全 文 ：参考文献
〔1〕 Battaini F，Pascale A，Paoletti R，et al． The role of anchoring protein
RACK1 in PKC actibation in the aging rat brain［J］． Trends Neu-
rosci，1997，20: 410 － 415．
〔2〕 苏青，罗敏，陈源． 甲状腺激素缺乏对发育期鼠脑蛋白激酶 C
活性的影响［J］．中华内分泌代谢杂志，2000，16: 106 － 108．
〔3〕 Heurteaux C，Messier C，Destrade C，et al． Memory processing and
apamin induce immediate early gene expression in mouse brain
［J］． Brain Res Mol Brain Res，1993，18: 17 － 22．
〔4〕 Paxions G，Watson C． The rat brain in sterotaxic coordinates［M］．
Sydney Academic Press，1982．
〔5〕 蔡东升．甲状腺激素与脑信号传导系统［J］．国外医学: 内分泌
学分册，2001，21( 2) : 73 － 76．
〔6〕 孙黎光，朱延松，侯伟健，等．铅对大鼠海马神经元胞质 PKC 活
性的影响［J］．中国医科大学学报，2002，31( 5) : 326 － 328．
〔7〕 Leung L，Saggerson D，Clak JB． Signal transduction processes in the
developing brain: perturbations of G protein alpha-subunit
abundances by perinatal hyroidism［J］． Dev Neurosei，1996，18:
153 － 161．
〔8〕 Igarashi M，strittmatte SM，Vatranian T，et al． Mediation by G pro-
tein of signals that cause collapse of growth cones［J］． Science，
1993，259: 77 － 79．
〔9〕 Rose SP． How chicks make memories: the cellular cascade from
c-fos to dendritic remodeling［J］． Trends Neurosci，1991，14: 390 －
397．
〔10〕 Grant SG，O’Dell TJ，Karl KA，et al． Impaired long-term potentia-
tion，spatial learning，and hippocampal development in fyn mutant
mice［J］． Science，1992，258: 1903 － 1910．
〔11〕 Wisden W，Errington ML，Williams S，et al． Differential expression
of immediate early genes in the hippocampus and spinal cord［J］．
Neuron，1990，4: 603 － 614．
〔12〕 Nikolaev E，Tischmeyer W，Krug M，et al． C-fos protooncogene ex-
pression in rat hippocampus and entorhinal cortex following titanic
stimulation of the perforant path［J］． Brain Res，1991，560: 346 －
349．
〔13〕 Dragunow M，Abraham WC，Goulding M，et al． Long-term potentia-
tion and the induction of c-fos mRNA and proteins in the dentate
gyrus of unanesthetized rats［J］． Neurosci Lett，1989，101: 274 －
280．
〔14〕 田东萍，苏敏，吴贤英，等． 硒、碘对大鼠海马神经细胞原癌基
因 c-fos、c-jun表达的影响［J］．中华病理学杂志，2002，31 ( 3 ) :
245 － 249．
收稿日期: 2011-03-26 ( 刘铁编辑 解学魁校对)
* 基金项目: 山东省中青年科学家科研奖励基金( 2007BS03061)
作者单位: 山东大学齐鲁医院胸外科，山东 济南 250012
作者简介: 孙雪飞( 1974 － ) ，男，黑龙江哈尔滨人，副教授，博士，主要从事食管癌基础研究。
通讯作者: 吴铭生，E-mail: mingshengwu@ yahoo． com． cn。
【实验研究】
藤梨根提取物对食管癌 EC109 细胞抑制作用*
孙雪飞，裴艳涛，杨国涛，吴铭生 ，尹秋伟
摘 要:目的 观察藤梨根乙酸乙酯提取物对食管癌 EC109 细胞生长、凋亡影响，并探讨其作用机制。方法 体
外培养食管癌 EC109 细胞，分别给予不同浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物进行干预，四甲基偶氮噻唑蓝( MTT) 法检测
细胞增殖抑制率，流式细胞术检测用药后 EC109 细胞凋亡率变化，免疫组化法检测用药后 EC109 细胞 B细胞淋巴瘤 /
白血病 － 2 基因( Bcl － 2) 、Bcl － 2 相关 X蛋白( Bax) 蛋白表达变化，激光共聚焦显微技术测定用药后 EC109 细胞胞内
［Ca2 +］i变化。结果 细胞培养 24、48、72 h后，对照组细胞凋亡率分别为( 1. 67 ± 0. 76) %、( 2. 32 ± 0. 45) %、( 2. 98 ±
0. 89) %，Bcl － 2 蛋白表达率分别为( 50. 12 ± 3. 41) %、( 49. 78 ± 5. 65) %、( 51. 25 ± 6. 34) %，Bax 蛋白表达率分别为
( 17. 98 ± 2. 85) %、( 18. 27 ± 3. 12) %、( 17. 76 ± 3. 64) %，而各干预组细胞凋亡率为 7. 05% ～ 51. 11%，均明显增加( t
= 5. 419 ～ 17. 826，P ＜ 0. 05) ，存在时 －效和量 －效趋势，同时其细胞 Bcl － 2 蛋白表达降低，为 43. 32% ～ 10. 46%，Bax
蛋白表达上调，为 24. 54% ～ 63. 47%，均存在时 －效和量 －效趋势，当作用时间≥48 h或浓度≥100 μg /mL时，干预组
上述变化与对照组比较，差异有统计学意义( Bcl － 2: t = 3. 58 ～ 10. 14; Bax: t = 5. 047 ～ 11. 065，P ＜ 0. 05) ;用药后细胞
内［Ca2 +］i明显升高，12 h达高峰，此后缓慢减低，至 48 h仍明显高于对照组。结论 藤梨根乙酸乙酯提取物可以明
显抑制食管癌 EC109 细胞增殖，并诱导细胞发生凋亡，可能与降低其 Bcl － 2 蛋白表达，上调 Bax 蛋白表达，升高细胞
内［Ca2 +］i有关。
关键词:藤梨根提取物;食管肿瘤;细胞凋亡; Bax基因; Bcl － 2 基因;细胞内钙离子浓度
中图分类号: R 655. 1 文献标志码: A 文章编号: 1001-0580( 2011) 12-1601-03
Inhibitory effect of Radix Actinidiae extractives on esophagus cancer cell line EC109 SUN Xue-fei，PEI Yan-tao，
YANG Guo-tao，et al． Department of Thoracic Surgery，Qilu Hospital of Shandong University( Jinan 250012，China)
Abstract: Objective To study the effects of Radix Actinidiae extractives on the proliferation and apoptosis of esopha-
gus cancer cell line EC109 and to explore its mechanism．Methods EC109 cells were cultured in vitro． The cells were trea-
ted with different doses of Radix Actinidiae extractives． 3-［4，5-dimethylthylthiazol-2-yl］-2，5 diphenyltetrazolium bromide
( MTT) assay was used to detect the inhibition of the cells． Cell apoptosis was measured by flow cytometry( FCM ) ． Immu-
nohistochemistry( S-P) was used to detect the expression of Bcl-2，Bax protein of EC109 cell after the treatments． Intercellular
calcium level was measured with laser scanning confocal microscopy． Results Radix Actinidiae extractives had obviously
inhibitive effect on EC109 cell in a dose-and time-dependent manner in vitro． Inhibition rate( IR) ( from 5. 2% to 56. 77% )
and apoptosis index( AI) ( from 7. 05% to 51. 11% ) increased in a dose-and time-dependent manner with significant differ-
ences compared to those of the control group( P ＜ 0. 05) ． The expression of Bcl-2 protein of EC109 cell was decreased in a
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dose-and time-dependent manner． The expression of Bax protein of EC109 cell increased progressively also in a dose- and
time-dependent manner． There was no change in the control group． Significant differences were observed in the groups of the
different dose( ≥100 μg /mL) and different treatment time( ≥48 hr) compared to the control group( P ＜ 0. 05 for all) ． Inter-
cellular calcium level of the control group was constant，but obviously increased in the treatment groups in a dose-dependent
manner with a peak at 12 hr( P ＜ 0. 05) ． Conclusion Radix Actinidiae extractives has evident inhibition effect on esopha-
gus cancer cell line EC109 in a dose-and time-dependent manner in vitro． It could also induce the apoptosis of EC109 cell in
a dose-and time-dependent manner in vitro． Radix Actinidiae extractives could down-regulate the expression of Bcl-2 and
up-regulate the expression of Bax protein level． The increased intercellular calcium promotes apoptosis． The mechanism of
the induced apoptosis may be mediated by the regulation of the expression of apoptosis regulation gene and the level of
intercellular calcium．
Key words: Radix Actinidiae extractives; esophagus cancer; apoptosis; gene; Bcl-2; Bax; intercellular calciumion level
藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根，味甘、咸
寒、微涩，具有清热解毒、消肿疥、祛风湿的功效。既往常用于
抗肿瘤治疗，尤其对消化道肿瘤疗效较佳〔1〕。有研究显
示〔2 － 4〕，猕猴桃属其他种类猕猴桃根提取物在体外对肿瘤细
胞生长也有抑制作用，因此其药理研究和临床验证受到广泛
关注。本研究制备藤梨根乙酸乙酯提取物，观察其对体外培
养的食管癌 EC109 细胞生长、凋亡的影响，并进一步探讨其
作用机制，为其进一步临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 细胞系 食管癌 EC109 细胞系由山东省医学科学院基
础所惠赠。
1. 2 主要试剂与仪器 免疫组化染色试剂盒、鼠抗人 B细胞
淋巴瘤 /白血病-2 基因( B cell lymphoma / leukemia-2 gene，Bcl-
2) 、Bcl-2 相关 X蛋白( Bcl-2 associated X protein，Bax) 单克隆
抗体( 北京中山生物技术有限公司) ; RPMI 1640 培养基、胎牛
血清( 美国 Gibco公司) ;胰蛋白酶、四甲基偶氮噻唑蓝( 3-〔4，
5-dimethylthylthiazol-2-yl〕-2， 5 diphenyltetrazolium broide，
MTT) 、二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide，DMSO) ( 美国 Sigma 公
司) 。Fluo-3 /AM荧光探针( 美国 Molecular probe 公司) ;捷达
801 系列形态学分析系统( 江苏捷达科技发展有限公司) 。
1. 3 藤梨根乙酸乙酯提取物制备 将藤梨根 ( 济南建联药
店) 500 g粉碎成 20 目的粗粉，加 8 倍水煮 2 次，每次 1 h;过
滤浓缩，然后加入乙酸乙酯溶媒萃取 3 次( 每次 300 mL) ，回
收溶媒，得浓缩物约 25 g( 含三萜类物质) ;用蒸馏水热溶、过
滤，获得滤液供试验用( 无菌) 。
1. 4 细胞培养与分组 食管癌 EC109 细胞培养在含 10%小
牛血清、青霉素和链霉素各 100 U /mL 的 RPMI1640 培养液
中，37 ℃、5% CO2 饱和湿度条件下培养，0. 25%胰蛋白酶消
化传代。以 DMSO作为溶剂，将藤梨根乙酸乙酯提取物在临
用前用 RPMI-1640 培养液分别配制成不同的浓度，治疗组中
藤梨根乙酸乙酯提取物的工作终浓度分别为 50、100、200 μg /
mL，并设对照组( 0. 04%DMSO +细胞) 。
1. 5 方法
1. 5. 1 细胞增殖抑制率的 MTT比色法检测 细胞接种于 96
孔培养板中，每组 6 个复孔，分别处理 24、48、72 h，其他操作
参照文献〔5〕，并计算生长抑制率( inhibition ratio，IR) 。
1. 5. 2 细胞凋亡的流式细胞术检测 复孔设置及处理同
1. 5. 1，按文献〔6〕进行各组细胞凋亡率检测。
1. 5. 3 细胞 Bcl-2、Bax蛋白表达的免疫组化法检测 将经多
聚赖氨酸处理的小载玻片置于培养板中，每组设 3 个复孔。
处理同 1. 5. 1，取载玻片按文献〔7〕进行 Bcl-2、Bax 蛋白表达
检测，采用捷达 801 系列形态学分析系统，每例选取 4 个视野
进行阳性率测定。
1. 5. 4 细胞内［Ca2 +］i 变化的激光共聚焦显微技术测定
在用药后 12、24、48 h时相点终止培养。按文献〔8〕检测细胞
内［Ca2 +］i，计算机记录 30 个细胞的扫描结果并计算出整张
照片的平均荧光强度。
1. 6 统计分析 应用 SPSS 10. 0 软件进行 t 检验，以 P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各组细胞的 A 值及 IR
( 表 1) 藤梨根乙酸乙酯提取物对食管癌 EC109 细胞的生长
有明显的抑制作用，随着提取物浓度增加或作用时间延长，各
治疗组 A值逐渐降低或逐渐增高( t =3. 428 ～16. 334，P ＜0. 05，
抑制率均逐渐增高，呈现出明显的量 －效和时 －效趋势。
表 1 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后各组细胞的 A值(珔x ± s)和 IR(%) ( n =6)
组 别
浓度
( μg /mL)
24 h
A IR
48 h
A IR
72 h
A IR
对照组 0 0. 369 ± 0. 025 － 0. 624 ± 0. 087 － 0. 921 ± 0. 026 －
干预组 50 0. 349 ± 0. 063 5. 20 0. 538 ± 0. 060 13. 78 0. 751 ± 0. 055a 18. 46
100 0. 297 ± 0. 045a 19. 51 0. 417 ± 0. 034a 33. 17 0. 531 ± 0. 033a 42. 35
200 0. 225 ± 0. 065a 39. 02 0. 399 ± 0. 054a 45. 56 0. 398 ± 0. 074a 56. 77
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05。
2. 2 藤梨根乙酸乙酯提取物对 EC109 细胞凋亡率影响( 表
2) 对照组 EC109 细胞自发性凋亡率较低，而藤梨根乙酸乙
酯提取物可明显诱导 EC109 细胞凋亡，并呈现出量 －效和时
－效趋势。各干预组与对照组凋亡率比较，差异均有统计学
意义( t = 5. 419 ～ 17. 826，P ＜ 0. 05) 。
2. 3 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后 EC109 细胞 Bcl-2、Bax
蛋白表达( 表 3) Bcl-2、Bax 蛋白阳性染色反应为胞浆内见
黄色或棕黄色颗粒，亦可定位于细胞膜、核膜。图像分析显
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表 2 藤梨根乙酸乙酯提取物对 EC109 细胞
凋亡率影响(珔x ± s，%，n =6)
组 别
浓度
( μg /mL )
24 h 48 h 72 h
对照组 0 1. 67 ± 0. 76 2. 32 ± 0. 45 2. 98 ± 0. 89
干预组 50 7. 05 ± 2. 31a 14. 23 ± 4. 65a 24. 78 ± 6. 24a
100 11. 54 ± 4. 11a 26. 82 ± 5. 47a 40. 96 ± 5. 86a
200 20. 34 ± 5. 14a 39. 58 ± 6. 62a 51. 11 ± 6. 55a
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05。
示，对照组 EC109 细胞 Bcl-2 蛋白表达量较高，而 Bax 蛋白表
达较低。但各干预组随着药物浓度增加和作用时间延长，
Bcl-2 表达强度逐渐下降，而 Bax 蛋白表达强度逐渐上升，呈
现出量 －效和时 － 效趋势 ( Bcl-2: t = 3. 58 ～ 10. 14; Bax: t =
5. 047 ～ 11. 065，P ＜ 0. 05) 。
2. 4 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后 EC109 细胞胞内［Ca2 +］
i变化( 表 4) 对照组 EC109 细胞内［Ca2 +］i 随培养时间延
长无明显变化，而各干预组细胞内［Ca2 +］i 明显升高，随药物
浓度增加，升高越明显，12 h达高峰，此后逐步减低，但至48 h
仍明显高于对照组，各干预组细胞内 Ca2 +染色荧光强度与对
照组比较，差异均有统计学意义( t =19. 45 ～48. 80，P ＜0. 05) 。
表 3 藤梨根乙酸乙酯提取物对细胞 Bcl-2、Bax蛋白表达影响(珔x ± s，%，n =3)
组 别
浓度
( μg /mL )
Bcl-2 蛋白表达
24 h 48 h 72 h
Bax蛋白表达
24 h 48 h 72 h
对照组 0 50. 12 ± 3. 41 49. 78 ± 5. 65 51. 25 ± 6. 34 17. 98 ± 2. 85 18. 27 ± 3. 12 17. 76 ± 3. 64
干预组 50 43. 32 ± 3. 16 34. 55 ± 4. 72a 27. 19 ± 5. 38a 24. 54 ± 3. 09 31. 77 ± 3. 04a 39. 32 ± 3. 81a
100 33. 84 ± 4. 97a 26. 68 ± 5. 24a 19. 67 ± 4. 33a 33. 06 ± 4. 32a 40. 82 ± 4. 84a 48. 69 ± 5. 37a
200 24. 65 ± 5. 02a 18. 75 ± 3. 96a 10. 46 ± 2. 89a 42. 17 ± 3. 99a 51. 51 ± 5. 04a 63. 47 ± 6. 16a
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05。
表 4 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后细胞内
［Ca2 +］i变化情况(珔x ± s，n =30)
组 别
浓度
( μg /mL)
细胞内［Ca2 +］i
12 h 24 h 48 h
对照组 － 223. 74 ± 32. 04 237. 18 ± 34. 71 230. 55 ± 33. 85
干预组 50 812. 42 ± 98. 33a 598. 36 ± 89. 33a 534. 51 ± 78. 62a
100 1 024. 91 ± 103. 77a 786. 35 ± 98. 64a 729. 47 ± 83. 72a
200 1 465. 34 ± 135. 62a 943. 72 ± 120. 45a 894. 15 ± 108. 67a
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05。
3 讨 论
本研究结果显示，藤梨根乙酸乙酯提取物在体外可以明
显诱导 EC109 细胞凋亡、抑制细胞增殖，表明诱导食管癌细
胞凋亡是其抗食管癌作用的重要机制。肿瘤的治疗效果、耐
药的产生与细胞凋亡密切相关，细胞凋亡受多种基因精细调
控，并通过凋亡相关的信号传导系统介导来实现。Bcl-2 和
Bax基因是 Bcl-2 家族的 2 个重要的凋亡相关基因，Bcl-2 主
要通过自身二聚或与 Bax等蛋白形成异二聚体来发挥其调控
细胞凋亡的功能，而 Bcl-2 与 Bax之间的比值决定着接受凋亡
刺激后细胞是否凋亡〔9〕。本研究结果表明，藤梨根乙酸乙酯
提取物可以通过在蛋白水平上调食管癌 EC109 细胞 Bax 基
因表达，下调 Bcl-2 基因表达，使 Bcl-2 /Bax 比值下降来诱导
EC109 细胞凋亡，并且其对凋亡相关基因表达调控的强度与
本研究中药物作用后细胞凋亡变化的检测结果趋势一致。因
此，对凋亡相关基因表达的调控是藤梨根乙酸乙酯提取物诱
导食管癌细胞凋亡的分子机制之一。
钙离子作为一种重要的细胞内信号传导的第二信使，在
细胞内可从多条途径诱导细胞凋亡〔10〕。本研究结果显示，各
干预组在用药后 12 h，细胞内［Ca2 +］i即明显升高，具有剂量
依赖性。此后随时间延长细胞内［Ca2 +］i 降低，但作用 48 h
时各实验组细胞内 Ca2 +荧光强度仍明显高于对照组。与文
献〔11〕报道的 Ca2 + 升高与细胞凋亡早期凋亡的启动有关一
致。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以通过升高食管癌细胞内
［Ca2 +］i诱导食管癌细胞凋亡，亦是其诱导食管癌细胞凋亡
的分子机制之一。
参考文献
〔1〕 陈德轩，潘立群． 抗肿瘤植物药藤梨根［J］． 中药材，2004，27
( 2) : 86 － 87．
〔2〕 钟振国，张凤芬，甄汉深，等． 美味猕猴桃根提取物抗肿瘤作用
的实验研究［J］．中医药学刊，2004，22( 9) : 1705 － 1707．
〔3〕 钟振国，张雯艳，张凤芬，等． 中越猕猴桃根提取物的体外抗肿
瘤活性研究［J］．中药材，2005，28( 3) : 215 － 218．
〔4〕 张凤芬，钟振国，张雯艳，等． 山梨猕猴桃根提取物的体外抗肿
瘤活性研究［J］．中医药学刊，2005，23( 2) : 261 － 263．
〔5〕 肖辉，张月明，朱功兵，等．野蔷薇果提取物对不同肿瘤细胞抑
制作用［J］．中国公共卫生，2010，26( 7) : 858 － 859．
〔6〕 杨小丽，刘晓春，黄林，等．曲古抑菌素 A 对鼻咽癌 CNE3 细胞
增殖抑制作用［J］．中国公共卫生，2010，26( 8) : 1029 － 1030．
〔7〕 李明，诸葛洪祥，朱传武，等． 慢性乙型肝炎患者转录因子
Foxp3 表达及意义［J］． 中国公共卫生，2009，25 ( 11 ) : 1396 －
1397．
〔8〕 张磊，门可，张景霞，等．人正常早孕滋养细胞体外培养株的系
统鉴定［J］．中国公共卫生，2006，22( 7) : 818 － 820．
〔9〕 Coultas L，Strasser A． The role of the Bcl-2 protein family in cancer
［J］． Semin Cancer Biol，2003，13: 115 － 123．
〔10〕张艳芬，范雪晖．细胞内外 Ca2 +对细胞凋亡的影响［J］．新乡医
学院学报，2003，20( 3) : 193 － 195．
〔11〕 Popescu BO，Cedazo-Minguez A，Popescu LM，et al． Caspase cleav-
age of exon 9 deleted presenilin-1 is an early event in apoptosis in-
duced by calcium ionophore A 23187 in SH2SY5Y neuroblastoma
cells［J］． J Neurosci Res，2001，66( 1) : 122 － 134．
收稿日期: 2011-06-17 ( 王奕编辑 解学魁校对)
3061中国公共卫生 2011 年 12 月第 27 卷第 12 期 Chin J Public Health Dec 2011 Vol． 27 No． 12