全 文 ：华北农学报·2012，27(2) :44 -49
收稿日期:2011 － 12 － 25
基金项目:国家自然科学基金项目(30800704) ;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2011 － 29)
作者简介:孙静文(1977 －) ，男，吉林榆树人，副研究员，博士，主要从事土壤重金属污染的植物修复研究。
通讯作者:周 卫(1966 －) ，男，江西湖口人，研究员，博士，主要从事植物营养分子生理研究。
苋菜 AmPCS基因的克隆及表达载体构建
孙静文，程明芳，梁国庆，王秀斌，周 卫
(中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所，农业部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081)
摘要:合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络
合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建，旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理，通过 RT-
PCR和 RACE方法克隆苋菜 PCS基因。序列分析表明:苋菜 PCS基因 cDNA全长 1 770 bp，包含完整的阅读框，编码
485 个氨基酸;苋菜 PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜 PCs合成酶相似性为 91. 96% ～ 95. 67%，其氨基酸序列
N端有 1 个 Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C 端有 1 个 Pfam:Phytochelatin_C 结构域(功能
为重金属离子感应器)。因此，推断苋菜 PCS基因编码蛋白是 PCS-like家族的新成员，具有催化合成植物络合素的功
能，将它在 GenBank注册，序列号为:JN979370，命名为 AmPCS。在 AmPCS基因的编码区加入 BamH I和 Sac I酶切位
点，双酶切植物表达载体 pBI-121 和带有酶切位点的 PCR产物，成功获得苋菜 PCS基因正义表达载体 pBI-PCS。
关键词:苋菜;植物络合素;克隆;AmPCS基因;植物表达载体
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2012)02 － 0044 － 06
Cloning of AmPCS Gene from Amaranthus mangostanus
and Construction of Its Plant Expression Vectors
SUN Jing-wen，CHENG Ming-fang，LIANG Guo-qing，WANG Xiu-bin，ZHOU Wei
(Institute of Agricultural Resource and Regional Planning，CAAS /Ministry of Agriculture Key
Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer，Beijing 100081，China)
Abstract:The synthesis of phytochelatins (PCs)represents a major heavy metal detoxification mechanism in
higher plants. To contribute to the development of the phytoremediation removing Cd from the soil，a PCS gene was
cloned according to homologous gene conserved region by RT-PCR and RACE method from Amaranthus mangostan-
us L. ，a typical Cd hyperaccumulator named Tianxingmi. Its full-length cDNA is 1 770 bp and encodes a polypep-
tide of 485 amino acids with an entire ORF. The AmPCS protein showed high homology to other PCS-like proteins
such as Arabidopsis thaliana、Thlaspi caerulescens、Brassica napus and Brassica juncea between 91. 96% and
95. 67% identity. The AmPCS protein contains a N terminal Pfam:Phytochelatin domain known as a heavy-metal-in-
duced phytochelatin catalysis center and a C terminal Pfam:Phytochelatin _C domain known as a heavy metal
sensor. Therefore，the present results suggested that the PCS gene from Amaranthus mangostanu might be a novel
member of the PCS-like family with the function of phytochelatins synthesis. This gene named AmPCs has been sub-
mitted to GenBank with the accession number JN979370. The plant expression vector pBI121 and AmPCS gene with
BamHI 和 SacI site were digested by these two restriction enzymes，were ligated and recombinant，and then plant ex-
pression vector pBI-PCS was successfully constructed.
Key words:Amaranthus mangostanus;Phytochelatins;Cloning;AmPCs;Plant expression vector
植物络合素(PCs)是一类非蛋白多肽，其结构
通式为(γ-Glu-Cys)n-X，n 一般为 2-11，X 常为甘氨
酸，也可以是丙氨酸或丝氨酸。植物络合素(PCs)
不能由基因直接编码，必须在植物络合素合成酶
2 期 孙静文等:苋菜 AmPCS基因的克隆及表达载体构建 45
(PCS)的催化下完成［1 － 2］。在重金属如 Cd、As、Hg、
Cu、Ag、Pb和 Zn诱导下，植物和酵母都可以迅速产
生 PCs［2 － 6］。PCs 的产生是高等植物解 Cd 毒的普
遍机制［1，4，7 － 8］。在拟南芥和烟草中过量表达 At-
PCS1，可以明显提高模式植物对镉的抗逆性［4］，但
是这种耐镉性还取决于内源谷胱甘肽的浓度［9］。
还原型谷胱甘肽(GSH)或 PCs 的水平决定植物对
Cd 的累积及抗 Cd的能力［10］。PCs-Cd 复合物是 Cd
由细胞质进入液泡的主要形式［6］。PCs 在解 Hg 和
Cu 毒方面也发挥一定的作用［5］。Wojas 等［6］和
Gisbert等［11］研究证明了 PCs 对 Pb、As 污染土壤的
植物修复也发挥着重要作用［6，11］。因此，自 PCs 被
发现命名后，其作用概括起来主要有 2 方面:一是直
接与毒性重金属络合形成配体复合物而保护植株免
受毒害，另外通过 PCs －重金属复合物运转及区室
化来调节植物体内重金属离子的平衡，从而降低重
金属对植物的毒害。
苋菜品种天星米 (Amaranthus mangostanus L. )
具备镉超富集植物的特征，可以用作深入研究植物
镉超富集机制的试验材料［12］。在生理水平已经初
步揭示苋菜通过分泌有机酸，降低土壤专性吸附态
Cd，提高土壤交换态 Cd、碳酸盐结合态 Cd 以及有
机结合态 Cd，从而增加苋菜根系及地上部的镉含
量。然而，苋菜品种天星米镉超富集分子机制目前
还不清楚。PCS基因从模式植物拟南芥及重金属超
富集植物遏蓝菜及 Arabidopsis halleri(十字花科，鼠
耳芥属)的成功克隆［1，8，13］，为从苋菜成功分离 PCS
基因以及深入研究镉超富集的分子机制奠定基础。
因此，本研究以天星米为试验材料，采用 RT-PCR结
合 RACE 方法(cDNA 末端快速扩增法)克隆苋菜
PCS基因全长序列，利用生物信息学方法分析该基
因序列结构和功能，构建了 PCS 基因正义植物表达
载体。本研究对进一步通过模式植物异源表达来验
证 PCS基因的生物学功能以及深入揭示植物镉超
富集的分子机制具有十分重要意义。
1 材料和方法
1. 1 植物培养
苋菜品种天星米(Amaranthus mangostanus L. )
从国家蔬菜种质资源中期库购置。种子经消毒后，
播种于蛭石与草炭 1:1 混合基质中，幼苗生长出
3 ～ 4片真叶后，移至事先盛有营养液的育苗盆培养。
培养溶液为 Hogland营养液。环境温度(28 ± 2)℃，
相对湿度(70 ± 5)%，光照 /黑暗时间为 14 h /10 h。
生长 20 d 后，用液氮将样品迅速冷冻，在 － 80℃冰
箱保存。
1. 2 苋菜植物络合素合酶 PCS基因的克隆
采取 TRizol提取方法，TRizol 试剂购自天根公
司。取苋菜根系 0. 1 g，液氮研磨后，装入用 DEPC
处理过的 1. 5 ml离心管中，以后的操作方法完全参
照天根公司 TRizol说明书。
反转录及 PCR反应均采用 Bio-Rad 公司 MyCy-
cler 型 PCR 仪。反转录反应参数为:70℃变性 5
min，置于冰上 5 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min。PCR
反应参数为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃
80 s，循环 30 次;72℃ 10 min。反转录及 PCR 反应
所使用的相关试剂购自 TAKARA 公司。大肠杆菌
(E． coli DH5α)感受态细胞由本实验室制备。引物
合成由上海生工公司完成，基因测序由北京三博远
志公司完成。
1. 2. 1 苋菜 PCS基因完整编码框序列的克隆 首
先，以 Adaptor-dT为引物(5-GATTTCTGTCCGACGA
CTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3) ，以从苋菜根系所提取
的总 RNA为模板，进行反转录合成第一链 cDNA。
然后，根据 GENBANK中已公布的拟南芥(Arabidop-
sis thaliana)、芥菜(Brassica juncea)、遏蓝菜(Thlaspi
caerulescens)、油菜(Brassica napus)及 Arabidopsis
halleri(十字花科，鼠耳芥属)5 种植物 PCS 基因的
编码区上下游核苷酸序列，利用 DNAMAN软件设计
2 个兼并引物 PCS-up(5-ATG GCT ATG GCG AGT
(C /T /G)T(A /G /C)TA -3)和 PCS-Down(5-(T /
C) (T /C)A A(A /T)A GGC AGG (A /T)GC A
(G /A)C GA-3)。最后，采用 RT-PCR 方法，以苋
菜根系新合成的 cDNA 为模板，用简并引物 PCS-up
和 PCS-Down 配对，进行 PCR 扩增，克隆苋菜 PCS
基因完整编码框序列。
1. 2. 2 苋菜 PCS基因 3及 5序列的克隆 根据已
经获得的苋菜 PCS基因编码框序列，设计 2 个特异
性引物:PCS-3-1 和 PCS-3-2 (5-GCTGAAATCTT-
GTCGGGAAC-3和 5-TGTGAAATGCGTCAAAGGTC-
3) ，分别与 Adaptor-dT 引物配对，以苋菜 cDNA 为
模板，参照 TAKARA 公司 3RACE 试剂盒说明书，
分离苋菜 PCS 基因 3＇端序列。同时，设计 3 个 5端
特异性引物:PCS-5-1、PCS-5-2 和 PCS-5-3(5-GAG-
GATACTTGAAACGAGCAAC-3、5-AAAGTGACCAG
TCCCAGTCTGC-3 和 5-ACAAACTTGCGGAAATCG
TC-3) ，参照 Invitrogen公司 5RACE 试剂盒的说明
书，分离苋菜 PCS基因 5端。
1. 3 苋菜 PCS基因编码蛋白的生物信息学分析
利用 DNAMAN 6. 0 软件对 AmPCS基因进行序
46 华 北 农 学 报 27 卷
列分析。利用 SMART 数据库占线分析(http:/ /
smart. embl-heidelberg. de)苋菜 PCS 基因编码蛋白
的功能。采用 MEGA4. 1 软件的 NJ 法(Neighbor-
Joining，邻接法)构建系统进化树，并进行 bootstrap
检验。
1. 4 苋菜 PCS基因正义表达载体的构建
pBI-121 表达载体由本实验室保存。各种限制
性内切酶及 T4连接酶购于 TAKARA公司。
根据苋菜 PCS基因编码区序列设计引物，在 5
端引物末端加入 BamH I 酶切位点(G /GATCC) ，在
3端引物末端加入 Sac I 酶切位点(GAGCT /C)。下
划线为酶切位点。上下游引物分别为:5-AT-
GGATCC-ATGGCTATGGCGAGTTTATATC-3和 5-G
C-GAGCTC-CTAATAGGCAGGAGCAGCGAGA-3。 用
BamH I 和 Sac I 双酶切植物表达载体 pBI-121 和
PCR产物，T4连接酶连接，构建苋菜 PCS 基因正义
表达载体 pBI– PCS(图 5)。
2 结果与分析
2. 1 苋菜 PCS基因的克隆
由于 PCS基因编码区的上下游 2 端非常保守
(图 1) ，依据同源克隆原理，可以采用普通的 RT-
PCR技术分离苋菜 PCS 基因编码区全长的序列。
根据拟南芥、芥菜、遏蓝菜、油菜、Arabidopsis halleri
(十字花科，鼠耳芥属)5 种植物编码区序列，在起始
密码子和终止密码子区域设计一对简并引物 PCS-
up和 PCS-Down。以苋菜根系 cDNA 为模板，进行
PCR扩增，最后扩增出一段 1. 5 kb 左右的特异片
段，回收该特异片段，进行测序。测序结果表明，该
片段长度为 1 458 bp(图 2 中实线框内序列)。
图 1 苋菜 AMPCS基因上下游编码区与其他植物 PCS基因同源性比对
Fig. 1 Comparison of the AMPCS gene with other plants PCS genes on 5 and 3 end of Open Reading Frame
获得 PCS基因编码区序列后，可以采用 RACE
克隆技术分离 PCS基因 3及 5非编码区。
根据苋菜 PCS 基因编码框序列，设计 2 个特异
性引物:PCS-3-1 和 PCS-3-2，分别与 Adaptor-dT 引物
配对，进行两轮嵌套 PCR扩增，扩增出一段 400 bp左
右的特异片段，回收该片段并测序。测序结果表明，
该片段长度为 432 bp(图 2中 3端虚线框内序列)。
然后分离苋菜 PCS 基因 5端序列。根据苋菜
PCS基因编码框序列，设计 3 个特异性引物:PCS-5-
1、PCS-5-2 和 PCS-5-3，进行 1 轮反转录和 2 轮嵌套
PCR扩增，在 800 bp左右处出现特异条带。测序结
果表明该片段长度为 857 bp(图 2 中 5端虚线框内
序列)。
利用 DNAMAM 软件将克隆到的编码区 3端和
5端序列进行拼接，获得苋菜 PCS基因 cDNA的全长
序列(图 2)。该拼接序列在编码与已克隆的编码区
序列完全相同。将此基因全长 cDNA 序列在 Gen-
Bank中注册，序列号为:JN979370，命名为 AmPCS。
2. 2 苋菜 AmPCS 基因的序列分析及编码蛋白的
结构功能预测
利用 DNAMAN 6. 0 软件对 AmPCS 基因的全长
cDNA序列进行分析(图 2) ，该基因序列全长为
1 770 bp，5和 3端非编码序列长度分别为 102 bp
和 210 bp，包括一个完整的开放阅读框，编码 485个氨
基酸，推测其分子量为 54. 422 kDa，等电点值为 6. 67。
利用 SMART数据库占线分析(http:/ smart． em-
bl-heidelberg. de)苋菜 PCS基因编码蛋白的功能，推
测该蛋白具有一个 Pfam:Phytochelatin 结构域(起始
于第 2 个氨基酸结束于第 217 个氨基酸) ，该结构域
的功能为受重金属诱导催化合成植物络合素的三分
子;同时该蛋白还具有 Pfam:Phytochelatin_C 结构域
(起始于第 220 个氨基酸结束于第 465 个氨基酸) ，
该结构域的功能为作为重金属离子感应器，结合并
转移镉离子等重金属离子，使之接近 N-端的催化中
心，激活 Pfam:Phytochelatin结构域的催化合成植物
络合素的功能(图 3)。
2 期 孙静文等:苋菜 AmPCS基因的克隆及表达载体构建 47
图 2 苋菜 PCS基因 cDNA全长序列及其编码蛋白
Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the AMPCS cDNA
图 3 利用 SMART对苋菜 PCS基因编码蛋白的功能结构分析
Fig. 3 Functional domain of the AMPCS gene by SMART bioinformatics analysis
2. 3 苋菜 PCS 基因编码蛋白与其他 PCS 类蛋白
的相似性及系统进化树分析
在 GENBANK 中搜索 PCS 类蛋白，利用 DNA-
MAN 软件对这些蛋白进行相似性分析发现，苋菜
PCS蛋白与遏蓝菜、Arabidopsis halleri、拟南芥、芥菜
和油菜相似性最高，分别为 91. 96%，93. 81%，
95. 05%，95. 26%，95. 67%;而与烟草、莴苣和苣荬
菜相似性不高，分别为 63. 47%，64. 39%，65. 59%;
与单子叶植物水稻相似性最低，仅为 43. 02%。系
统进化树分析表明，苋菜 PCS 蛋白与印度芥菜和油
菜 PCS 蛋白聚类在一起，并且明显以拟南芥、烟草、
水稻 3 种模式植物为代表聚成 3 类，并且 3 类分枝
48 华 北 农 学 报 27 卷
之间同源性相差很远(图 4)。进行 bootstrap检验发
现，分枝之间的 bootstrap 值均大于 82，说明本研究
采用 MEGA4. 1 软件的 NJ 法构建的系统进化树结
果较为可靠。
2. 4 苋菜 PCS基因正义植物表达载体的构建
植物表达载体 pBI-121 含有 Xba I、BamH I、Sma
I和 Sst I、Sac I 酶切位点，利用 DNAMAN 软件分析
苋菜 PCS基因的编码区，没有找到 BamH I 和 Sac I
酶切位点。因此，采用 PCR方法在 PCS基因的编码
区加入 BamH I和 Sac I酶切位点，用 BamH I和 Sac
I同时酶切植物表达载体 pBI-121 和带有酶切位点
的 PCR产物，用 T4连接酶连接，转化筛选阳性克隆，
就可以获得苋菜 PCS 基因正义表达载体 pBI-PCS
(图 5)。采用 PCR及双酶切 2 种方法进行鉴定，发
现均扩增及双酶切出一条大约 1. 5 kb的片断(图 6-
A，B) ，说明成功构建出苋菜 PCS 基因正义植物表
达载体 pBI-PCS。
图 4 苋菜 PCS基因编码蛋白的系统进化树分析
Fig. 4 Phylogenetic tree of the AMPCS
protein with other PCS-like proteins
图 5 苋菜 PCS基因正义植物表达载体构建流程图
Fig. 5 Construction of the plant expression vector pBI-AMPCS
3 讨论
土壤重金属污染的治理一直是国际上研究的热
点与难点，植物修复技术以其成本低、不破坏土壤和
河流生态环境、不引起二次污染等优势，表现出广阔
的市场前景［14］。植物络合素是一类非核糖体合成
的多肽，它的生物合成是高等植物减轻重金属毒害
的重要机制［1 － 2］。植物络合素(PCs)的生物合成以
谷胱甘肽为前体，在植物络合素合成酶(PCS)的催
化下完成。目前，PCS基因已经从拟南芥、烟草及遏
蓝菜等植物克隆［1，7 － 8］。在模式植物烟草、拟南芥过
量表达 AtPCS1 和 CePCS 基因发现:与野生型相比，
转基因植物体内砷和镉的浓度显著增加，但其生长
发育仍然正常，表现出对重金属砷和镉很强的耐受
性［6，9］。这在分子水平证实 PCS基因具有减轻植物
重金属毒害的功能。在本研究中，依据同源克隆原
理，采用 RT-PCR和 RACE技术，从镉超富集苋菜品
种天星米中成功分离 PCS 基因 cDNA 全长序列;并
且在 AmPCS基因的编码区加入 BamH I 和 Sac I 酶
切位点，将 AmPCS基因的编码区成功重组到植物表
达载体 pBI-121 CaMV35 启动子后面，获得苋菜 PCS
基因正义表达载体 pBI-PCS。这为进一步通过模式
植物异源表达 PCS基因，从而鉴定该基因的生物学
功能奠定重要基础。
2 期 孙静文等:苋菜 AmPCS基因的克隆及表达载体构建 49
A. PCR鉴定:1. 表达载体 pBI-121;2. 未转化菌株;M. Marker III;3 －
6. 携带重组质粒 pBI-PCS菌株;B. BamHI和 SacI双酶切鉴定:1 － 4.
重组质粒 pBI-PCS;M. Marker III;5. 表达载体 pBI-121。
A. PCR analysis:1. pBI-121;2. negative control;M. Marker III;3 －
6. PCR amplification of pBI-PCS;B. BamHI and SacI digest analysis:1 －
4. recombinant plasmid pBI-PCS;M. Marker III;5. pBI-121.
图 6 重组质粒 pBI-PCS的 PCR及双酶切鉴定
Fig. 6 Identification of recombinant plasmid pBI-PCS
by PCR and two restriction enzyme analysis
苋菜 PCS基因编码蛋白与不同植物 PCS 合成
酶同源性区别很大，与水稻 PCS 蛋白相似性最低，
仅为 43. 02%。与油菜 PCs 蛋白相似性最高，为
95. 67%。但是进一步系统进化树分析发现，植物
PCS合成酶可以聚合成 3 类，以水稻为代表的单子
叶植物一类，双子叶植物中又分别以模式植物拟南
芥和烟草为代表聚成二类;而苋菜 PCS 基因编码蛋
白与拟南芥为代表分枝聚类在一起，与拟南芥、遏蓝
菜、芥菜和油菜等植物的相似性在 91% 以上
(图 1，4)。
植物 PCS基因编码蛋白在氨基酸序列的 N 端
含有一个合成植物络合素三分子聚合体的催化中
心［15］，即 Pfam:Phytochelatin 功能结构域;在氨基酸
序列的 C 端含有一个重金属离子感应中心［16］，即
Pfam:Phytochelatin_C功能结构域，其功能为作为重
金属离子感应器，结合并转移镉离子等重金属离子，
使之接近 N-端的催化中心，激活 Pfam:Phytochelatin
结构域的催化合成植物络合素。采用 SMART 数据
库分析苋菜 PCS基因编码蛋白的功能，发现该蛋白
具有一个 Pfam:Phytochelatin 结构域，位于 2 ～ 217
氨基酸之间;同时该蛋白也具有 Pfam:Phytochelatin_
C结构域，位于 220 ～ 465 氨基酸之间(图 3)。
总之，基于以上同源相似性及生物信息学分析，
推断苋菜 PCS基因编码蛋白是 PCS合成酶家族的新
成员，具有催化合成植物络合素的功能，将它在 Gen-
Bank注册，序列号为:JN979370，命名为 AmPCS。
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