全 文 ：inhumanovariancarcinomacels.Weconceivethatsurvivin
blockadedmaybeausefulgenetherapymethodinthetreatment
ofovariancarcinoma.Itmaybeanewpowerfultoolforovarian
cancertherapy.
【References】
[ 1] 　EngelsK, KnauerSK, LoiblS, etal.NOsignalingconferscyto-
protectivitythroughthesurvivinnetworkinovariancarcinomas
[J].CancerRes, 2008, 68(13):5159-5166.
[ 2] 　LiangX, DaM, ZhuangZ, etal.EfectsofSurvivinoncellprolif-
erationandapoptosisinMG-63celsinvitro[ J] .CelBiolInt,
2009, 33 (1):119-124.
[ 3] 　SiegelinMD, ReussDE, HabelA, etal.Theflavonoidkaempferol
sensitizeshumangliomacellstoTRAIL-mediatedapoptosisby
proteasomaldegradationofsurvivin[ J] .MolCancerTher, 2008,
7(11):3566 - 3574.
[ 4] 　WatanabeA, TaniguchiF, IzawaM, etal.Theroleofsurvivinin
theresistanceofendometrioticstromalcelstodrug-inducedapop-
tosis[ J] .HumReprod, 2009, 24(12):3172 - 3179.
[ 5] 　SongH, XinXY, XiaoF, etal.SurvivingeneRNAinterference
inhibitsproliferation, inducesapoptosis, andenhancesradiosensi-
tivityinHeLacells[ J] .EurJObstetGynecolReprodBiol, 2008,
136(1):83-89.
[ 6] 　StauberRH, MannW, KnauerSK.Nuclearandcytoplasmicsur-
vivin:molecularmechanism, prognostic, andtherapeuticpotential
[J] .CancerRes, 2007, 67(13):5999-6002.
[ 7] 　AltieriDC.Survivin, cancernetworksandpathway-directeddrug
discovery[ J].NatRevCancer, 2008, 8(1):61-70.
[ 8] 　TammI, WangY, SausvileE, etal.IAPfamilyproteinsurvivin
inhibitscaspaseactivityandapoptosisinducedbyFas(CD95),
Bax, caspases, andanticancerdrugs[ J] .CancerRes, 1998, 58
(23):5315-5320.
(编校:张志明)
藤梨根提取物对人胃癌 MKN-45细胞增殖及凋亡的影响
附　舰 1 ,陈光伟 2 ,刘理礼1 ,闵　婕 1 ,王　宏 1 ,张贺龙1
EfectofRadixActinidiaeextractiveonanti-proliferationandpro-apoptosisinhuman
gastriccancerMKN-45 cellineinvitro
FUJian1 , CHENGuang-wei2 , LIULi-li1 , MINJie1 , WANGHong1 , ZHANGHe-long1
1DepartmentofOncology, TangduHospital, theFourthMilitaryMedicalUniversity, Xian710038, China;2DepartmentofOncology, the
AffilietedHospitalHospital, ShaanxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Xianyang712000, China.
【Abstract】　Objective:ToinvestigatetheroleofRadixActinidiaeextractive(RAE)onanti-proliferationandpro
-apoptosisforgastriccancerMKN-45 cellineinvitro.Methods:MKN-45 cellswereexposedtodiferentcon-
centrationsofRAEfor24h, 48h, 72hand96hrespectively.Theproliferationwasdetectedby4-methyl-teerazolium
(MTT), thedistributionofcellcycleandeffectonapoptosisofRAEwereanalyzedbyflowcytometry(FCM).DNA
gelelectrophoresiswasusedtodemonstrateDNAfragmentation.Results:RAEsignificantlyinhibitedtheproliferation
ofgastriccancercelsinvitroonadose-andtimedependentmanner;TheresultofFCMmadeitclearthatRAE
showedcelcyclespecificityandarrestedatG0 /G1.Aftertreating48 hoursonthegastriccancercelswithRAE, al
appearanceapoptosispeak, theapoptosisrateswere3.27%, 8.97%, 12.6%, comparedtocontrolgroup0.53%(P
<0.05);DNAagorosegelelectrophoresis(AGE)analysisrevealedthatRAEpretreatmentleadtoDNAfragmentation
onadose-dependentmanner.Conclusion:RAEsignificantlyinhibitedtheproliferationandinducedapoptosisofgas-
triccancerMKN-45 cellsinvitro, whicharestedcellcycleatG0 /G1.
【Keywords】RadixActinidiaeextractive(RAE);gastriccancerMKN-45 cellline;celcycle;apoptosis
ModernOncology2011, 19(01):0020-0022
【摘要】　目的:探讨太白山藤梨根提取物(RadixActinidiaeextractive, RAE)在体外对胃癌 MKN-45细胞增殖
与凋亡的影响。方法:用 0.01-100μg/ml浓度范围内的 RAE和胃癌 MKN-45细胞共培养 24、 48、72 、 96小
【收稿日期】　2010-06-13
【修回日期】　2010-07-20
【作者单位】　1第四军医大学唐都医院肿瘤科 ,陕西　西安　 710038
2陕西中医学院附属医院肿瘤科 ,陕西　咸阳　 712000
【作者简介】　附舰(1981-),女 ,陕西汉中人 ,医师 ,医学硕士 ,主要从事中西医结合肿瘤临床工作。 E-mail:fujian19810822@ 163.com
【通讯作者】　张贺龙(1964-),男 ,河北人 ,主任医师 ,教授 ,主要从事肿瘤侵袭和转移的机制研究。
·20· MODERNONCOLOGY, Jan.2011, VOI.19, NO.01
时 , 采用 MTT法检测 RAE对 MKN-45细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测其对 MKN-45细胞凋亡及细胞
周期分布的影响;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:RAE在体外能够显著抑制胃癌 MKN-45细胞
的增殖 , 且呈现浓度和时间依赖性;RAE对胃癌细胞的作用表现为周期特异性 , 使细胞阻滞于 G0 /G1期 , 进一
步诱导细胞凋亡。对照组凋亡率为 0.53%, 1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml浓度的 RAE干预胃癌细胞 48小时
后均出现凋亡峰 , 细胞凋亡率分别为 3.27%、8.97%、12.6%。 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 ,不同浓度
RAE处理的细胞样品中均可看到梯形凋亡条带 , 并呈现浓度依赖性。 结论:RAE在体外对人胃癌 MKN-45
细胞有显著的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡作用 ,其作用机制可能是使胃癌细胞周期阻滞于 G0 /G1期。
【关键词】藤梨根提取物;MKN-45胃癌细胞;细胞周期;细胞凋亡
【中图分类号】R73-36+1;R735.2　　【文献标识码】A　　DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2011.01.06
【文章编号】1672-4992-(2011)01-0020-03
　　胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。目前 , 胃癌
的治疗还没有金标准 , 从中草药中提取和寻找防治胃癌的有
效成分已成为治疗胃癌的希望和新途径。 藤梨根为猕猴桃
科软枣猕猴桃 Actinidiaarguta(Sieb1 etZucc1)Planch的根 ,
性寒 , 味苦 、涩 , 能清热解毒 、活血消肿 、祛风利湿 ,具有清热 、
利尿 、活血 、消肿 、治肝炎 、水肿 、跌打损伤 , 风湿性关节痛 , 淋
浊 、疱疖和抗癌作用 [ 1] 。本实验通过观察不同浓度的药物对
人胃癌细胞 MKN-45生长的影响及对凋亡生物学行为的影
响 , 以明确其抗癌作用的环节和机制 , 为临床研究有效抗癌
药物及开发利用藤梨根成为抗肿瘤新药提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　材料
藤梨根购于陕西恒庆医药有限公司 , 产地陕西周至县 ,
批号 060516。我们根据文献报道方法 [ 2] ,用乙醇和氯仿提取
藤梨根。将藤梨根阴干 , 粉碎成粗粉 ,取 4 kg用 95%的乙醇
(6倍体积)浸泡 24h,加热回流提取 6次 , 提取液 60℃减压
回收乙醇 , 浓缩得浸膏 , 浸膏按 1:1拌入硅藻土 , 干燥 , 真空
低温抽干 , 研碎成粉末 ,该粉末用氯仿(2倍)回流提取 6次 ,
合并氯仿提取液 , 减压回收溶剂的氯仿提取物 45g(主要是三
萜类化合物)。用生理盐水 4000ml配成储液(即生药浓度为
1g/ml), 无菌过滤置于 -20℃冰箱保存。 将 RAE用生理盐
水分别配制成不同的浓度。人胃癌细胞株(低分化腺癌)
MKN-45,由第四军医大学实验动物中心提供。 MTT(四甲
基噻唑蓝):Sigma公司 (美国)产品。 小牛血清 (FBS,
200m1/瓶):天津 TBD血液研究所产品 , 购自华美生物工程
公司;DMEM培养液:Amresco公司;Trypsin(0.25%胰蛋白
酶):Amresco公司;DMSO(二甲基亚砜):北京亚太精细化
工公司;电泳用琼脂糖:上海东海制药厂。
1.2　MTT法检测 RAE对 MKN-45细胞增殖的影响
将对数生长期的 MKN细胞制备成 105 /ml的单细胞悬
液 , 接种于 50ml培养瓶中 , 根据预实验结果 , 实验组分别加
入 RNE, 使终浓度为 100μg/ml, 10μg/ml, 1μg/ml, 0.1 μg/
ml, 0.01μg/ml。分别作用 24、48、72 、96小时后 , 加入 20μl
MTT液(5mg/ml), 对照组则加入等体积溶剂的培养液 , 培养
4小时后 , 每孔加入 150μlDMSO液 , 震荡混匀 , 使沉淀充分
溶解 , 10min后于酶标仪上测定 570nm处光吸收值(OD值或
A值)。重复 3次。生长抑制率 =[ 1-(实验组平均 OD值 /
对照组平均 OD值)] ×100%。
1.3　流式细胞术分析 RAE对胃癌细胞周期的影响
将对数生长期的细胞经 0.25%胰酶消化 , 制备稀释成
105 /ml的单细胞悬液。将此浓度细胞分别接种于 3个 50ml
培养瓶中 , 预培养 24h后 , 弃培养液 , 分组加入等量药物(加
药后浓度分别为 1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml), 对照组加等
量培养液 , 培养 48h后 ,收集细胞培养瓶中的细胞 , 经 95%乙
醇固定 12h后 , 进行 PI染色 ,用流式细胞仪检测细胞周期的
变化。
1.4　DNA琼脂糖凝胶电泳检测 RAE对胃癌细胞凋亡的作
用
以 1×105个 /ml的细胞密度 , 将对数生长期的胃癌细胞
接种于 50ml的培养瓶中 , 24h后加药使其终浓度分别为
1μg/ml、 10μg/ml、 100μg/ml, 对照组加等量的培养液;取
10μl样品与 2μl加样缓冲液混匀 , 质量分数为 1.8%的琼脂
糖凝胶电泳 3-4h, 电泳缓冲液 0.5×TBE, 电压 4V/cm, 紫
外光凝胶成像系统扫描记录。
1.5　统计学分析
采用统计软件包SPSS11.5进行统计学分析。计量资料
用(均数 ±标准差)表示 , 多个样本均数先进行单因素方差分
析 , 有统计学意义再进行组间比较 , 组间以 t检验比较差异
的显著性。以 P﹤ 0.05为有统计学意义。
2　结果
2.1　RAE对胃癌细胞 MKN-45的增殖抑制作用
MTT法检测细胞增殖的结果显示(表 1), 低剂量组药
物(0.01μg/ml浓度的 RAE)对 MKN-45细胞的增殖无明显
影响 , 随着药物浓度的增加和时间的延长 , 增殖抑制作用逐
渐明显。故下一步实验中选择较高剂量药物(1μg/ml、10μg/
ml、100μg/ml), 检测药物对细胞周期的影响。
2.2　RAE对 MKN-45胃癌细胞周期的影响
加药浓度分别为 1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的实验组
作用 48小时与对照组检测细胞周期进行比较。结果发现 ,
药物作用后细胞的生长周期停滞于 G0 /G1期 ,伴随着 S期细
胞数的相应减少 , 提示药物抑制细胞增殖的主要途径是阻止
G1期细胞进入 S期(表 2)。
2.3　RAE对胃癌细胞 MKN-45诱导凋亡的作用
2.3.1　流式细胞仪检测结果　10μg/ml, 100μg/mlRAE分别
处理 MKN-45细胞 48小时后 ,均出现凋亡峰 ,细胞凋亡率
分别为 8.97%、12.6%, 两者相比无显著差别(P﹥ 0.05),
与对照组(凋亡率为 0.53%)相比均有显著差别(P<0.05)。
由于细胞周期的循环被阻滞于 G0 /G1期 ,胃癌细胞的增殖被
抑制 , 进一步启动细胞凋亡的发生 , 使肿瘤细胞从停滞生长
走向凋亡。细胞凋亡是由正常的细胞周期改变引起的 , 细胞
凋亡与细胞周期阻滞有关 , 细胞阻滞于哪一期 , 凋亡就发生
在哪一期 [ 3] 。
·21·现代肿瘤医学　2011年 01月　第 19卷第 01期
表 1　RAE不同时间 、不同浓度对 MKN-45细胞的存活率的影响(n=18)
Tab.1　SurvivalrateofMKN-45celtreatedwithRAE
RAE
(μg/ml)
24h
OD
( x±s)
survivalrate
(%)
48h
OD
( x±s)
survivalrate
(%)
72h
OD
( x±s)
survivalrate
(%)
96h
OD
( x±s)
survivalrate
(%)
0(Control) 1.794±0.023 - 1.778±0.061 - 1.742±0.051 - 1.639±0.028 -
　0.01 1.529±0.029 85.23＊ 1.228±0.044 69.07＊ 0.998±0.040 57.29＊ 0.910±0.029 55.52＊
　0.1 1.520±0.025 84.73＊ 1.043±0.072 58.49＊ 0.926±0.042 53.16＊ 0.733±0.023 44.72＊
　1 1.190±0.023 66.33＊ 1.000±0.036 56.24＊ 0.700±0.037 40.18＊ 0.568±0.030 34.66＊
　10 0.986±0.021 54.85＊ 0.880±0.082 49.49＊ 0.622±0.038 35.71＊ 0.321±0.018 19.59＊
　100 0.978±0.024 54.52＊ 0.778±0.042 43.75＊ 0.519±0.023 29.79＊ 0.305±0.022 18.61＊
　　　＊P﹤ 0.05 , vscontrol
表 2　RAE对 MKN-45细胞周期和凋亡的影响(%)
Tab.2　EfectofcelcycleandapoptosisonMKN-45celbyRAE
REA
(μg/ml) G0 /G1 S G2 /M
Apoptosis
rate
0(Control) 31.34 58.50 10.15 0.53
1 37.04 53.63 9.33 3.27
10 42.77 51.46 5.77 8.97
100 53.95 35.40 10.65 12.60
2.3.2　DNA凝胶电泳结果　RAE不同浓度组显示的条带
如图 1所示 , 其中含有 RAE的样品中 (1μg/ml、 10μg/ml、
100μg/ml)均可看到典型的梯形凋亡条带 , 并且药物浓度越
高 , 这一凋亡现象越明显 , 以 100μg/ml的最明显 , 而阴性对
照组没有梯形条带。
图 1　不同浓度的 RAE作用细胞 48h后 , DNA片断化
　　M:DNAmarker;1:对照组;2:RAE 1μg/ml组;3:RAE10μg/ml
组;4:RAE100μg/ml组
Fig.1　TreatedbyRAE48h, DNAfragmentation
　　M:DNAmarker;1:Control;2:RAE1μg/ml;3:RAE10μg/ml;4:
RAE100μg/ml
3　讨论
中医药防治肿瘤的基本原则是扶正祛邪 , 治法不离补
益 、清热 、活血 、化痰等 , 而藤梨根具有清热 、活血 、利水 、消肿
作用 [ 4] , 符合中医防治肿瘤的原则。我国民间常用藤梨根
治疗肿瘤 , 尤其是消化道肿瘤。朱秀山等 [ 5]用藤梨根 、壁虎
等组成昭黄散治疗晚期胃癌 72例 , 近期有效率 33.13% ,与
化疗组相近 , 且不良反应较化疗组轻。
藤梨根抗肿瘤作用的成分主要为三萜类化合物 , 分别为
乙酸乙酯提取物熊果酸 、β 谷甾醇;正丁醇提取物等 [ 6] 。其
作用机制方面 , 姚庆华等提出藤梨根通过上调细胞间隙连接
通讯功能来抑制某些肿瘤细胞的生长 [ 7] 。 也有人认为其机
制与抑制肿瘤转移 、促进淋巴细胞转化 、增强细胞免疫等有
一定的作用 [ 8] 。
本实验结果表明 , RAE对胃癌细胞有抗增殖及诱导凋亡
作用 , 并在一定范围内呈剂量效应和时效关系。其抗增殖作
用方式主要是通过诱导凋亡途径 ,其机制可能是使胃癌细胞
DNA合成受阻 ,细胞周期阻滞于 G0 /G1期 ,进而诱导胃癌细
胞凋亡 , 使胃癌细胞从停滞生长走向凋亡。但藤梨根抗癌的
物质基础及其体内抗肿瘤作用机制 、药代动力学等方面尚未
明确 , 有待进一步深入研究。
【参考文献】
[ 1] 　金永日,桂明玉.软枣猕猴桃根化学成分的研究 [ J].中国药学
杂志 , 1998;33(7)∶402-404.
[ 2] 　李昊 ,杨慧萍.藤梨根对胃癌细胞抑制作用的实验研究 [ J] .河
北中医, 2004, 26(4):314-315.
[ 3] 　ZhaoY, WuK, XiaoW, etal.TheefectsofvitaminEsuccinct
ontheexpressionofc-junkgeneandproteininhumangastric
cancerSGC-7901cels[J].WorldJGastroenterol, 2002, 8(5):
782-786.
[ 4] 　江苏新医学院.中药大辞典 [ M] .上海:上海科学技术出版社 ,
1996:2211.
[ 5] 　朱秀山 ,许继平 黄德辉 , 等.壁虎藤梨根治疗胃癌临床及实验
研究 [ J] .中国民间疗法 , 1999, 3:43.
[ 6] 　覃益民, 黄初升 ,陈希慧, 等.中越猕猴桃根三萜成分的研究
[ J] .中草药 , 1999, 30(5):323-326.
[ 7] 　姚庆华,郭勇 ,杨维泓 ,等 .复方藤梨根制剂上调 PG细胞间隙
连接通讯功能的研究 [ J] .肿瘤研究与临床 , 2004, 16(5):303
-305.
[ 8] 　阙克清.藤梨根抗肿瘤作用及其对免疫功能的影响 [ J].湖南
医学 , l985, (5):21-23.
(编校:张志明)
·22· MODERNONCOLOGY, Jan.2011, VOI.19, NO.01