全 文 ：Plackett-Burman联合星点设计优选甜瓜蒂中葫芦素的提取工艺
郭梦鸿， 孙玉琦* ， 刘 影， 颜冬雪， 沈丽萍
(辽宁医学院，辽宁 锦州 121001)
收稿日期:2015-01-18
基金项目:辽宁医学院校长基金项目 (XZJJ20130103)
作者简介:郭梦鸿 (1989—) ，女，硕士，从事新型中药制剂研究。Tel:18841610865，E-mail:gmhlu13@ 126． com
* 通信作者:孙玉琦 (1978—) ，男，副教授，从事中药新剂型与新技术的研究。Tel: (0416)4673439，E-mail:cpusyq@ 163． com
摘要:目的 运用 Plackett-Burman联合星点设计 (central composite design，CCD)-响应面法 (ＲSM) ，优化甜瓜蒂中
葫芦素的提取工艺。方法 通过 Plackett-Burman设计确定主要影响因素，选取乙醇体积分数、提取时间、提取温度为
自变量，以提取物中总葫芦素含有量、葫芦素 B含有量、总葫芦素提取率为响应值，利用星点设计-效应面法进行预
测分析。结果 确定葫芦素的提取工艺为 8 倍量无水乙醇提取 3 次，每次 90 min，提取温度为 75 ℃。此条件下甜瓜
蒂提取物中总葫芦素含有量为 20. 57%、葫芦素 B含有量为 13. 69%、总葫芦素提取率为 11. 93%。结论 最佳工艺条
件验证结果与预测结果相近，可用于提取甜瓜蒂中葫芦素成分。
关键词:甜瓜蒂;总葫芦素;葫芦素 B;Plackett-Burman;星点设计-响应面法
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)09-1937-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 09. 014
Optimizing extraction of cucurbitacins from Pedicellus melo by Plackett-Burman
design and central composite design
GUO Meng-hong， SUN Yu-qi* ， LIU Ying， YAN Dong-xue， SHEN Li-ping
(Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)
KEY WOＲDS:Pedicellus melo;total cucurbitacins;cucurbitacin B;Plackett-Burman;central composite design-
response surface method (CCD-ＲSM)
甜瓜蒂为葫芦科植物甜瓜 Cucumis melo L． 的
干燥成熟果蒂，别名瓜蒂、苦丁香、瓜丁等。具有
涌吐痰食、除湿退黄、保肝抗癌之功效。甜瓜蒂中
含有一系列高度氧化的四环三萜类化合物———葫芦
素成分，包括葫芦素 B、E、D，异葫芦素 B，葫芦
素 B葡萄糖苷等［1］。葫芦素类成分具有多种潜在
药理作用［2-3］，广泛用于抗炎和抗癌研究。其中，
葫芦素 B 为其主要活性成分，具有保肝抗癌、影
响细胞间信号转导、增强毛细血管通透性、改善微
循环等功效［4-5］。研究表明，葫芦素 B 具有确切的
抗肿瘤作用，可用于肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素
瘤、胰腺癌等［6-10］多种肿瘤疾病，并且其抗癌作用
具有生物功能选择性［11］。
Plackett-Burman设计可通过较少次数实验从众
多因素中筛选主要影响因素，从而避免在后期优化
时由于部分因子影响不显著而浪费资源［12］。星点
设计 (CCD)-响应面法 (ＲSM)［13］可研究变量间
相互作用，是一种多元非线性拟合的设计方法。通
过描绘因素的响应面及叠加等高线图，能够在设定
的实验区域内，找到一个明确的函数式来表达各因
素与响应值之间的关系，从而找到整个区域中考察
因素的最佳组合和响应的最优值［14］。本研究基于
Plackett-Burman实验设计，筛选影响提取效果的主
要因素，结合星点设计-响应面法，优选甜瓜蒂中
葫芦素的提取工艺，并验证方法的可行性，为甜瓜
蒂中葫芦素成分的开发利用提供基础依据。
1 仪器与材料
UV-2550 型 UV-Vis 分光光度计 (日本岛津公
司) ;L-2000 Elite 高效液相色谱仪，配有 L-2130
高压恒流泵，L-2455 DAD检测器，D-2000 Elite 色
谱数据处理工作站 (日本日立公司) ;ＲE-52A 旋
转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂) ;AL204 电子天
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平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。
葫芦素 B 对照品 (中国食品药品检定研究院，
批号 111945-201301，纯度 96. 9%)。甜瓜蒂 (产地河
北省保定市)。色谱纯甲醇 (天津市科密欧化学试剂
有限公司);香草醛 (上海瀚思化工有限公司);冰醋
酸、浓硫酸、甲醇、无水乙醇均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 UV-Vis分光光度法测定总葫芦素
2. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取葫芦素 B 对
照品 10. 0 mg，置 50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容
至刻度，摇匀，即得葫芦素 B 对照品溶液 (0. 2
mg /mL)。
2. 1. 2 标准曲线的建立 取不同体积葫芦素 B 对
照品溶液分别置 10 mL量瓶中，依次加入 5%香草
醛-冰醋酸溶液 2. 0 mL、浓硫酸 1. 0 mL，70 ℃恒温
反应 30 min，冰醋酸定容，摇匀，543 nm处测定吸
光度，以吸光度为纵坐标 (A1) ，葫芦素 B 质量浓
度为横坐标 (C1) ，得回归方程 A1 = 21. 163C1 +
0. 097 6 (r = 0. 999 6) ，葫芦素 B 在 4. 0 ～ 64. 0
μg /mL范围内呈良好线性关系。
2. 1. 3 精密度试验 精密量取葫芦素 B 对照品溶
液 0. 8 mL 于 10 mL 量瓶中，按 “2. 1. 2”项下方
法测定吸光度，连续测定 6 次，计算 ＲSD 值为
0. 93%。结果表明仪器的精密度良好。
2. 1. 4 稳定性试验 精密量取葫芦素 B 对照品溶
液 0. 8 mL 于 10 mL 量瓶中，按 “2. 1. 2”项下方
法测定吸光度，测定时间为 60 min，时间间隔为
10 min。结果显示在 60 min 内吸光度的 ＲSD 为
4. 96%，而在 10 ～ 30 min 内的 ＲSD 为 1. 05%，表
明该方法在 30 min 内稳定，超过 30 min 后稳定性
下降。
2. 1. 5 加样回收率试验 精密吸取成分含有量已
知供试品溶液 0. 1 mL于 10 mL量瓶中，平行 9 份，
分别加入低、中、高质量浓度葫芦素 B 对照品溶
液，按“2. 1. 2”项下方法测定吸光度。平均回收
率为 99. 57%，ＲSD为 1. 26%。
2. 2 HPLC法测定葫芦素 B［15］
2. 2. 1 色谱条件 Diamonsil C18 色谱柱 (200
mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相为甲醇-水 (61 ∶
39) ;检测波长 228 nm;体积流量 1. 0 mL /min;进
样量 20 μL。
2. 2. 2 方法学考察［15］ 按 “2. 2. 1”项下色谱条
件，分别对线性关系、精密度、稳定性、重复性、
加样回收率进行考察，得回归方程 A2 = 47 622C2 －
39 234 (r = 0. 999 6) ，线性范围 4. 0 ～ 64. 0
μg /mL，精密度、稳定性、重复性、加样回收率结
果如表 1。
表 1 方法学考察结果
Tab. 1 Ｒesult of methodological study
精密度
ＲSD /%
稳定性
ＲSD /%
重复性
ＲSD /%
加样回收试验
平均回收率% ＲSD /%
葫芦素 B 0. 75 0. 67 0. 91 99. 41 1. 06
结果表明精密度良好，供试品溶液在 24 h 内
稳定，且方法重复性较好，加样回收率结果符合定
量测定要求。
2. 3 样品制备与测定 取甜瓜蒂药材粗粉约 20. 0
g，精密称定，置于 250 mL圆底烧瓶中，加入一定
量不同体积分数乙醇，分次提取，过滤，合并滤
液，减压浓缩，干燥，得干燥粉末，称定质量。精
密称取干燥粉末 50. 0 mg置 10 mL量瓶中，甲醇溶
解、定容，得供试品溶液。精密量取供试品溶液
0. 1 mL，置 10 mL量瓶中，按 “2. 1. 2”项下方法
制备样品，于 543 nm 处测定吸光度，根据回归方
程计算总葫芦素含有量 (以葫芦素 B 计)。另取供
试品溶液，按 “2. 2. 1”项下色谱条件进行检测，
计算葫芦素 B 含有量。总葫芦素提取率 (%) =
提取物质量 /药材质量 × 100%。
2. 4 Plackett-Burman实验设计筛选主要影响因素
2. 4. 1 Plackett-Burman 实验设计及结果 选用
Plackett-Burman设计对甜瓜蒂中葫芦素成分提取工
艺影响因素的显著性进行考察。实验设计 5 个因素
(A乙醇体积分数，B 料液比，C 提取时间，D 提
取次数，E提取温度) ，6 个空白因素 (F，G，H，
I，J，K)。根据单因素考察结果确定每个因素高、
低两种水平 (+ 1， － 1) ，以总葫芦素含有量、葫
芦素 B含有量、总葫芦素提取率为响应值。Plack-
ett-Burman实验设计因素及水平见表 2，结果见
表 3。
表 2 Plackett-Burman设计因素及水平
Tab. 2 Factors and levels of Plackett-Burman design
水平
因素
A B C D E F G H I J K
－ 1 75 8 30 2 60 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1
1 100 12 90 3 80 1 1 1 1 1 1
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表 3 Plackett-Burman设计结果
Tab. 3 Ｒesult of Plackett-Burman design
试验号
因素 响应值
A B C D E F G H I J K 总葫芦素 /% 葫芦素 B /% 总葫芦素提取率 /%
1 75 12 30 3 80 3 1 1 1 － 1 － 1 18. 50 11. 10 13. 76
2 100 12 30 2 60 5 － 1 1 1 － 1 1 16. 80 10. 08 12. 12
3 100 8 90 3 60 5 1 1 － 1 － 1 － 1 14. 30 8. 58 11. 63
4 100 8 90 3 80 3 － 1 － 1 1 － 1 1 10. 10 6. 06 7. 69
5 75 12 90 3 60 3 － 1 1 － 1 1 1 19. 90 11. 94 13. 51
6 75 8 30 2 60 3 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 11. 50 6. 90 10. 43
7 100 12 90 2 60 3 1 － 1 1 1 － 1 14. 70 8. 82 11. 57
8 75 8 90 2 80 5 － 1 1 1 1 － 1 17. 90 10. 74 12. 05
9 100 8 30 2 80 3 1 1 － 1 1 1 16. 50 9. 90 11. 97
10 75 12 90 2 80 5 1 － 1 － 1 － 1 1 16. 60 9. 96 12. 55
11 100 12 30 3 80 5 － 1 － 1 － 1 1 － 1 18. 80 11. 28 13. 17
12 75 8 30 3 60 5 1 － 1 1 1 1 14. 30 8. 58 9. 15
2. 4. 2 分析与结论 采用 Design-Expert 8. 0 软件
对各因素进行显著性分析，通过 Pareto 图［16］判定
各因素显著性，每个因素效应的大小由条形图所占
比例表示，各因素显著性分析结果见图 1。
图 1 响应值的 Pareto图
Fig. 1 Pareto charts of response values
通过以上结果可知，影响因素中乙醇体积分
数、时间、温度、次数对响应值有交叉性影响，其
中提取次数对葫芦素 B 含有量和总葫芦素提取率
表现出显著性则选择提取 3 次，而料液比对各响应
值均不具有显著性，结合实际意义选择料液比为
1 ∶ 8。由此，确定乙醇体积分数、时间、温度作为
显著性影响因素。
2. 5 星点设计-效应面优化实验
2. 5. 1 星点设计-效应面实验设计及结果 根据
Plackett-Burman 实验结果结合星点设计-响应面原
理，以乙醇体积分数 (X1)、时间 (X2)、温度
(X3)为考察因素，总葫芦素含有量 (Y1)、葫芦
素 B含有量 (Y2)、总葫芦素提取率 (Y3)为响应
值进行优化实验。分析因素及水平见表 4，实验设
计方案与结果见表 5。
表 4 星点设计因素及水平
Tab. 4 Factors and levels of CCD
因素
水平
－ 1. 682 － 1 0 1 1. 682
X1 75 80. 07 87. 5 94. 93 100
X2 30 42. 16 60 77. 84 90
X3 60 64. 05 70 75. 95 80
2. 5. 2 工艺优化与预测 应用 Design-Expert 8. 0
实验设计软件，分别绘制三维效应面图 (图 2)。
采用效应面等高线叠加法对葫芦素成分提取工
艺进行优化，先固定总葫芦素及葫芦素 B 含有量
模型中次要因素 X3，考察显著因素 X1、X2 对 Y1、
Y2、Y3 的交互影响，再固定总葫芦素提取率模型
中次要因素 X2，考察显著因素 X1、X3 对 Y1、Y2、
Y3 的交互影响，分别绘制叠加等高线图，确定提
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取条件的最优化区域 (图 3) ，结合以上三维效应
面图，优化得到最佳工艺为乙醇体积分数
98. 95%，提 取 时 间 77. 84 min，提 取 温 度
75. 95 ℃。此条件下，各响应值的预测理论值分别
为总葫芦素 20. 57%，葫芦素 B 13. 69%，总葫芦
素提取率 11. 93%。考虑到实验的可操作性，最终
确定提取条件为乙醇为无水乙醇，时间 90 min，温
度 75 ℃。
表 5 星点设计实验结果
Tab. 5 Ｒesult of CCD
试验号 X1 /% X2 /min X3 /℃ 总葫芦素 /% 葫芦素 B /% 总葫芦素提取率 /%
1 0. 000 0. 000 0. 000 19. 95 11. 97 14. 73
2 1. 000 － 1. 000 － 1. 000 16. 88 10. 13 11. 89
3 0. 000 0. 000 1. 682 20. 08 12. 65 13. 55
4 － 1. 000 － 1. 000 1. 000 18. 87 11. 32 15. 20
5 0. 000 － 1. 682 0. 000 14. 88 8. 13 13. 61
6 0. 000 0. 000 － 1. 682 19. 42 10. 65 11. 63
7 1. 000 1. 000 － 1. 000 22. 05 13. 23 11. 81
8 0. 000 0. 000 0. 000 18. 18 10. 91 14. 15
9 － 1. 682 0. 000 0. 000 13. 73 8. 46 15. 31
10 － 1. 000 1. 000 － 1. 000 14. 23 8. 94 14. 57
11 1. 000 － 1. 000 1. 000 15. 78 9. 27 12. 15
12 0. 000 0. 000 0. 000 19. 00 11. 40 14. 90
13 1. 682 0. 000 0. 000 19. 97 11. 98 12. 14
14 － 1. 000 － 1. 000 － 1. 000 14. 95 8. 97 14. 73
15 0. 000 1. 682 0. 000 23. 35 14. 01 14. 48
16 0. 000 0. 000 0. 000 19. 30 11. 58 14. 69
17 0. 000 0. 000 0. 000 19. 35 11. 61 14. 58
18 － 1. 000 1. 000 1. 000 19. 12 12. 89 15. 81
19 1. 000 1. 000 1. 000 23. 32 13. 99 14. 42
20 0. 000 0. 000 0. 000 19. 23 11. 54 14. 89
图 2 各响应值三维效应面图
Fig. 2 3D analysis charts of response values
图 3 优化模型等高线叠加图
Fig. 3 Overlapping figures of the contour plots of optimum model
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2. 5. 3 提取工艺验证 为了确定模型预测与实验
结果一致性进行验证试验。提取工艺为 8 倍量无水
乙醇，75 ℃提取 3 次，90 min /次，平行 3 次，取
平均值，计算偏差率 ［偏差率 = (真实值 －预测
值)/预测值 × 100%］。实验结果见表 6。
表 6 葫芦素类成分提取工艺验证结果 (n =3)
Tab. 6 Ｒesult of verification test for cucurbitacins extrac-
tion technology (n =3)
响应值 X1 /% X2 /min X3 /℃ 预测值 /% 测得值 /% 偏差率 /%
Y1 20. 57 20. 31 ± 1. 25 － 1. 26
Y2 100 90 75 13. 69 13. 56 ± 1. 91 － 0. 95
Y3 11. 93 11. 95 ± 1. 37 0. 17
3 讨论
为了保证实验的精度，缩小 Plackett-Burman
实验设计各因素范围，前期实验中，以总葫芦素含
有量、葫芦素 B含有量及总葫芦素提取率为指标，
对影响因素 (提取溶剂、提取溶剂浓度、料液比、
提取时间、提取次数、提取温度)进行了单因素
考察，确定乙醇为提取溶剂较好，同时明确了各影
响因素的试验范围。
实验中采用 Plackett-Burman 实验设计联合星
点设计-效应面法优化甜瓜蒂中葫芦素成分的提取
工艺，可以评价因素与响应值间的非线性关系，使
精确度更高、指导性更强。Pareto 图筛选显著因素
更加直观，操作简便易于理解，利于实验的显著性
分析。对星点设计-效应面实验的数据进行多元回
归拟合，由二次多元回归方程可知，P 值均为 P ＜
0. 000 1，表明模型显著;且模型相关系数 Ｒ2 值均
较大，说明可信度良好，方程与实际情况拟合较
好。同时，通过方差分析，确定各响应值的主要影
响因素，利于等高线叠加分析［17］。该分析方法，
可实现成分含有量与提取率的同步优化，实验中对
多个指标考察，形成多因素综合评价，得到具有实
际应用价值的葫芦素成分提取的工艺参数。
验证结果表明，实验中所建立的数学模型具有
较佳的预测性，实验设计有较高的可靠性，为葫芦
素类成分的分离纯化提供了实验基础。
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