔗糖的初始浓度分别为 1737 mg/
L和 30 g/L。在 0 ～ 15 d, NO-3 和蔗糖被细胞逐渐
吸收利用 ,浓度快速下降 ,第 15 d时 , NO-3 和蔗糖浓
度同时达到最小值 , NO-3 浓度为 457 mg/L,被消耗
掉约 73%;蔗糖浓度为 12.6 mg/L,被消耗掉 58%,
此时与细胞的最大生物量相对应。 NO-3 是细胞生
长培养基中的主要氮源供应物质 ,因此它的消耗情
况直接体现了细胞的生长情况 。
图 4　新疆紫草细胞悬浮培养生长过程中硝酸盐和可溶
性糖的消耗情况
Fig.4　Changesofresidualnitrateandsolublesugarinthe
cellsuspensioncultureofA.euchroma
2.5　新疆紫草细胞生长过程中铵盐和磷酸盐的消
耗情况
图 5　新疆紫草细胞悬浮培养生长过程中铵盐和磷酸
盐的消耗情况
Fig.5　Changesofresidualammoniumandphosphatein
thecelsuspensioncultureofA.euchroma
　　新疆紫草细胞悬浮培养生长阶段铵盐和磷酸盐
的消耗情况如图 5所示 。初始 NH+4 和 PO3-4 的浓
度分别为 126和 279 mg/L。磷酸盐消耗速度很快 ,
第 9 d时 ,磷酸盐已被消耗约 79%;到 15 d时 ,磷酸
盐的浓度达到最低值 ,仅为 32.4 mg/L,消耗 88%。
磷酸盐的快速吸收可能与细胞生长 、分裂时需大量
合成核酸物质有关。铵盐的吸收主要与细胞内的蛋
白质合成有关 ,其消耗速度先慢后快 ,从 0 ～ 6 d,仅
消耗 11%,在第 15d,浓度出现最小值 19.1 mg/L,
消耗掉约 85%。
2.6　新疆紫草细胞生长过程中的生长速率和比生
长速率
图 6　新疆紫草悬浮培养细胞生长过程中生长速率和
比生长速率的变化
Fig.6　Changesofcelgrowthrateandspecificgrowthrate
inthesuspensioncultureofA.euchroma
　　细胞生长过程中细胞的生长速率 γY=dY/dt≈
■Y/■t,比生长速率 μ=dY/dt· 1/Y≈■Y/■t·
1/Y。其中 Y表示细胞浓度(g/L), t表示培养时间
(d)。由图 6可知 ,在细胞生长的延滞期(0 ～ 3 d),
细胞的生长速率和比生长速率较低;到了指数生长
期 ,生长速率和比生长速率迅速增加 ,其中在第 13
d,生长速率达到最大值 1.2 g/(L· d),在第 7 d比
生长速率达到最大值 0.33/d。指数生长期过后 ,细
胞迅速进入衰亡期 ,生长速率和比生长速率呈现负
增长 。
2.7　新疆紫草紫草素合成过程中的合成速率和比
合成速率
紫草素合成阶段紫草素合成速率为 γp,比合成
速率 μp/Y=γp/Y。新疆紫草细胞悬浮培养过程中
紫草素合成速率和比合成速率的变化如图 7所示。
由 2.1可知紫草素的合成过程几乎没有延滞期 ,细
胞接种后 ,很快进入合成旺盛期 ,这种现象在图 7中
的表现就是培养过程前半段紫草素合成速率和比合
成速率在高位徘徊 ,最大值分别出现在第 6d(28
图 7　新疆紫草悬浮培养紫草素合成过程中合成速率和比
合成速率的变化
Fig.7　Changesofshikoninbiosynthesisrateandspecificbiosyn-
thesisrateinthesuspensioncultureofA.euchroma
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mg/(L· d))和第 4 d(3.49×10-3 /d)。培养到 10
d以后 , γp和 μp/Y出现大幅度下滑 。由于新疆紫
草细胞紫草素的合成属于非生长耦联型 ,紫草素合
成阶段使用的培养基并不适合细胞的生长 ,细胞生
物量只有小幅增长 ,因此在图 7中 ,紫草素的合成速
率与紫草素的比合成速率相比更能代表培养体系中
紫草素的合成规律 。
2.8　细胞收率系数
图 8　底物浓度和生物量的关系
Fig.8　Relationshipbetweensubstrateconcentrationandbiomass
　　构成植物细胞的主要物质元素为 C、H、O、N、P,
细胞培养过程中 C源 、N源和 P源转化为细胞物质
的转化率相当重要。图 8表明了细胞生长阶段各主
要无机元素的浓度与细胞生物量的相关性 。从中可
以看出硝酸盐 、铵盐 、可溶性糖与细胞生物量有着良
好的线性关系 ,线性回归方程的斜率即为基于底物
消耗的细胞收率系数 。基于硝酸盐的细胞收率系数
Yx/n=8.64 g/g;基于铵盐的细胞收率系数 Yx/a=
104.3 g/g;基于可溶性糖的细胞收率系数 Yx/s=
0.68g/g。
磷酸盐与细胞生物量线性相关性不好 ,这可能
是因为磷酸盐在细胞代谢过程中主要用来合成遗传
物质 ,而遗传物质的合成常常早于细胞干物质的积
累过程 。从图 8可以看出磷酸盐大量消耗的阶段 ,
细胞的生物量增加缓慢;而细胞生物量迅速增加的
阶段 ,磷酸盐消耗速度明显变缓 。
3　结论
　　通过对新疆紫草细胞悬浮培养过程中生物量 、
紫草素含量和底物浓度随时间变化的分析 ,可以得
出细胞悬浮培养的基本情况。新疆紫草细胞的生长
和紫草素的合成属于非生长偶联型 ,新疆紫草细胞
悬浮培养的生长阶段约为 21d,其中 0 ～ 3d为细胞
生长的延滞期 , 3 ～ 15 d为细胞的指数生长期 , 15 d
后进入衰亡期;紫草素合成阶段约为 16d,接种后细
胞就开始迅速合成紫草素 ,一直持续到 12d,随后进
入平衡期和衰亡期 。
新疆紫草细胞生长阶段培养液的电导率与生物
量呈负相关 ,随着生物量的增加 ,培养液的电导率降
低;当细胞进入衰亡期 ,生物量下降时 ,电导率增加。
由于电导率的测量比较容易 ,方便 、快捷 ,因此 ,利用
电导率和生物量的这种相关性可以迅速地通过培养液
电导率的测定来预测培养体系中生物量的变化情况。
培养过程中磷酸盐消耗最快 ,硝酸盐 、铵盐和可
溶性糖的消耗与生物量的变化具有很好的线性关
系 ,从而获得了基于硝酸盐 、铵盐和可溶性糖的细胞
收率系数 。
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