全 文 ：·研究简报· 北方园艺２０１２（０８）：３０～３３
第一作者简介：步佳佳（１９８６－），女，山东济南人，在读硕士，研究方
向为果树栽培与生理。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｖｅｒｙｌｏｖｅｊ＠１２６．ｃｏｍ。
责任作者：谢江辉（１９７３－），男，博士，研究员，博士生导师，现主要
从事荔枝及香蕉和热带珍稀果树等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｅｊｉａｎｇｈｕｉ
＠２１ｃｎ．ｃｏｍ。
基金项目：海南省自然基金资助项目（３１１０６９）；中央级公益性科
研院所基本科研业务专项资助项目（ｓｓｃｒｉ２０１００５，１２５１０２２０１１００２）；
国家香蕉产业技术体系湛江试验站资助项目（ＣＡＲＳ－３２－１２）。
收稿日期：２０１１－０２－２２
利用ＨＰＬＣ法对香蕉根中四种内源激素
测定方法的优化
步 佳 佳１，２，胡 玉 林２，魏 长 斌２，谢 江 辉２，何 新 华１
（１．广西大学 农学院，广西 南宁５３０００４；２．中国热带农业科学院 南亚热带作物研究所，广东 湛江５２４０９１）
　　摘　要：研究了高效液相色谱法测定香蕉根中４种内源激素：赤霉素（ＧＡ３）、３－吲哚乙酸
（ＩＡＡ）、脱落酸（ＡＢＡ）和玉米素（ＺＴ）的最佳条件。采用Ａｇｉｌｅｎｔ　ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ－Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×
４．６ｍｍ，５μｍ）进行分离测定。结果表明：ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ测定的最佳条件是甲醇∶乙腈∶磷酸
缓冲液（ｐＨ　３．５）为１５∶２０∶６５为流动相，检测波长为２１０ｎｍ。ＺＴ测定最佳条件为：甲醇∶乙
腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）为１５∶１５∶７０为流动相，波长２６５ｎｍ。４种激素的进样量为２０μＬ，流
速为１ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为３５℃。选用外标法进行了定量测定。试验结果表明其回收率高，是一种
快速有效的测定方法。
关键词：高效液相色谱；内源激素；香蕉；根
中图分类号：Ｑ　９４６．８８５　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００１－０００９（２０１２）０８－００３０－０４
　　高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是一种精密准确的测定有
机物的方法，植物激素的 ＨＰＬＣ测定已在仁用杏花
芽［１］、甜樱桃［２］、梨［３］等果实，油菜、莴苣、鸭梨等［４］籽粒
上有所应用，但在香蕉中只有很少使用酶联免疫法测定
的报道，用ＨＰＬＣ法对香蕉根中内源激素的测定尚未见
报道；在对草本植物的内源激素的测定中由于色谱条件
和样品提取方法的限制［５］，一些研究结果存在分离效果
不理想、峰形不良、拖尾等问题。在已有报道的基础上，
该研究对样品的前处理方法进行了改进，使从植物组织
中提取的内源激素，保持其“天然”状态，同时，对色谱条
件进行比较和优化，摸索出一种操作简单、较快速、准
确、重现性好的方法，为同时测定香蕉根中３－吲哚乙酸、
赤霉素、脱落酸、细胞分裂素几种不同的植物内源激素
的含量提供了良好的ＨＰＬＣ法。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试香蕉品种“金手指”，由南亚热带作物研究所香
蕉研究室提供，取生长６～９片叶的“金手指”幼苗的根洗
净，迅速用液氮冷冻并放置于－８０℃冰箱待测。
试验仪器：美国ＰＥ　Ｓｅｒｉｅｓ　２００高效液相色谱仪，美
国Ｓｅｒｉｅｓ　２００紫外可变波长检测器，自动进样器，Ａｇｉｌｅｎｔ
ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ－Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ），Ａｇｉｌｅｎｔ
ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ－Ｃ１８４－Ｐａｃｋ保护柱（１２．５ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ），
ＳＨＢ?Ⅲ８循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公
司），旋转蒸发器ＲＥ－５２ＡＡ（上海亚荣生化仪器厂），
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　３２ＲＨｅｔｔｉｃｈ台式离心机，Ａｇｉｌｅｎｔ固相萃取仪，
Ａｇｅｌａ　ＤＯＳ　Ｃ１８固相萃取小柱，ＤＳ－５５１０超声仪，ＵＶ１７００
紫外分光光度计，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ纯水仪，ＪＡ３００３电子分析天
平，真空抽滤系统，０．２２μｍ有机微孔滤膜。
标准样品：赤霉素（ＧＡ３）、３－吲哚乙酸（ＩＡＡ）、脱落
酸（ＡＢＡ）、玉米素（ＺＴ），纯度≥９９．０％，均购自Ｓｉｇｍａ
公司。
化学试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙醇（分
析纯）、冰醋酸（分析纯）、十二水合磷酸氢二钠（分析纯）、
一水合柠檬酸（分析纯）、ＰＶＰＰ（分析纯）、乙酸乙酯（分析
纯）、正丁醇（分析纯）、三乙胺（分析纯）。
１．２　试验方法
１．２．１　香蕉根中内源激素的提取与纯化　提取纯化方
法按照曾辉等［６］的方法并进行改进，称取冻干样品１ｇ
左右，加入预冷的８０％甲醇８ｍＬ迅速研磨，于４℃冰箱
过夜，９　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液，再加入５ｍＬ
预冷的８０％甲醇冲洗，９　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，再取上
清液，于４０℃旋转蒸干去掉甲醇，加入ＰＶＰＰ约０．２ｇ
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北方园艺２０１２（０８）：３０～３３ ·研究简报·
摇匀，９　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液，用乙酸调节
ｐＨ至２．８（约加入乙酸８μＬ），用等体积乙酸乙酯萃取３
次，得乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯相用旋转蒸干仪
４０℃蒸干，用１ｍＬ　９５％乙醇溶解，加入ｐＨ　３．５的水充
分溶解，过Ｃ１８小柱，弃去滤液，用１．５ｍＬ甲醇洗脱Ｃ１８
小柱，收集洗脱液，滤液过０．２２μｍ有机微孔滤膜入进
样瓶，用于ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ的ＨＰＬＣ测定。水相用三乙
胺调ｐＨ至８．０，用８０％水饱和正丁醇等体积萃取３次，
取正丁醇相，６５℃旋转蒸发至干，加入１ｍＬ的９５％乙醇
溶解，再加入２ｍＬ的ｐＨ　８．０的水充分溶解，过Ｃ１８小
柱，弃去滤液，用１．５ｍＬ甲醇洗脱Ｃ１８小柱，收集洗脱
液，滤液过０．２２μｍ有机微孔滤膜入进样瓶，用于ＺＴ的
ＨＰＬＣ测定。
１．２．２　色谱条件的筛选　波长的筛选：分别在２１０和２５４
ｎｍ波长条件下对ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ混合标样进行色谱测
定，ＺＴ单标在２１０、２５４、２６５ｎｍ进行色谱测定。流动相的
筛选：设定进样量２０μＬ，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为３５℃的
色谱条件，考察不同流动相对样品的分离情况。（１）甲
醇∶乙腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶１５∶７０；（２）甲醇∶
乙腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５；（３）甲醇∶乙
腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２５∶６０。柱温的筛选：设
定进样量２０μＬ，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，选择流动相：甲醇∶乙
腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５时，分别设定３０、
３５、４０℃的柱温，观察标样的分离情况。流速的筛选：设定
进样量２０μＬ，柱温为３５℃，流动相：甲醇∶乙腈∶磷酸缓
冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５时，分别对流速０．８、１．０、１．２、
１．５ｍＬ／ｍｉｎ情况下的标样分离情况进行观察。
２　结果与分析
２．１　激素的提取与纯化
香蕉根在研磨过程中极易褐化，在该试验中选用
ＰＶＰＰ和Ｃ１８小柱去除色素和多酚类物质，在进行样品研
磨和旋转蒸发去掉甲醇后都加入ＰＶＰＰ，有研究表明活
性炭虽然对色素和酚类氧化物的吸附效果好但对激素
也有较强的吸附作用［７］，因此激素提取中不可用活性炭
去除色素。该试验中还利用石油醚去除多酚和色素，但
对香蕉的纯化效果不佳，并且会带走一部分激素。正丁
醇沸点１１７．７℃，因此蒸干较慢，试验中使用氮气吹干，
但最后损失较大而且也较慢，经试验证明在温度不超过
７０℃时对玉米素的影响不大，因此选用温度６５～７０℃蒸
干正丁醇。Ｃ１８小柱主要对内源激素进行收集，选择甲醇
为洗脱液对赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸和玉米素洗脱效
果都较好，另外４０％乙腈对玉米素的洗脱效果也较好，
该试验中均选用甲醇对４种激素进行洗脱。
２．２　波长的筛选
根据相关文献选择２１０和２５４ｎｍ波长，分别检测
ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ　３种混标，发现其在２１０ｎｍ波长条件下
各峰较好，而２５４ｎｍ的基线有漂移现象（图１、２）；根据
相关文献选择２１０、２５４、２６５ｎｍ的波长分别检测ＺＴ标
样，发现２６５ｎｍ的波长出峰较好，峰形较对称（图３），而
在２１０和２５４ｎｍ波长条件下明显拖尾，基线也较不平稳
（图４、５）。因此，选择ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ的检测波长为
２１０ｎｍ，ＺＴ的检测波长为２６５ｎｍ。
２．３　流动相的筛选
进样量２０μＬ，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为３５℃时，３
种不同流动相所得的色谱图见图６、７、８。流动相为甲
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·研究简报· 北方园艺２０１２（０８）：３０～３３
图５　２６５ｎｍ下ＺＴ标准品的色谱
醇∶乙腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶１５∶７０时出峰
时间为３０ｍｉｎ，时间过长，有拖尾现象，而流动相为甲
醇∶乙腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２５∶６０时，赤霉
素出峰较早，也有少许拖尾。而流动相为甲醇∶乙腈∶
磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５时，３种激素出峰时
间较好，峰型对称，综合考虑选择流动相为甲醇∶乙
腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５。
２．４　柱温的筛选
柱温分别设定３０、３５、４０℃时，分析ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ
和ＺＴ标准品的色谱图。结果表明，柱温对色谱图影响
不大，主要是对分析时间有影响。温度越高，各组分出峰
时间会略微提前。综合考虑激素的适宜保存温度和为避
免分析时间过长，经过筛选确定最佳测定温度为３５℃。
２．５　流速的筛选
分别研究了０．８、１．０、１．２、１．５ｍＬ／ｍｉｎ流速影响激素
的出峰时间的变化。结果发现，流速越大出峰时间越短，
综合考虑分析时间最终确定最佳流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
２．６　线性关系的测定
在所得最佳色谱条件下用外标峰面积法进行线性
关系的测定。将标准混合液稀释不同倍数得到一系列
质量浓度的标准品混合溶液，用峰面积（Ｙ）为纵坐标，质
量浓度为横坐标（Ｘ，ｍｇ／Ｌ）做线性回归曲线。得到各激
素的回归方程、线性范围、线性相关系数见表１。由表１
可知，各激素标准品的浓度与峰面积线性相关性较好，
均大于０．９９。
表１ 内源激素标准品的标准曲线
内源激素 回归方程 相关系数 线性范围
ＧＡ３　 ｙ＝２９　９６９ｘ＋４　９３４．６　 ０．９９３０　 １０～２００
ＩＡＡ　 ｙ＝９９１　２８９ｘ＋３２　１０４　 ０．９９９９　 ５～１００
ＡＢＡ　 ｙ＝３Ｅ＋０６ｘ＋２２４　５３５　 ０．９９８２　 ５～１００
ＺＴ　 ｙ＝４Ｅ＋０６ｘ＋６７　９４７　 ０．９９９８　 ５～１００
２．７　加标回收率与精密度的测定
准确吸取１ｍＬ样品待测液于离心管中，分别加入
４种植物激素各１ｍｇ，测定各激素含量。４次重复，计算
加标回收率。结果表明，ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＺＴ平均回收
率分别为９７．５％、９６．５％、９３．２％、９４．７％。将同一标准
品采用 ＨＰＬＣ法平行测定６次，４种激素ＧＡ３、ＩＡＡ、
ＡＢＡ、ＺＴ峰面积的相对标准偏差（ＲＳＤ）值分别为
１．４３％、１．５０％、１．８１％、２．６９％，均满足分析要求。
２．８　样品中内源激素含量的测定结果
利用该试验优化的色谱方法测定香蕉根中内源
激素的色谱图（图９、１０）。“金手指”幼苗根中 ＧＡ３、
ＩＡＡ、ＡＢＡ和ＺＴ的含量分别为１１．０６、７．１９、０．５５和
１４．５８μｇ／ｇ（折合为１ｇ鲜样中的含量）。
图９　样品的色谱
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北方园艺２０１２（０８）：３０～３３ ·研究简报·
图１０　样品的ＺＴ色谱
３　讨论
目前对于植物内源激素的测定方法较多的是使用
酶联免疫法和 ＨＰＬＣ法，酶联免疫法虽然较 ＨＰＬＣ简
单，但结果准确度不高，重复性差［８］。ＨＰＬＣ由于灵敏度
高、选择性强及数据处理能力好已越来越被国际上广泛
应用，所以建立简单、快速、高效的测定植物内源激素的
ＨＰＬＣ方法就十分具有实际意义。该试验对香蕉根中
内源激素的提取和ＨＰＬＣ方法进行了优化，发现ＧＡ３、
ＩＡＡ、ＡＢＡ　３种混合标样，在２１０ｎｍ波长条件下各峰较
好，而２５４ｎｍ的基线有漂移现象，ＺＴ标样在２６５ｎｍ波长
处出峰较好，峰形较对称，而在２１０和２５４ｎｍ波长条件下
有明显拖尾，基线也较不平稳，因此，选择ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ
的检测波长为２１０ｎｍ，ＺＴ的检测波长为２６５ｎｍ。当流
动相为甲醇∶乙腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶１５∶７０
时出峰时间过长，并且有拖尾现象，而流动相为甲醇∶
乙腈∶磷酸缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２５∶６０时，赤霉素出
　　　
峰较早，也有少许拖尾，而流动相为甲醇∶乙腈∶磷酸
缓冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５时，３种激素出峰时间较
好，峰型对称，因此选择流动相为甲醇∶乙腈∶磷酸缓
冲液（ｐＨ　３．５）＝１５∶２０∶６５。柱温和流速对色谱图影响
不大，主要是对分析时间略有影响，温度越高，各组分出
峰时间会略微提前，而流速越大出峰时间越短。综合考
虑，最佳柱温为３５℃，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
利用上述试验方法，其结果提取率高，基线分离清
晰，可得到满意的峰形、规范的色谱图，并在精密度、重
现性和回收率等方面可满足研究要求。
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源激素的影响［Ｊ］．四川农业大学学报，１９９１，９（２）：１９０－１９４．
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Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　５２４０９１）
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Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ；ｂａｎａｎａ；ｒｏｏｔ
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