全 文 ：收稿日期:2013-03-25
基金项目:新疆医科大学大学生创新性实验计划项目(CX2011039)
作者简介:聂继红(1962-) ，女，硕士，主任药师，教授，主要从事中药复方新制剂研发研究;E-mail:xjnjh411@ 163. com。
超声提取对天山堇菜超微粉中总黄酮含量的影响
聂继红，张海英
(新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000)
摘要 目的:考察超声提取对天山堇菜超微粉中总黄酮含量的影响。方法:采用单因素试验结合 L9(3
4)正交
试验设计进行考察，以总黄酮含量、浸膏得率为指标，计算综合评分，筛选较佳提取工艺条件。结果:天山堇菜超微
粉较佳提取工艺条件为:料液比 1∶ 9(g /mL) ，70%乙醇提取 2 次，每次 1. 0 h。结论:该工艺合理、稳定、可行。
关键词 天山堇菜超微粉;总黄酮;超声提取
中图分类号:Ｒ283. 6 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)06-1059-03
天山堇菜为堇菜科植物天山堇菜 Viola tians-
hanica Maxim. 的干燥全草，为维吾尔医常用药，主
要用于各种发热、受寒、感冒、胸膜炎、肺炎、咽炎、疔
疮肿痈等症〔1〕。其主要有效成分为挥发油、黄酮
类、氨基酸等。天山堇菜中黄酮类成分的提取常采
用加热回流法，此方法溶剂消耗量大，加热时间长。
而超声提取法利用超声波的空化作用、机械效应和
热效应等加速细胞内有效物质的释放、扩散和溶解，
具快速、安全、提取效率高等优点，在此笔者应用超
声法提取天山堇菜总黄酮。超微粉碎是指利用机械
或流体力学的途径将物料粉碎至粒径小于 10 μm
的过程。超微细粉末具有一些特殊理化性质，如良
好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等。故
本研究将超微粉技术和超声波提取技术相结合，采
用单因素试验结合 L9(3
4)正交试验设计的方法，筛
选出天山堇菜总黄酮较佳提取工艺条件。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 YFM 超微粉碎振动磨(济南松岳机器
有限责任公司) ;DYQ-188 流水式粉碎机(浙江省瑞
安市环球药械厂) ;Cintra-20 紫外-可见分光光度计
(澳大利亚 GBC 公司) ;AG-135 电子天平(瑞士) ;
SK3300LH超声清洗器(上海科导超声仪器有限公
司)。
1. 2 材料 试验用天山堇菜购自新疆维吾尔自治
区维吾尔医医院，经新疆医科大学附属中医医院李
永和主任中药师鉴定为堇菜科植物天山堇菜 Viola
tianshanica Maxim. 的干燥全草。芦丁对照品(批
号:100080-200707)购自中国食品药品检定研究院;
亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 天山堇菜中总黄酮的含量测定
2. 1. 1 对照品溶液的制备:精密称取 10. 0 mg 芦
丁对照品，置 50 mL 量瓶中，加适量无水乙醇，超声
溶解，定容，即得浓度 0. 2 mg /mL的对照品溶液。
2. 1. 2 供试品溶液的制备:精密称取 10 g 天山堇
菜超微粉，加 70%乙醇溶液 100 mL，超声(100 W，
40 kHz)提取 60 min，用 70%乙醇补足减失的重量，
过滤，滤液用石油醚脱色，置 250 mL 量瓶中，定容，
即得。
2. 1. 3 测定波长的选择:精密量取供试品溶液、芦
丁对照品溶液各 2 mL，置 25 mL 量瓶中，加 1 mL
4%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置 6 min，加 1 mL 10%硝
酸铝溶液，摇匀，放置 6 min，加 10 mL 10%氢氧化钠
溶液，用 70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置 15 min，
在紫外-可见分光光度计下 400 ～ 700 nm处扫描，确
定最大吸收波长为 500 nm。
2. 1. 4 线性关系考察:精密量取 0. 2 mg /mL 芦丁
对照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL，置 25 mL 量瓶中，分
别加 70%乙醇 5、4、3、2、1、0 mL 使至 6 mL，加 1 mL
4%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置 6 min，加 1 mL 10%硝
酸铝溶液，摇匀，放置 6 min，加 10 mL 10%氢氧化钠
溶液，用 70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置 15 min，
此时芦丁终浓度为 0. 008、0. 016、0. 024、0. 032、
0. 040、0. 048 mg /mL，以相应的试剂为空白，照紫外-
可见分光光度法(中国药典附录ⅤA) ，在 500 nm处
测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行
线性回归，计算得芦丁的线性回归方程为:Y =
12. 8140X + 0. 0045，r = 0. 9998。结果表明，在 0. 008
～ 0. 048 mg /mL范围内，芦丁浓度与吸光度的线性
关系良好。
2. 1. 5 稳定性试验:精密量取供试品溶液 2 mL，置
25 mL量瓶中，按“2. 1. 4”项下操作，每隔 15 min 测
定吸光度，测定至 2 h，计算得供试品吸光度的 ＲSD
为 1. 05%(n = 9) ，表示供试品溶液在 2 h内稳定。
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.06.046
2. 1. 6 重复性试验:称取 10 g天山堇菜超微粉，共
5 份，按供试品溶液的制备方法平行操作，显色后，
测定吸光度，用标准曲线法测得总黄酮的平均含量
为 18. 48 ± 0. 21 mg /g，ＲSD 为 1. 14%(n = 5) ，表明
方法重复性良好。
2. 1. 7 精密度试验:精密吸取芦丁对照品溶液 2
mL，置 25 mL 量瓶中，按“2. 1. 4”项下方法操作，重
复测定 6 次，测得芦丁对照品溶液吸光度的 ＲSD 为
1. 09%(n = 6) ，结果表明仪器精密度良好。
2. 1. 8 加样回收率试验:分别精密称取 6 份已知
含量的天山堇菜超微粉(总黄酮含量 18. 48 mg /g)
各 5 g，按供试品溶液的制备方法进行提取，精密量
取供试品溶液 3 mL置 25 mL量瓶中，精密加入芦丁
对照品溶液(0. 2 mg /mL)3 mL，显色后，测定吸光
度。计算得平均回收率为 99. 46%，ＲSD 为 1. 83%
(n = 6) ，表明该方法准确可靠，可用于天山堇菜超
微粉中总黄酮的含量测定。
2. 2 单因素试验
2. 2. 1 乙醇浓度对综合评分的影响:固定提取次
数 2 次，料液比 1 ∶ 12，提取时间 1 h，分别以浓度
10%、30%、50%、70%、90%的乙醇为溶媒进行提
取，考察不同浓度的乙醇对提取效果的影响。结果
表明乙醇浓度为 10%和 30%时，综合评分均较低;
70%乙醇提取的综合评分最高。因此，确定提取工
艺所用乙醇浓度为 70%。见图 1。
图 1 乙醇浓度对天山堇菜提取综合评分的影响
2. 2. 2 料液比对综合评分的影响:固定提取次数
为 2 次，提取时间 1 h，分别加入料液比 1∶ 6、1∶ 9、1
∶ 12、1∶ 15、1∶ 18 的 70%乙醇进行提取，考察不同料
液比对提取效果的影响。结果表明料液比为 1 ∶ 12
和 1∶ 15 时，提取效率均较高，结合大生产实际，拟选
择料液比为 1 ∶ 9、1 ∶ 12、1 ∶ 15 进行正交试验。见图
2。
2. 2. 3 提取时间对综合评分的影响:固定提取次
数为 2 次，料液比 1∶ 12，乙醇浓度为 70%，分别提取
0. 5、1、1. 5、2、2. 5 h，考察不同提取时间对提取效果
的影响。结果表明提取时间为 0. 5、1 h 时，综合评
分均较高;而且，随提取时间的延长，无效物质的溶
出增加。因此，选择 0. 5、1、1. 5 h 进入正交试验。
见图 3。
图 2 料液比对天山堇菜提取综合评分的影响
图 3 提取时间对天山堇菜提取综合评分的影响
2. 2. 4 提取次数对综合评分的影响:固定提取时
间 1 h，料液比 1∶ 12，乙醇浓度为 70%，分别提取 1、
2、3、4 次，考察不同提取次数对提取效果的影响。
结果表明提取次数对综合评分影响较大，提取 3 次
综合评分最高，因此选择提取 1、2、3 次进行正交试
验。见图 4。
图 4 提取次数对天山堇菜提取综合评分的影响
2. 3 正交试验 在单因素试验的基础上，结合 L9
(34)正交试验法进行试验，正交试验的因素与水平
见表 1。以总黄酮含量、浸膏得率为指标综合评价
(权重系数为 60%、40%) ，精密称取天山堇菜超微
粉 10 g，按 L9(3
4)正交试验因素水平筛选较佳提取
工艺。实验结果见表 2，方差分析结果见表 3。
表 1 正交试验因素水平表
水平
A提取
次数 /次
B乙醇
用量 /(g /mL)
C提取
时间 /h
1 1 1∶ 9 0. 5
2 2 1∶ 12 1. 0
3 3 1∶ 15 1. 5
由表 2、3 可知，直观分析中，影响综合评分的因
素为:提取次数 ＞提取时间 ＞乙醇用量，较佳提取工
艺为 A2B1C2。方差分析中，提取次数对综合评分的
影响有统计学意义，而提取时间和乙醇用量对综合
·0601· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 6 期 2014 年 6 月
评分的影响无统计学意义。故确定天山堇菜超微粉
较佳提取工艺为 A2B1C2，即料液比为 1∶ 9，70%乙醇
提取 2 次，每次 1. 0 h。
表 2 L9(3
4)正交试验结果
实验 A提取次数 /次 B乙醇用量(g /mL) C提取时间 /h 总黄酮含量 /(mg /g) 浸膏得率 /% 综合评分
1 1 1 1 16. 64 9. 8 0. 749
2 1 2 2 17. 28 11. 2 0. 803
3 1 3 3 17. 92 11. 7 0. 834
4 2 1 2 19. 04 15. 3 0. 956
5 2 2 3 19. 04 15. 2 0. 954
6 2 3 1 19. 52 13. 7 0. 932
7 3 1 3 18. 40 14. 9 0. 927
8 3 2 1 18. 56 15. 7 0. 951
9 3 3 2 16. 16 16. 5 0. 897
K1 2. 386 2. 632 2. 632
K2 2. 842 2. 708 2. 656
K3 2. 775 2. 663 2. 715
Ｒ 0. 456 0. 076 0. 083
注:综合评分 =(60 /最大总黄酮含量)×总黄酮含量 +(40 /最大浸膏得率)×浸膏得率
表 3 方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 P值
A 0. 0404 2 0. 0202 12. 139 ＜ 0. 1
B 0. 0010 2 0. 0005 0. 292
C 0. 0012 2 0. 0006 0. 365
D 0. 0033 2 0. 0017
注:F0. 1(2，2)= 9. 0
2. 4 验证试验 称取天山堇菜超微粉 50 g，共 3
份，按料液比 1∶ 9 加入浓度 70%乙醇，提取 2 次，每
次 1. 0 h，显色后，测定吸光度，结果见表 4。验证试
验结果表明，检测指标高于或接近正交表中最优值，
说明优选的提取条件稳定、可行。
表 4 验证试验结果
编号 投料量 /g 总黄酮含量 /(mg /g) 浸膏得率 /%
1 50. 02 19. 39 13. 8
2 50. 14 19. 12 14. 2
3 50. 21 19. 07 14. 1
3 分析与讨论
黄酮类化合物是植物次生代谢产物之一，广泛
地存在于自然界植物中，表现出多种多样的药理活
性，被用于防治心脑血管和呼吸系统疾病，具有抗炎
抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤及增强免疫功
能等药理作用〔2〕。文献表明，天山堇菜总黄酮对羟
自由基和二苯代苦味肼基自由基均有一定的清除作
用，有抗氧化和抑菌活性〔3，4〕，为天山堇菜主要药效
成分。因此，研究选择总黄酮为提取工艺的评价指
标。
超微粉碎系采用振动磨粉碎药材，使细胞破壁
率提高，从而提高了化学成分的溶出速率及溶出量，
但粉末太细，其比表面积也增大，加热回流提取时要
持续搅拌，否则容易糊化，给操作带来困难，故研究
采用超声提取工艺和超微粉碎技术相结合的方法更
适合天山堇菜总黄酮的提取。
综上所述，研究将超微粉技术和超声波提取技
术相结合，采用单因素试验结合 L9(3
4)正交试验设
计的方法，筛选出天山堇菜超微粉较佳提取工艺为:
料液比 1 ∶ 9，70%乙醇超声提取 2 次，每次 1. 0 h。
通过验证试验表明该工艺提取效果好、合理、稳定、
可行。
参 考 文 献
［1］新疆维吾尔自治区卫生厅 . 维吾尔药材标准［S］． 上
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［2］曹纬国，刘志勤，邵云，等 . 黄酮类化合物药理作用的研
究进展［J］．西北植物学报，2003，23(12) :2241-2243.
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及抗氧化活性研究［J］． 食品科技，2010，35(10) :214-
217.
［4］沈小燕，解成喜，刘迪 . 天山堇菜提取物的抑菌活性研
究［J］．生物技术，2009，19(2) :71-73.
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