全 文 ：DOI:10． 3724 /SP． J． 1096． 2011． 00867
高速逆流色谱分离制备甜瓜蒂中葫芦素类化合物
金再宿1 田红梅1 唐 岚1 饶桂维2 方应国2 李成平* 2
1(浙江工业大学药学院，杭州 310014) 2(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)
摘 要 采用高速逆流色谱法分离制备了甜瓜蒂中 3 种葫芦素类化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水
(1． 2∶ 0． 8∶ 0． 8∶ 1． 2，V /V)为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相。在主机转速 800 r /min、流动相流
速2． 0 mL /min、分离温度 25 ℃、检测波长 254 nm条件下进行分离，所得产物纯度经 HPLC 检测，结构经 MS、
1H-NMR 和13C-NMR 鉴定。4 h内从 200 mg 经 XAD-16 大孔树脂预处理的粗提物中一步分离制备得到 33． 5
mg葫芦素 B、21． 7 mg葫芦素 E和 14． 9 mg葫芦素Ⅰ，纯度分别为 99． 1%、98． 3%和 97． 5%，结构经鉴定与文
献相符。
关键词 高速逆流色谱;甜瓜蒂;葫芦素 B;葫芦素 E;葫芦素Ⅰ
2010-11-25 收稿;2011-01-05 接受
本文系浙江省中药现代化专项(No． 20060356)和浙江省教育厅科研项目(No． Y201018938)资助
* E-mail:hzlicp@ 163． com
1 引 言
甜瓜蒂(Pedicellus Melo)为葫芦科植物甜瓜(Cucumis melo)的干燥成熟果柄。具有涌吐痰食、除湿
退黄的功效。甜瓜蒂中含有的葫芦素(Cucurbitacins)类化合物具有抗肿瘤、保肝、抗炎、提高机体免疫
力、改善肠胃等功能［1 ～ 3］。目前，市场上用于治疗肿瘤疾病的葫芦素片主要为葫芦素 B 和 E 的混合物。
根据中药现代化的发展趋势，将葫芦素进一步分离纯化，对提高其疗效和生物利用度以及增加靶向性都
非常关键，有利于在抗肿瘤药效发挥的同时降低葫芦素类药物的毒性［4］，并且有助于进行以葫芦素为
指标性成分的药材及相关制剂的质量控制。
高速逆流色谱(High-speed counter current chromatography，HSCCC)是一种不需要任何固体支撑体
或载体的液-液分配色谱技术［5］。具有样品回收率高、分离能力强、应用范围广、仪器操作简单、分离量大
等优点，因此被广泛应用于天然产物的分离制备［6 ～ 9］。本实验采用 XAD-16大孔树脂从甜瓜蒂中制备得到
粗提物，以高速逆流色谱分离纯化粗提物，经一步洗脱分离得到 3 种葫芦素类化合物，分别为葫芦素 B、葫
芦素 E和葫芦素Ⅰ，结构见图 1。利用 HSCCC快速分离多种葫芦素类成分的研究尚未见报道。
图 1 甜瓜蒂中分离出的化合物结构式
Fig． 1 Chemical structure of compounds separated from Pedicellus melo
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂
TBE-300A高速逆流色谱仪(深圳同田生化技术有限公司) ;HX-1050 型恒温循环器(北京博医康实
验仪器有限公司) ;UVD-200 紫外检测仪(北京市新技术应用研究所) ;TBP-50A恒压恒流微量泵(上海
同田生化技术有限公司) ;BSZ-100 型自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂) ;N2000 色谱数据工作站
第 39 卷
2011 年 6 月
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 6 期
867 ～ 871
(浙江大学智达信息工程有限公司) ;1200 型高效液相色谱仪(美国 Aglient 公司) ;KQ-250DE 型医用数
控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司) ;PTHW型电热套(河南爱博特科技发展有限公司) ;R-210 型旋
转蒸发仪(瑞士 Buchi公司)。
甜瓜蒂(安徽省亳州市真源堂药业有限公司) ，经浙江工业大学药学院生药教研室鉴定符合《中国
药典》2010 年版一部规定;正己烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司) ;
乙腈(色谱纯，德国默克公司) ;水为二次蒸馏水。
2． 2 甜瓜蒂粗提物的制备
将甜瓜蒂药材适当粉粹，称取粗粉 300 g，加入 10 倍体积的 65%乙醇回流提取 3 次，每次 1． 5 h，过
滤，合并滤液减压浓缩至无醇味。将浸膏水溶后过 XAD-16 大孔树脂柱，静止吸附 1． 0 h 后，依次用
30%，50%和 95%乙醇进行洗脱。接收 50%乙醇洗脱物，减压浓缩至浸膏后真空干燥，得浅黄色粉末
10． 5 g，冷藏，备用。
2． 3 两相溶剂的选择
本实验采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂体系，按不同配比混合摇匀，静置后各取上下相
2． 0 mL，加入放有约 1 mg样品的试管中，漩涡振荡，待两相分层且澄清后，分别取上下相 1 mL，旋转蒸
干，各加入 1． 5 mL 甲醇溶解，分别各进行 HPLC 测定，计算其分配系数 K。
2． 4 高效液相色谱条件
Extend C18色谱柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm，美国 Aglient 公司) ;流动相:乙腈-水(50∶ 50，V /V) ;流
速:1． 0 mL / min;检测波长:228 nm;柱温 25 ℃;进样量 10 μL。
2． 5 高速逆流色谱分离条件
在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水两相溶剂系统，将其充分振摇后静置，分取上相为固定
相，下相为流动相，两相分别超声脱气 30 min。主机转速为 800 r /min，流动相流速 2． 0 mL /min，分离温
度 25 ℃，检测波长 254 nm，进样量 200 mg，以上下相各取 5 mL，进样。
3 结果与讨论
3． 1 HSCCC体系的选择结果
本实验采取了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系，考察了 6 种不同体系配比下葫芦素 B、葫芦素 E和葫
芦素Ⅰ的分配系数和分离因子，结果见表 1。实验表明，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1． 2∶ 0． 8∶ 0． 8
∶ 1． 2，V /V)溶剂体系时，可得到最佳的分配系数和分离因子。本实验选择此体系分离样品。
表 1 化合物在不同溶剂体系中的分配系数(K)和分离因子(α)
Table 1 Partition coefficient and separation factor of components in different systems
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水
n-Hexane-ethylacetate-methanol-water
(V /V)
分配系数 Partition coefficient (K)
葫芦素 B
Cucurbitacin
B
葫芦素 E
Cucurbitacin E
葫芦素Ⅰ
Cucurbitacin Ⅰ
分离因子 Separation factor (α)
葫芦素 B与 E
Cucurbitacin
B and E
葫芦素 E与 I
Cucurbitacin
E and I
1∶ 1∶ 1∶ 1 0． 56 0． 65 0． 71 1． 20 1． 09
1∶ 0． 8∶ 0． 8∶ 1 0． 86 1． 12 1． 47 1． 34 1． 31
1． 2∶ 0． 8∶ 0． 8∶ 1． 2 0． 96 1． 61 2． 61 1． 68 1． 62
1． 2∶ 1∶ 0． 8∶ 1 0． 97 0． 99 1． 17 1． 02 1． 18
1． 2∶ 1∶ 1∶ 1 0． 68 1． 04 1． 54 1． 53 1． 48
3． 2 HSCCC分离纯化的结果
用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1． 2∶ 0． 8∶ 0． 8∶ 1． 2，V /V)体系分离甜瓜蒂粗提物，进样量 200 mg，HSC-
CC分离情况见图 2。经分离得到 3个主要组分峰 A、峰 B和峰 C，固定相保留率为 59%，分离效果良好。
3． 3 产物纯度的测定
采用 2． 4 项的 HPLC方法检测，甜瓜蒂粗提物的色谱图见图 3。经 HSCCC 分离所得 3 个峰的色谱
图见图 4。3 个化合物的纯度经测定分别为峰 A 99． 1%，峰 B 98． 3%和峰 C 97． 5%。去溶剂后干燥称
重，分别为 33． 5，21． 7 和 14． 9 mg。
868 分 析 化 学 第 39 卷
图 2 粗提物的高速逆流色谱图
Fig． 2 High-speed counter-current chromatographic
(HSCCC)chromatogram of crude extract
图 3 甜瓜蒂粗提物的 HPLC色谱图
Fig． 3 HPLC chromatogram of crude extract from Pedicel-
lus Melo
图 4 HSCCC主要峰(A，B，C)的 HPLC色谱图
Fig． 4 HPLC chromatogram of fractions obtained by HSCCC(A，B，C)
3． 4 产物结构的鉴定
将 HSCCC分离得到的组分峰 A，B 和 C，分别进行1H-NMR，13C-NMR，ESI-MS 测定，确定其化学
结构和分子质量。结果如下:
组分峰 A:ESI-MS (m/z) :559［M + H］+;1H-NMR (500 MHz，CD3CL3) :δ 2． 31 (1H，m，H-1a) ，1．
23 (1H，m，H-1b) ，4． 42 (1H，m，H-2) ，5． 79 (1H，m，H-6) ，2． 42 (1H，m，H-7a) ，1． 99 (1H，m，H-7b) ，
1． 98 (1H，m，H-8) ，2． 75 (1H，brs，H-10) ，3． 23 (1H，d，J = 10． 3 Hz，H-12a) ，2． 67 (1H，d，J = 11． 2
Hz，H-12b) ，1． 87 (1H，dd，J = 9． 0 Hz，3． 7 Hz，H-15a) ，1． 44 (1H，dd，J = 9． 5 Hz，6． 8 Hz，H-15b) ，4． 35
(1H，m，H-16) ，2． 50 (1H，d，J = 3. 5 Hz，H-17) ，0． 98 (3H，s，H-18) ，1． 07 (3H，s，H-19) ，1． 44 (3H，s，
H-21) ，6． 48 (1H，d，J = 7． 5 Hz，H-23) ，7． 06 (1H，d，J = 8． 2 Hz，H-24) ，1． 54 (3H，s，H-26) ，1． 57
(3H，s，H-27) ，1． 28 (3H，s，H-28) ，1． 34 (3H，s，H-29) ，1． 36 (3H，s，H-30) ，2． 01 (3H，s，H-
O2CCH3) ;13C-NMR (125 MHz，CD3CL3) :δ 35． 99 (t，C-1) ，71． 64 (d，C-2) ，213. 02 (s，C-3) ，50． 22
(s，C-4) ，140． 41 (s，C-5) ，120． 43 (d，C-6) ，23． 86 (t，C-7) ，42． 39 (d，C-8) ，48． 44 (s，C-9) ，33． 75
(d，C-10) ，212． 10 (s，C-11) ，48． 64 (t，C-12) ，50． 81 (s，C-13) ，48． 10 (s，C-14) ，45． 33 (t，C-15) ，
71. 27 (d，C-16) ，58． 21 (d，C-17) ，19． 82 (q，C-18) ，20． 03 (q，C-19) ，78． 26 (s，C-20) ，23． 93 (q，
C-21) ，202． 48 (s，C-22) ，120． 33 (d，C-23) ，151． 91 (d，C-24) ，79． 31 (s，C-25) ，26． 39 (q，C-26) ，
25． 97 (q，C-27) ，29． 36 (q，C-28) ，21． 25 (q，C-29) ，18． 88 (q，C-30) ，21． 90 (q，C-O2CCH3) ，170． 20
(s，C-OCOMe)。以上波谱数据与文献［10］报道一致，故鉴定为葫芦素 B。
组分峰 B:ESI-MS (m/z) :557 ［M + H］+;1H-NMR (500 MHz，CD3CL3) :δ 5． 93 (1H，d，J = 3． 0
Hz，H-1) ，5． 78 (1H，m，H-6) ，2． 36 (1H，m，H-7a) ，2． 02 (1H，m，H-7b) ，2． 06 (1H，m，H-8) ，3． 49
(1H，brs，H-10) ，3． 23 (1H，d，J = 10． 7 Hz，H-12a) ，2． 72 (1H，d，J = 8． 1 Hz，H-12b) ，1． 89 (1H，dd，J
= 4． 0 Hz，7． 3 Hz，H-15a) ，1． 47 (1H，dd，J = 4． 7 Hz，2． 9 Hz，H-15b) ，4． 37 (1H，m，H-16) ，2． 48 (1H，
968第 6 期 金再宿等:高速逆流色谱分离制备甜瓜蒂中葫芦素类化合物
d，J = 2． 5 Hz ，H-17) ，1． 01 (3H，s，H-18) ，1. 04 (3H，s，H-19) ，1． 43 (3H，s，H-21) ，6． 46 (1H，d，J =
9． 5 Hz，H-23) ，7． 05 (1H，d，J = 3． 1 Hz，H-24) ，1． 54 (3H，s，H-26) ，1． 57 (3H，s，H-27) ，1． 36 (3H，s，
H-28) ，1． 26 (3H，s，H-29) ，1． 38 (3H，s，H-30) ，2． 01 (3H，s，H-O2CCH3) ;
13 C-NMR (125 MHz，
CD3CL3) :δ 114． 66 (d，C-1) ，144． 52 (s，C-2) ，198． 55 (s，C-3) ，47． 39 (s，C-4) ，136． 82 (s，C-5) ，
120． 67 (d，C-6) ，23． 70 (t，C-7) ，41． 45 (d，C-8) ，48． 87 (s，C-9) ，34． 71 (d，C-10) ，212． 51 (s，C-
11) ，48． 72 (t，C-12) ，50． 51 (s，C-13) ，48． 23 (s，C-14) ，45． 54 (t，C-15) ，71． 38 (d，C-16) ，58． 12
(d，C-17) ，19． 80 (q，C-18) ，20． 06 (q，C-19) ，78． 23 (s，C-20) ，23． 91 (q，C-21) ，202． 45 (s，C-22) ，
120． 34 (d，C-23) ，151． 92 (d，C-24) ，79． 36 (s，C-25) ，26． 45 (q，C-26) ，25． 98 (q，C-27) ，27． 72 (q，
C-28) ，20． 11 (q，C-29) ，18． 56 (q，C-30) ，22. 03 (q，C-O2CCH3) ，170． 36 (s，C-OCOMe)。以上波谱
数据与文献［11］报道一致，故鉴定为葫芦素 E。
组分峰 C:ESI-MS (m/z) :515 ［M + H］+;1H-NMR (500 MHz，CD3CL3) :δ 5． 97 (1H，d，J = 2． 5
Hz，H-1) ，5． 76 (1H，brs，H-6) ，2． 39 (1H，m，H-7a) ，2． 01 (1H，m，H-7b) ，2． 04 (1H，m，H-8) ，3． 54
(1H，brs，H-10) ，3. 24 (1H，d，J = 6． 8 Hz，H-12a) ，2． 73 (1H，d，J = 7． 5 Hz，H-12b) ，1． 89 (1H，dd，J =
13． 5 Hz，9． 7 Hz，H-15a) ，1． 45 (1H，dd，J = 14． 7 Hz，3． 5 Hz，H-15b) ，4． 40 (1H，m，H-16) ，2． 56 (1H，
d，J = 3． 0 Hz，H-17) ，1． 03 (3H，s，H-18) ，1. 05 (3H，s，H-19) ，1． 43 (3H，s，H-21) ，6． 65 (1H，d，J =
10． 2 Hz，H-23) ，7． 13 (1H，d，J = 7． 5 Hz，H-24) ，1． 38 (3H，s，H-26) ，1． 37 (3H，s，H-27) ，1． 37 (3H，
s，H-28) ，1． 25 (3H，s，H-29) ，1． 39 (3H，s，H-30)。13C-NMR (125 MHz，CD3CL3) :δ 114． 85 (d，C-1) ，
144． 63 (s，C-2) ，198． 75 (s，C-3) ，47． 54 (s，C-4) ，136． 87 (s，C-5) ，120． 75 (d，C-6) ，23． 64 (t，C-
7) ，41． 65 (d，C-8) ，48． 73 (s，C-9) ，34． 63 (d，C-10) ，212． 72 (s，C-11) ，48． 86 (t，C-12) ，50． 75 (s，
C-13) ，48． 18 (s，C-14) ，45． 51 (t，C-15) ，71． 36 (d，C-16) ，57． 28 (d，C-17) ，20． 15 (q，C-18) ，21. 06
(q，C-19) ，79． 26 (s，C-20) ，23． 90 (q，C-21) ，202． 56 (s，C-22) ，120． 34 (d，C-23) ，155． 61 (d，C-
24) ，71． 22 (s，C-25) ，29． 35 (q，C-26) ，29． 06 (q，C-27) ，27． 85 (q，C-28) ，20． 28 (q，C-29) ，18． 47
(q，C-30)。以上波谱数据与文献［11］报道一致，故鉴定为葫芦素Ⅰ。
4 结 论
本实验利用高速逆流色谱法对甜瓜蒂粗提物进行了分离纯化。在 HSCCC 溶剂系统为正己烷-乙酸
乙酯-甲醇-水(1． 2∶ 0． 8∶ 0． 8∶ 1． 2，V /V)时，可从甜瓜蒂粗提取物中一步分离制备得 3 种纯度较高的葫
芦素类成分，分别为葫芦素 B，葫芦素 E 和葫芦素Ⅰ。高速逆流色谱法具有简便、快速、节省溶剂等特
点，对于有效分离甜瓜蒂中葫芦素类化合物具有较好的应用价值。
References
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Preparative Isolation and Purification of Cucurbitacins from Pedicellus
Melo by High-Speed Counter-corrent Chromatography
JIN Zai-Su1，TIAN Hong-Mei1，TANG Lan1，RAO Gui-Wei2，FANG Ying-Guo2，LI Cheng-Ping* 2
1(College of Pharmaceutical Sciences ，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014)
2(College of Biology and Environment Engineering，Zhejiang Shuren University ，Hangzhou 310015)
Abstract A preparative high-speed counter-current chromatography (HSCCC)was used to isolate and sepa-
rate cucurbitacins from Pedicellus Melo． A successful isolation and purification was achieved at the following
conditions:the two-phase solvent system composed of n-hexane-ethyl acetate-methanol-water at a volume ratio
of 1． 2∶ 0． 8∶ 0． 8∶ 1． 2 was selected and the lower phase of the system was used as the mobile phase at the
flow rate of 2． 0 mL /min，the isolation temperature and revolution speed were set at 25 ℃ and 800 r /min，re-
spectively． In 4． 0 h，the isolation produced a total of 33． 5 mg cucurbitacin B，21． 7 mg cucurbitacin E，and
14． 9 mg cucurbitacin I with purities of 99． 1%，98. 3% and 97． 5%，respectively，determined by high per-
formance liquid chromatography from 200 mg crude extract after cleaning-up by XAD-16 macroporous resin，
which was necessary for the excellent purification． The chemical structure identification was carried out by 1H-
NMR and 13C-NMR．
Keywords High-speed counter-counter chromatography;Pedicellus melo;Cucurbitacin B;Cucurbitacin E;
Cucurbitacin I
(Received 25 November 2010;accepted 5 January 2011
櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫
)
《铅酸蓄电池分析与检测技术》
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178第 6 期 金再宿等:高速逆流色谱分离制备甜瓜蒂中葫芦素类化合物