全 文 ：第 34 卷 增刊Ⅱ
2007 年
北 京 化 工 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING UNIVERSITY OF CHEMICAL TECHNOLOGY
Vol.34 , Sup.Ⅱ
2007
链霉菌转化阿魏酸生产香草酸
许美玲1　王　芳2＊
(北京化工大学 1.生命科学与技术学院;2.北京市生物加工重点实验室 , 北京　100029)
摘　要:选育一株链霉菌 S treptomyces 2036 , 能将阿魏酸转化为香草酸。通过培养基和发酵条件的优化 , 确定较适
培养条件为:葡萄糖 5g/ L ,酵母粉 5 g/ L;最佳发酵条件为:pH 5.0 , 摇瓶装液量 50 mL/ 250m L ,转速 130 r/min , 发酵
温度 30 ℃。在该条件下 , 链霉菌可在转接培养 16 h 后添加阿魏酸溶液 , 经 12 h 可将 1 g/ L 的底物阿魏酸转化为
0.261 g/ L 的香草酸 ,摩尔转化率为 30.2%。
关键词:链霉菌;微生物转化;阿魏酸;香草酸
中图分类号:TS264.3
收稿日期:2007-04-09
基金项目:国家自然科学基金(20576013);北京市科技计划
项目(D0205004040211)
第一作者:女 , 1981 年生 ,硕士生
＊通讯联系人
E-mail:wang fang@mail.buct.edu.cn
　　香草酸(vanillic acid),化学名称为 4-羟基-3-甲
氧基苯甲酸(4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid),是
香草醛生物合成途径中的重要前体物质 。且具有较
强的抗氧化 、抗菌活性[ 1] ,对食品呈香和浓香型白
酒呈香 、呈味也有重要作用。
Brunati
[ 2]等人的研究表明 ,链霉菌可以以阿魏
酸为前体物质发酵生成香草酸 ,但至今尚未有大规
模工业化的成功报道 。国内在这一方面 ,也还处于
起步阶段 ,现仅有孙志浩[ 3] 等人对黑曲霉进行培
养 ,可将阿魏酸转化为香草酸 。本文以选育的一株
链霉菌 Streptomyces2036为出发菌株 ,对培养基和
发酵转化条件进行优化 ,为大规模发酵制备香草酸
提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　菌种　链霉菌 Streptomyces2036 ,由本实验
室保存。
1.1.2　试剂　标准品阿魏酸 、香草酸 、香草醛 ,购于
Sigma公司;底物阿魏酸由浙江银河药业提供 ,甲醇
(色谱纯),冰乙酸。
1.1.3　培养基　斜面培养基(g/ L):葡萄糖 1 ,酵母
粉 1 , Na2HPO4 4 , KH2PO4 1 , NaCl 0.2 , MgSO4·
7H2O 0.2 ,CaCl2·2H2O 0.05 。将上述培养基的 pH
值调为 5.0即为种子培养基 。发酵培养基组成为葡
萄糖 5 g/L , 酵母粉 5 g/L ,其余同种子培养基。
1.2　实验方法
1.2.1　底物溶液的制备方法和添加方法　精确称
取一定量阿魏酸晶体 ,用 0.1mol/ L 的 NaOH 溶液 ,
将阿魏酸溶液调至pH 7.0[ 4] ,配制成 10 g/L 的钠盐
溶液 ,使用前经 0.22μm 微孔滤膜无菌过滤 。
1.2.2　培养及转化方法　接斜面菌体一环于种子
培养基中 ,摇床培养 48 h ,将种子液以 10%接种量
接入发酵培养基 ,发酵培养 16 h后 ,用灭过菌的移
液管吸取一定量制备好的阿魏酸钠溶液 ,加入到上
述培养基中 ,进行转化 。
1.2.3　香草酸摩尔转化率的计算　香草酸的摩尔
转化率=发酵液中产生的最大香草酸摩尔数/加入
培养基中的阿魏酸摩尔数。
1.2.4　阿魏酸和香草酸的 HPLC 测定 　色谱条
件:色谱柱 C18柱(Shim-pack Vp-ODS ,5μm , 4.6mm
×150mm);流动相为甲醇 ,水和冰乙酸(体积比为
40∶60∶0.5);流速为 1.0 mL/min;检测波长[ 5-6] 为
280 nm;柱温为 25 ℃;进样量为 10μL ,外标法定量。
2　结果与讨论
2.1　菌种培养条件的优化
2.1.1　碳源的筛选　以 1 g/L 的质量浓度分别添
加 6种碳源:葡萄糖 、果糖 、蔗糖 、乳糖 、麦芽糖 、淀
粉 ,培养种子 2 d ,以 10%(体积分数)接种量接入含
以上 6种碳源的发酵培养基中 ,生长 16 h ,加入 1 g/
L (以钠盐水溶液形式加入)阿魏酸 ,发酵液中香草
DOI :10.13543/j.cnki.bhxbzr.2007.s2.018
酸质量浓度随时间变化曲线如图 1所示 。由图 1可
知 ,以葡萄糖作为发酵培养基的碳源 ,发酵培养到
12 h时 ,香草酸的质量浓度达到最高值 0.119 g/ L ,
所以选择葡萄糖作为发酵培养基的碳源 。
图 1　培养基的碳源筛选
Fig.1　Selection of carbon source fo r the culture
2.1.2　葡萄糖质量浓度的影响　选择不同质量浓
度的葡萄糖为碳源 ,转化 12 h 检测香草酸的质量浓
度 ,结果如图 2所示 。当葡萄糖的质量浓度<5 g/L
时 ,随着葡萄糖质量浓度的升高香草酸的质量浓度
随之升高 ,葡萄糖的质量浓度在 5 g/L 以上时 ,香草
酸的产量呈下降趋势 ,可能是高浓度葡萄糖抑制了
阿魏酸到香草酸的转化。
图 2　碳源质量浓度的影响
Fig.2　Effect of carbon source on the production of
vanillic acid
2.1.3　氮源的筛选　用 1 g/ L 的酵母粉 、牛肉粉 、
蛋白胨为氮源 ,培养种子 2 d ,以 10%(体积分数)接
种量接入含上述氮源的发酵培养基中 ,生长 16 h ,加
入为 1 g/ L(以钠盐水溶液形式加入)阿魏酸 ,发酵液
中香草酸质量浓度随时间变化曲线如图 3所示。当
以蛋白胨作为氮源时 ,香草酸的产量较低 ,以酵母粉
作为发酵培养基的氮源时 ,香草酸的产量浓度要比
以牛肉粉为氮源时略高一些 ,因此选择酵母粉作为
发酵培养基的氮源。
2.1.4　酵母粉质量浓度的影响　选择不同质量浓
度酵母粉为氮源 ,转化 12 h检测香草酸的浓度 ,结
果如图 4所示。随着酵母粉质量浓度的升高香草酸
的质量浓度随着升高 ,酵母粉质量浓度在 5 g/L 以
上时 ,其质量浓度变化对香草酸的产量影响不大 ,所
以选择酵母粉质量浓度为 5 g/L 最好 。
图 3　培养基的氮源筛选
F ig.3　Selection of nitrogen source for the culture
图 4　氮源质量浓度的影响
Fig.4　Effect of nitrogen source on the production of
vanillic acid
2.2　菌种转化条件的优化
2.2.1　发酵初始 pH 值对香草酸生成的影响　将
发酵培养基的 pH 调成不同梯度进行实验 ,pH 对香
草酸生成量的影响如图 5所示 。从图 5可以看出 ,
pH 为 5时转化效果最好 ,这可能是香草酸在碱性条
件下不稳定 ,转化反应主要发生在酸性条件下。
2.2.2　发酵温度对香草酸生成的影响　图 6为温
度对发酵液中香草酸浓度的影响 ,从图 6 可以看出
发酵温度对香草酸的生成量影响较大 ,42 ℃下未见
香草酸生成 ,而在 30 ℃时香草酸的产量达到了最
大 ,这可能是提高温度有利于提高菌体中酶的活性 ,
但当反应温度过高时 ,又会使菌体及其酶失活 ,所以
选择 30 ℃作为最佳发酵温度。
2.2.3　摇床转速对香草酸生成的影响　摇床转速
·100· 北京化工 大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年
图 5　发酵初始 pH 值对香草酸生成的影响
Fig.5　Effect o f different pH on the production
of vanillic acid
图 6　发酵温度对香草酸生成的影响
Fig.6　Effect of fermentation tempera ture on the
production of vanillic acid
的大小直接关系到溶氧及代谢物的传质速度 。选取
摇床转速为 100 ～ 190 r/min范围内进行发酵 ,结果
如图 7所示 。当摇床转速为130 r/min时 ,菌丝球大
小适中 ,团聚性好 ,香草酸的产量最高 ,所以选择摇
床转速为 130 r/min。
图 7　摇床转速对香草酸生成的影响
Fig.7　Effect of rotation speed on the
production of vanillic acid
2.2.4　摇瓶装液量对香草酸生成的影响　用 250
mL 的三角瓶 ,分别装不同体积的发酵液进行转化
实验 ,结果如图 8所示。当摇瓶装液量为 50 mL/
250mL 时香草酸的浓度最高 ,因此选择摇瓶装液量
为 50mL ,说明转化阶段时偏高的溶解氧条件下更
有利于香草酸的生成。
图 8　摇瓶装液量对香草酸生成的影响
Fig.8　Effect of medium volume on the production
of vanillic acid
2.3　底物添加对香草酸生成的影响
2.3.1　底物质量浓度对香草酸生成的影响　向发
酵培养基中分别加入不同质量浓度的阿魏酸进行转
化 ,转化 12 h后 ,所得香草酸的质量浓度及摩尔转
化率如表 1。由表 1 可以看出 ,即使提高底物阿魏
酸的质量浓度也不能显著提高产物香草酸的质量浓
度 ,加入 3 g/L 的阿魏酸 ,香草酸的质量浓度也仅有
0.291 g/ L ,而此时的转化率却降为 11.2%,当添加
1 g/ L的阿魏酸时 ,香草酸的产量要比添加 0.5 g/L
阿魏酸时有明显提高 ,而转化率仅下降了 0.031%,
因此综合考虑选择 1 g/L 阿魏酸的添加量较为合
适 。
表 1　阿魏酸质量浓度对香草酸产量及摩尔转化率的影响
Table 1　Effect of ferulic acid concentration on the
production of vanillic acid
ρ底物/(g/ L) ρ香草酸/(g/ L) 摩尔转化率/ %
0.5 0.144 33.3
1 0.261 30.2
2 0.282 16.3
3 0.291 11.2
4 0.136 3.90
5 0.086 2.00
2.3.2　底物流加次数对香草酸生成的影响　将种
子液以 10%接种量接入发酵培养基培养 16 h后 ,添
加 1g/L 的阿魏酸溶液 ,以后每隔 12 h向其中流加1
g/L 阿魏酸溶液进行转化 ,共流加 5次 ,所得香草酸
·101·增刊Ⅱ　　　　　　　　　　　　　　许美玲等:链霉菌转化阿魏酸生产香草酸
质量浓度及摩尔转化率如表 2所示 。由表 2可以看
出 ,流加两次时香草酸的质量浓度最高 ,但转化率却
随之降低 ,比较一次流加与两次流加可以看出 ,流加
两次时香草酸的质量浓度仅比一次流加提高了
0.089g/L ,转化率却下降了 10%,相当于多加的 1
g/L 的阿魏酸只转化生成了 0.089 g/L 的香草酸 ,
流加的效果不好 ,原因可能是产物香草酸对转化的
抑制更主要 。当香草酸产生后 ,由于香草酸对菌体
的毒性 ,使得菌体将阿魏酸代谢为其他副产物 ,或者
是将香草酸代谢为其他副产物 ,所以阿魏酸还是一
次性加入为好。
表 2　阿魏酸流加次数对香草酸生成的影响
Tab.2　Effect of the number of ferulic acid additions on the
production of vanillic acid
底物流加次数 ρ香草酸/(g/ L) 摩尔转化率/ %
1 0.261 30.2
2 0.350 20.2
3 0.197 7.58
4 0.048 1.39
5 0.031 0.716
3　结论
当发酵培养基中葡萄糖为 5 g/L ,酵母粉 5 g/L
时 ,将种子液以 10%接种量接入发酵培养基 ,转接
16 h后添加 1 g/ L 阿魏酸钠溶液 ,在摇瓶装液量为
50mL/250mL ,初始 pH 值 5.0 , 30 ℃, 130 r/min条
件下发酵 12 h ,香草酸的质量浓度即达到最大为
0.261 g/L ,摩尔转化率为 30.2%。
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Streptomyces biotransformation of ferulic acid to vanillic acid
XU MeiLing
1　WANG Fang2
(1.College of Life S cience and Technology;2.Beijing Key Laboratory of Bioprocess,
Beijing Universi ty of Chemical Technology , Bei jing 100029 , China)
Abstract:Streptomyces2036 w as screened fo r it s abili ty to transform ferulic acid to vanillic acid.The optimal
medium was found to contain glucose(5 g/L)and yeast ex tract(5 g/L).Cultures in 250 mL flasks containing
50mL medium were brought to pH 5.0 and incubated by shaking at 150 r/min at 30℃.Under these conditions ,
S treptomyces2036 produced vanillic acid w hen ferulic acid w as added 16h af ter inoculation.After a further 12 h ,
1g/L ferulic acid w as transformed to 0.261 g/ L vanillic acid w ith a molar yield of 30.2%.It w as show n that in-
tracellular enzyme w as mainly responsible for catalyzing the t ransfo rmation of ferulic acid to vanillic acid.
Key words:Streptomyces2036;bio transformat ion;ferulic acid;vanillic acid
·102· 北京化工 大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年