全 文 ：收稿日期:2005-07-19　　　修回日期:2005-09-28
通讯联系人:许高燕 , 硕士研究生.
第 22卷第 5期
Vol. 22　No. 5 分 析 科 学 学 报JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE 2006 年 10 月Oct. 2006
文章编号:1006-6144(2006)05-0567-03
高效液相色谱-串联质谱法同时测定水溶性迷迭香提取物中
迷迭香酸 、阿魏酸和咖啡酸的含量
许高燕* , 刘莹雯 , 银董红
(湖南师范大学化学化工学院 ,长沙 410081)
摘　要:本文建立了一种同时快速测定水溶性迷迭香提取物中迷迭香酸 、阿魏酸和咖啡
酸含量的高效液相色谱-串联质谱(HPLC /M S /MS)分析方法 。以甲醇和 0. 1%乙酸铵
溶液为 HPLC的流动相;MS /M S使用多反应监测(MRM)扫描方式 ,在 3 min内可完
成迷迭香酸 、阿魏酸和咖啡酸三种化合物的分离分析。上述三种分析物在 5 ～ 500 ng /
mL 范围内线性良好(r>0. 999);检出限均低于 5. 0 ng /mL 。本法操作简便 、分析速度
快 、灵敏度高 ,可用于水溶性迷迭香提取物中迷迭香酸 、阿魏酸和咖啡酸含量的测定 。
关键词:迷迭香酸;阿魏酸;咖啡酸;液相色谱-质谱;迷迭香提取物
中图分类号:O657. 63　　　文献标识码:A
1　前言
迷迭香系唇形科迷迭香属常绿小灌木植物 。目前 ,有关迷迭香的研究主要集中于挥发性精油的研
究[ 1 - 3] ,而对迷迭香的水溶性成分的研究相对较少。据报道 ,迷迭香水溶性成分中含有迷迭香酸等多种活
性物质[ 4] ,其中的迷迭香酸在抗炎 、抗氧化 、抗花生四烯酸代谢 、抗血栓及增强纤溶性等方面都有明显作
用[ 5] 。因此 ,对迷迭香酸等迷迭香水溶性成分进行定量测定具有重要意义 。文献报道的定量检测迷迭香
酸的方法有:分光光度法[ 6] 、高效液相色谱法[ 7 , 8] 等 ,但迄今尚未见有对迷迭香水溶性成分进行同时定量检
测的报道 。
本文利用串联质谱(MS /M S)可同时快速测定多种物质的特性 ,使其作为高效液相色谱(HPLC)的检
测器 ,建立了快速 、同时测定迷迭香酸及阿魏酸和咖啡酸的 HPLC-MS /MS 分析法 ,并应用于水溶性迷迭
香提取物中有效成分迷迭香酸及阿魏酸和咖啡酸含量的测定 。方法具有操作简便 、分析速度快及灵敏度
高的特点 。
2　实验部分
2. 1　仪器和试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪;API3000三重四极杆质谱仪(美国 ,应用生物系统公司),配有电喷雾
离子源;A nalyst 1. 3. 2数据处理系统和WinZip1. 1定量软件 。
迷迭香酸对照品为美国 Sigma 公司产品(纯度 99. 8%);咖啡酸和阿魏酸对照品由中国药品生物制品
检定所提供;水杨酸(内标 ,上海三浦化工有限公司);甲醇(色谱纯 , DIMA Tech , USA);乙酸铵(色谱纯 ,
DIMA Tech , USA)。实验用水为二次蒸馏水并经 Mil li-Q系统纯化。
水溶性迷迭香提取物为海南舒普生物科技公司产品(批号:W-031201)。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　样品制备　准确称取水溶性迷迭香提取物粉末 10 mg ,超声溶解于甲醇(含 10 μg /L 水杨酸),定
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第 5 期 许高燕等:高效液相色谱-串联质谱法同时测定水溶性迷迭香提取物中迷迭香酸 、阿魏酸和咖啡酸的含量 第 22 卷
容至100 mL ,经 0. 45μm 滤膜过滤 ,用甲醇(含 10μg /L 水杨酸)稀释至含水溶性迷迭香提取物1μg /mL ,
待测 。
2. 2. 2　色谱条件　色谱柱为 ODS C18柱(50×2. 1 mm i. d. , 5 μm ,日本);流动相为甲醇-0. 1%乙酸铵水
溶液(95∶5 ,V /V),流速为 0. 2 mL /min ,柱温为 20℃,进样体积为 3 μL。以水杨酸为内标物进行测定。
2. 2. 3　质谱条件　离子源为 Turbo Ionspray(ESI 源),雾化气为 8 mL /min ,气帘气为 9 mL /min ,辅助加
热气为 7 mL /min ,辅助加热气温度为 425℃,碰撞气为 9 mL /min ,碰撞气压力 1. 9 Pa 。除碰撞气为氩气
外 ,其它三种气体均为氮气;电离电压为 - 4. 5 kV 。碰撞诱导解离(CID)电压为 25 V ;采用负离子模式检
测;扫描方式为多级反应监测(MRM)。
3　结果与讨论
3. 1　质谱分析条件的优化
将迷迭香酸 、咖啡酸 、阿魏酸和内标水杨酸标准品分别溶于甲醇 ,制成 100 ng /mL 溶液。通过注射泵
连续进样 ,采用负离子模式 ,三种化合物的子离子见图 1 。优化其它质谱条件 ,目标分析物和内标物的准
分子离子(Q1)及定性或定量子离子(Q3),最佳去簇电压(Declustering Po tential , DP)及碰撞能量(Colli-
sion Ene rg y ,CE)见表 1。
Fig. 1　Productions of ferulic acid(A), caffeic acid(B) and rosmarinic acid(C)
Table 1　Table 1　Characteristic parameters of the compounds analyzed by LC-MS
Compounds Q1(m /z) Q3(m /z) DP(V) CE(V)
Fe rulic acid 192. 9 177. 9 - 55. 0 - 21. 0
192. 9 133. 8a - 55. 0 - 18. 0
Caffeic acid 178. 9 134. 8a - 55. 0 - 22. 0
Rosma rinic acid 359. 1 197. 1 - 55. 0 - 25. 0
359. 1 160. 9a - 55. 0 - 25. 0
Salicy lic acid 136. 9 93. 1a - 55. 0 - 27. 0
　　　　　　a Quan tif ier ions .
3. 2　流动相的选择
采用 MS-MS进行定性及定量分析时 ,通过选定目标物对应的离子对 ,可以单独分析一种物质 ,共流
物对单一组分分析没有干扰。实验从分析的选择性及灵敏度的角度考虑 ,采用甲醇-水(含 0. 1%乙酸铵)
体系为流动相。在水中添加乙酸铵 ,目的是在电喷雾离子源条件下促进几种酸化合物的离子化。通过改
变流动相的配比来优化色谱洗脱条件。实验结果说明 ,随着流动相中水的比例增加 ,分析时间变长 ,峰形
变宽 ,并出现严重的拖尾现象 ,且灵敏度降低;而水含量过低时 ,峰形变窄 、对称性好 ,但灵敏度降低;当流
动相甲醇-水的比例为 95∶5(V /V)时洗脱最佳 。因此 ,最后选择甲醇-水(含 0. 1%乙酸铵)的配比 95∶5(V /
V)为流动相。
3. 3　线性范围 、检出限及重现性
将标准储备液(1 mg /mL)用甲醇(含 10 μg /L 水杨酸)稀释 ,配成 5 、10 、20 、50 、100 、200 、500 ng /mL
的标准溶液 ,依次进样 3μL ,在上述色谱 、质谱条件下分析检测。用加权 1 /C2 最小二乘法进行回归运算 ,
得线性回归方程分别为:迷迭香酸 Y =0. 0104X +0. 0034(r=0. 9990),咖啡酸 Y =0. 034X +0. 026(r=
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0. 9995),阿魏酸 Y =0. 031X +0. 002(r=0. 9992)。结果表明 ,待测物在 5 ～ 500 ng /mL 浓度范围线性良
好 ,方法的检出限均在 5 ng /mL 以内。对 50 ng /mL 的迷迭香酸 、咖啡酸和阿魏酸溶液进行 11次平行测
定 ,相对标准偏差(RSD)分别为 2. 7%、3. 5%和 4. 8%。
3. 4　加标回收实验及样品分析
取 2 mg 同一提取物样品粉末 6份 ,其中 3份作为对照 ,另外3份分别加入含迷迭香酸 、咖啡酸和阿魏
酸均为 60 、100 、200 μg 的标准品溶液(含 10 μg /L 水杨酸),按 2. 2. 1方法制备样品溶液并稀释至含迷迭
香提取物的浓度为 1. 0μg /mL 用以测定 。重复此实验过程三次 ,迷迭香酸的回收率为 84. 4%～ 93. 4%,
咖啡酸为 91. 1%～ 97. 2%,阿魏酸为 86%～ 91. 4%。
取水溶性迷迭香提取物样品溶液 3 μL 进样 ,连续 5次测定 ,水溶性迷迭香提取物中迷迭香酸 、咖啡
酸 、阿魏酸的含量分别为 6. 86%,3. 42%, 3. 93%。
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Simultaneous Determination of Rosmarinic Acid ,
Caffeic Acid and Ferulic Acid in Water-soluble
Extract of Rosemary by LC/MS/MS
XU Gao-yan , LIU Ying-wen ,YIN Dong-hong*
(College of Chem istry and Chemical E ngineering , Hunan Normal Univ ersity , Changsha 410081)
Abstract:A rapid LC /MS /MS method w as developed fo r the simultaneous determination of rosmarinic
acid , caffeic acid and ferulic acid. The mobile phase of HPLC was methanol-0. 1% ammonium ace tate
aqueous so lution. As to M S /M S , mult i-reaction moni to ring (MRM) scan w as employed , and a complete
analysis can finished in three minutes. The calibration curves fo r three analy tes w ere linear in the range
f rom 5 ng mL - 1 to 500 ng mL - 1 . The developed me thod w as rapid , accurate , robust and convenient ,
and it w as applied to the measurement of rosmarinic acid , caffeic acid and fe rulic acid concentrations in
w ater-soluble ext ract o f rosemary w ith satisfacto ry resul ts.
Keywords:Rosmarinic acid;Caffeic acid;Ferulic acid;Liquid Chromatog raphy-Mass Spect rometry;
Water-soluble ex tract of ro semary
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