全 文 ：FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食 品 科 技
2010年 第 35卷 第 12期
卷柏及其同属植物分布广泛，品种繁多。全
世界约有 700余种，我国约有 50余种，产于全国
各地。主要分布在广东、广西、福建、台湾、浙
江、江苏、江西、湖南、陕西，河北、山东、辽
宁、吉林等地。春秋两季均可采集，药源丰富。
卷柏很早就入药，药用全草，其性平、味微
辛。古代医家主要将生卷柏用于活血化瘀，治疗
跌打伤痛、腹痛、哮喘、月经闭止等症。炒卷柏
Two-step precipitation separation and silica gel chromatography
purification of amentoflavone from Selaginella tamariscina (Beauv.)
Spring
WEI Li-na, YUAN Qi-peng, KUANG Peng-qun, HAN Xue
(State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering, Beijing University of Chemical
Technology, Beijing 100029)
Abstract: Two-step precipitation separation and silica gel chromatography purification of amentoflavone from
Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring was studied. Crude extracts of Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring
were preliminarily purified by a two -step precipitation. Optimum eluent of silica gel chromatography was
determined by TLC and used for separation and purification of amentoflavone from Selaginella tamariscina
(Beauv.) Spring. The purity of product was increased from 5.92% to 58.19% by the two -step precipitation.
Chloroform/methanol(8∶1, v/v)was used as eluent for silica gel chromatography and amentoflavone product with
purity of 97.16% was obtained.
Key words: Selaginella tamariscina(Beauv)Spring; amenotflavoe; two-step precipitation; silica gel chro-
matography; separation and purification
魏丽娜， 袁其朋， 况鹏群， 韩 雪
(北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
摘要： 对卷柏中穗花杉双黄酮的提取和分离纯化的研究。通过两步沉淀法初步纯化卷柏提取物
粗品，采用薄层层析法选择最佳洗脱剂，用硅胶柱层析对卷柏中穗花杉双黄酮进行分离纯化研
究。结果表明，采用两次沉淀法使卷柏提取物的纯度由 5.92%升高至 58.19%。以氯仿/甲醇(8/1，
v/v)的混合溶剂为洗脱剂，得到穗花杉双黄酮产品的纯度为 97.16%。
关键词： 卷柏；穗花杉双黄酮；两步沉淀；硅胶柱层析；分离纯化
中图分类号： R 284.2 文献标志码： A 文章编号： 1005-9989(2010)12-0172-04
两步沉淀和硅胶柱层析法分离
纯化卷柏穗花杉双黄酮的研究
收稿日期： 2010-06-07
作者简介： 魏丽娜(1984—)，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为天然产物分离纯化。
提取物与应用
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DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2010.12.068
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(炭)用于止血，治疗月经过多、吐血、尿黄，研粉
外敷以止刀伤出血等[1]。卷柏经我国传统医学长期
临床实践及现代药理验证，确认其有清热解毒、
活血化瘀、止血抗癌、防癌治癌、抗炎、抗病
毒 [2]、抗感染、抗过敏[3]、镇痛、催眠、降血压、降
血糖、增强人体免疫功能等功效。其临床上主要
用于治疗闭经、吐血、尿血 [4]、便血、崩漏、脱
肛、跌打损伤、腹痛、哮喘等。
近年来，国内外学者对卷柏属植物的化学成
分进行了大量的研究。从卷柏属植物中主要得到
的是黄酮类化合物，而且其中以双黄酮类化学物
居多。目前关于卷柏中穗花杉双黄酮的分离纯化
方法报道较多 [ 5 -10 ]，但是存在成本高、工艺繁
琐、试剂耗费量大、分离时间长、操作复杂、能
耗大等缺点。本文比较了卷柏中穗花杉双黄酮的
提取方法，并采用两步沉淀和硅胶柱层析对其进
行纯化，得到高纯度的穗花杉双黄酮产品，为其
制备提供了一种工艺简单、可操作性强、成本低、
收率高且不额外使用其他有毒试剂、适合工业化
生产的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
卷柏：河北安国药都制药集团有限公司。
穗花杉双黄酮(Amentoflavone)对照品：北京汇
科同创科学仪器有限公司；甲醇：色谱纯，迪马
公司；水：超纯水，自制；其余试剂均为分析纯；
三氟乙酸：色谱纯，默克公司；薄层层析预制硅
胶板：HSGF254，烟台市化学工业研究所；硅胶：
200～300目，青岛海洋化工厂；层析柱：500 mm×
18 mm，上海锦华层析设备厂。
LC -20AT 岛津高效液相色谱仪：日本；
BP211D电子分析天平：德国赛多利斯集团；TDL-
5离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 高效液相色谱检测条件 色谱柱为 C18 柱
(250 mm×4.6 mm，5 μm，DiamodsilTM)，流动相为甲
醇和 0.1%TFA水溶液，柱温为 30 ℃，检测波长为
337 nm，流速 1.0 mL/min，进样量为 10 μL。采用
梯度洗脱模式，A 泵为 100%甲醇，B 泵为 0.1%
TFA水溶液。梯度洗脱程序见表 1。
1.2.2 标准曲线绘制 准确称取 3.94 mg穗花杉双
黄酮标准品溶于 1 mL 甲醇溶液，配制成浓度为
0.031、 0.062、 0.124、 0.247、 0.493、 0.985 mg/
mL。依次进样分析。以对照品浓度 X(mg/mL)与穗
花杉双黄酮峰面积平均值作图，结果经回归分析。
1.2.3 提取方法选择 比较回流提取法、超声提
取法、碱提酸沉法、微波提取法和半仿生提取法
等 5种提取方法。
1.2.4 两步沉淀工艺 由于卷柏提取物中含有较
多杂质，同时考虑到穗花杉双黄酮较高的脂溶性
及其易溶于乙醇的性质，探索将粗品溶解后调整
合适的醇-水比例，进一步微调溶解液的极性，将
与穗花杉双黄酮极性相差较大的杂质除去，对其
进行初步的纯化。
称取一定量卷柏粉末，提取。将提取液过滤
浓缩，蒸干得固体粉末。称取等量的提取物粉末，
溶于一系列醇浓度的溶液中，沉降一定的时间后，
离心，分别收集上清液和沉淀。测定上清液中穗
花杉双黄酮的含量和沉淀烘干至恒重，得到卷柏
中穗花杉双黄酮提取溶液的沉淀曲线。
1.2.5 硅胶柱层析纯化 由薄层层析所得洗脱剂、
洗脱剂配比进行卷柏粗提物硅胶柱层析的分离纯
化，摸索洗脱顺序、洗脱体积等操作参数，进行
卷柏粗提物的分离纯化。
将硅胶柱层析洗脱所得的产品洗脱液接样收
集。旋转蒸发仪蒸干后，称质量。精密称取一定
质量的产品，用一定量甲醇溶解，进行高效液相
色谱分析，计算纯度和回收率。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线
标准曲线为 Y =1.787 ×107X -5.395 ×104， r2 =
0.9999。穗花杉双黄酮在 0.031～0.985 mg/mL 范围
内有良好的线性关系。精密度试验相对标准偏差
(RSD)为 0.54%，重复性试验 RSD为 0.74%，稳定
性试验 RSD为 0.82%。加样回收率试验回收率平
均值 98.4%，RSD为 0.94%。该方法与现有文献方
法相比更经济、简便、快捷，采用梯度洗脱模式
的方法缩短了分析时间，节省了溶剂耗费，有很
好的分离效果。
表 1 梯度洗脱程序表
时间/min 流动相中 0.1%TFA水溶液配比/%
0.01 25
9.00 34
9.01 10
13.00 10
13.01 stop
提取物与应用
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2.2 提取方法比较
比较了回流提取法、超声提取法、碱提酸沉
法、微波提取法和半仿生提取法，并筛选了提取
溶剂，综合考虑提取率、能源耗费等因素，确定
卷柏中穗花杉双黄酮的最佳提取工艺为提取温度
75 ℃、料液比 1∶12、提取时间为 0.5 h。提取次数
为 2 次。80%乙醇水溶液回流提取的提取率为
93.24%，其提取物的纯度为 5.92%。重复性验证
实验的结果表明此条件下的提取率重现性良好。
2.3 两步沉淀工艺
称取 100 g 卷柏粉末，75 ℃回流提取，提取
液 80%乙醇，料液比 1 ∶12，提取 2 次，每次 0.5
h。将提取液过滤浓缩，蒸干得固体粉末。称取等
量的提取物粉末，溶于乙醇浓度分别为 0%、
10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%
的溶液中。沉降一定的时间后，离心，分别收集
上清液和沉淀。测定上清液中穗花杉双黄酮的含
量和沉淀烘干至恒重，得到卷柏中穗花杉双黄酮
提取溶液的沉淀曲线。
由图 1 可以看出，随着溶液中乙醇浓度的降
低，溶液中开始有沉淀生成，且生成的沉淀重量
不断增加。与此同时，上清液中穗花杉双黄酮的
含量则呈“S”型变化：随着溶液中乙醇浓度的降
低，刚开始清液中目标产物的含量基本变化不大，
在溶液乙醇浓度降到 70%时上清液中穗花杉双黄
酮的含量出现突变，而后迅速下降并在 40%降至
较低水平，随着乙醇浓度的进一步降低，清液中
目标产物的含量基本维持不变。乙醇浓度从 80%
降至 60%时，目标产物与溶液的极性相近，主要
存在于清液中；而与溶液极性相差较大的极性杂
质不断沉淀，对应得到的沉淀质量也在不断增加。
在乙醇浓度从 60%降至 40%时，上清液中穗花杉
双黄酮的含量骤降，此时有大量的穗花杉双黄酮
作为沉淀沉降，并在乙醇浓度为 40%沉降完全。
在乙醇浓度从 40%降至 0%时，清液中的目标产物
已大部分沉降到沉淀里，溶液中的非极性杂质与
乙醇溶液的极性相差较大，作为沉淀不断沉降。
因此选取乙醇浓度 70%、65%、60%和 50%、
45%、40%对沉降目标产物的合适乙醇浓度进行进
一步细化。结果发现，60%乙醇溶液能很好的沉降
极性杂质且保证绝大部分的目标产物仍存在于清
液里，45%乙醇溶液能使绝大部分目标产物沉降且
使较多的非极性杂质存在于清液中。
两步沉降的具体过程如下：
卷柏回流提取液浓缩后加水，使其乙醇浓度
为 60%，沉降一定时间后过滤；滤液再次浓缩，
加水使其乙醇浓度为 45%，沉降一定时间后离心，
弃上清液，所得沉淀即为目标产物。一次沉降目
标产物的回收率为 93.86%，二次沉降目标产物的
回收率为 95.46%；两步沉降的总回收率为
88.66%，所得产品纯度为 58.19%。
卷柏回流提取的粗提物的纯度为 5.92%，经两
步沉淀工艺初步纯化后，其纯度可达 58.19%，
且两步沉淀工艺的回收率高达 88.66%。可见两
步沉淀工艺是初步纯化卷柏回流粗提物的有效步
骤。该工艺利用溶液中目标产物与杂质极性的差
异，操作方便、工艺简单、未使用其他有机溶剂，
同时可兼顾纯度和回收率，得到较高纯度的目标
产物。
2.4 硅胶柱层析纯化
根据穗花杉双黄酮的结构和性质，以氯仿、
甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯及其不同
配比为薄层展开剂，筛选硅胶柱层析的洗脱剂
和配比。
Hexane ∶EtOAc 体系对粗品完全不能展开。
CHCl3∶MeOH 体系目标产物和杂质有不同程度的分
表 2 卷柏中穗花杉双黄酮提取液不同乙醇浓度上清液中
穗花杉双黄酮含量和沉淀质量
乙醇浓度/% 清液中穗花杉双黄酮含量/g 沉淀质量/g
0 0.002748 1.454
10 0.003816 0.9380
20 0.01396 0.7070
30 0.01131 0.6230
40 0.01046 0.5160
50 0.01984 0.4050
60 0.09764 0.3400
70 0.1157 0.2810
80 0.1194 0
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
沉
淀
质
量
/g
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
双黄酮含量
沉淀质量
0 20 40 60 80
乙醇浓度/%
双
黄
酮
含
量
/%
图 1 卷柏中穗花杉双黄酮提取液沉淀曲线
提取物与应用
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离，条带分隔较为明显，且 CHCl3∶MeOH=12∶1 时
开始有目标产物被洗脱下来，对该洗脱剂配比进
行进一步优化。 MeOH体系则将目标产物和杂质
全部洗脱。
将 CHCl3∶MeOH=12∶1 配比的洗脱剂进一步细
化筛选，其具体配比见表 4。
CHCl3∶MeOH 洗脱剂配比为 72∶3 和 72∶5 时可
较好的将目标产物与杂质分离，因此选用这两个
配比的洗脱剂作为硅胶柱层析的洗脱剂。
以卷柏粗提物 2步沉淀工艺后的粗品干法上
样，硅胶柱层析的洗脱剂、配比及洗脱顺序、洗
脱体积等参数详见表 5。
CHCl3∶MeOH=72 ∶3 体系主要洗脱弱极性的杂
质，随着洗脱体系中甲醇比例的增高，目标产物
被洗脱。目标产物被完全洗脱后，随着洗脱体系
中甲醇比例的进一步增加，粗品中的极性杂质被
洗脱下来。CHCl3∶MeOH体系洗脱剂配比 8∶1时所
得产品纯度可达 97.16%，回收率可达 50.74%。
为了提高硅胶柱层析的回收率，可将 CHCl3 ∶
MeOH=5∶1和 72∶5 的洗脱液合并，蒸干后再用甲
醇溶解，上样，重复上述洗脱过程，得到产品，
进而提高硅胶柱层析过程中目标产物穗花杉双黄
酮的回收率。
3 结论
通过两步沉淀法和硅胶柱层析法对卷柏中穗
花杉双黄酮进行了分离纯化。本方法工艺简单、
可操作性强、成本低、回收率高且不使用其他的
试剂，为其分离纯化提供了一条更优的方法。采
用两次沉淀法使卷柏提取物的纯度由 5.92%升高至
58.19%。以氯仿/甲醇(8/1，v/v)的混合溶剂为洗脱
剂，得到穗花杉双黄酮产品的纯度为 97.16%。
参考文献：
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表 3 硅胶层析洗脱剂及配比筛选
序号 洗脱剂 洗脱剂配比 Rf
1 CHCl3 Pure 0
2 CHCl3∶MeOH 12∶1 0.300
3 CHCl3∶MeOH 8∶1 0.629
4 CHCl3∶MeOH 5∶1 0.970
5 CHCl3∶MeOH 2∶1 1.000
6 CHCl3∶MeOH 1∶1 1.000
7 MeOH Pure 1.000
8 CH2Cl2∶MeOH 50∶1 0.257
9 CH2Cl2∶MeOH 15∶1 0.436
10 CH2Cl2∶MeOH 10∶1 0.941
11 Hexane∶EtOAc 9∶1 0
12 Hexane∶EtOAc 8.5∶1.5 0
13 Hexane∶EtOAc 6.5∶3.5 0
表 4 CHCl3∶MeOH体系洗脱配比优化
序号 洗脱剂 配比 Rf
1 72∶1 0
2 72∶2 0
3 CHCl3∶MeOH 72∶3 0.067
4 72∶4 0.162
5 72∶5 0.273
表 5 硅胶柱层析上柱洗脱(柱体积 V=100 mL)
序号 洗脱剂 配比 洗脱体积 纯度/% 回收率/%
1 72∶3 12V 4.456 1.458
2 CHCl3∶MeOH 72∶5 3V 56.80 13.35
3 8∶1 3V 97.16 50.74
4 5∶1 3V 73.96 32.83
5 MeOH Pure 3V 3.270 1.622
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