全 文 ：藤梨根提取物抑制肺癌 A549细胞增殖作用
机制研究
孙雪飞 ,尹秋伟 ,裴艳涛 ,杨国涛＊ ,李希波 ,王德江
(山东大学齐鲁医院 ,山东济南 250012)
　　[摘要 ] 　目的　观察藤梨根乙酸乙酯提取物(RAE)对肺癌 A549细胞凋亡的影响 ,并探讨其作用机制。方法
　体外培养肺癌 A549细胞 ,分别给予不同浓度的 RAE进行干预 , 流式细胞术检测用药后 A549细胞凋亡率变化 ,
免疫组化 SP法检侧细胞 Bcl-2、Bax蛋白表达变化 , RT-PCR法检测细胞 Bcl-2、BaxmRNA表达 , 激光共聚焦显微技
术测定细胞胞内 Ca2+浓度变化。结果　各治疗组给予 RAE作用后细胞凋亡率明显增加 , 并存在时相性和量效依
赖性;用药后 A549细胞 Bcl-2蛋白和 mRNA表达降低 ,而 Bax蛋白和 mRNA表达上调 ,细胞内 Ca2+浓度明显升高 ,
与对照组比较均有显著统计学差异(P均 <0.01), 亦存在时相性和量效依赖性。 结论　RAE可明显诱导肺癌
A549细胞凋亡 ,其机制可能与降低其Bcl-2蛋白和 mRNA表达 、上调 Bax蛋白和 mRNA表达 、升高细胞内 Ca2+浓度
有关。
　　[关键词 ] 　藤梨根提取物;肺肿瘤;细胞凋亡;基因 , Bax;基因 , Bcl-2;细胞内钙离子浓度
　　[中图分类号 ] 　R734.2　　[文献标识码 ] 　A　　[文章编号 ] 　1002-266X(2009)09-0012-04
StudyoftheactionmechanismofRadixActinidiaeextractsonproliferationoflung
cancercelA549
SUNXue-fei, YINQiu-wei, PEIYan-tao, YANGGuo-tao, LIXi-bo, WANGDe-jiang
(QiluHospitalofShandongUniversity, Jinan250012, P.R.China)
　　Abstract:Objective　ToobservetheinfluenceofRadixActinidiaeextractsonapoptosisofA549 cell, andtostudy
itsmechanismofaction.Methods　CulturingA549cellinvitro, treatingwithdifferentconcentrationsofRadixActinidiae
extracts, celapoptosiswasmeasuredbyFCM.ImmunohistochemistryandRT-PCRwasusedtodetecttheexpressofBcl-2,
BaxproteinandmRNA.Intracelularcalciumionlevelwasmeasuredbylaserscanningconfocalmicroscopy.Results　After
giventhedrug, apoptosisrateofA549celineachtreatgroupsobviouslyincreasedbyadose-andtime-dependentmanner.
TheexpressionsofBcl-2proteinandmRNAoftreatgroupsweredown-regulatedandtheexpressionsofBaxproteinandmR-
NAoftreatgroupswereup-regulated.Intracellularcalciumionlevelobviouslyincreasingintreatgroups.Thechangeabove-
mentionedwasalsoinadoseandtime-dependentmanner.Significantdifferencewasfoundcomparewithcontrolgroup(P
<0.01).Conclusions　RadixActinidiaeextractscaninduceapoptosisofA549 celinvitro.Themechanismofinduce
apoptosismaybemediatedbyregulatingtheexpressionofapoptosis-regulatedgeneandthelevelofintracelularcalciumion
level.
Keywords:RadixActinidiaeextracts;lungneoplasms;apoptosis;gene, Bax;gene, Bcl-2;intercelularcalciumion
level
　　近年来 ,随着化学药品的开发渐趋艰难和药害
问题不断被认识 ,从中草药和天然药物中筛选和提
取防治肿瘤的有效成分成为当前研究的热点之一 。
藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的根 ,味甘 、
咸寒 、微涩 ,具有清热解毒 、消肿疥 、祛风湿的功效 ,
对消化道肿瘤疗效较佳 。 2008年 6 ～ 9月 ,我们通
[基金项目 ]山东省中青年科学家科研奖励基金项目(2007BS03061)。
＊通讯作者
过制备藤梨根乙酸乙酯提取物(RAE),观察其对体
外培养的肺癌细胞的抑制作用 ,旨在为临床进一步
应用提供实验依据 。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂 　肺癌 A549细胞由山东省医学
科学院惠赠。 SP免疫组化染色试剂盒 、鼠抗人 Bax
和 Bcl-2单克隆抗体均购自北京中山生物技术有限
公司;RPMI1640培养基 、胎牛血清购自 Gibco公
司;溴化乙锭(BE)、胰蛋白酶为美国 Sigma公司产
12
山东医药 2009年第 49卷第 9期
品;TRIzol试剂盒购自 LifeTechnologies公司;RT-
PCR试剂盒购自 TaKaRa公司;BioPhotometer型微
量核酸定量仪为 Eppendorf公司产品;MJ-PTC200
PCR仪为 MJresearch公司产品。 RAE自行制备。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养与分组　肺癌 A549细胞加入含
10%小牛血清 、青霉素及链霉素各 100 U/ml的 RP-
MI1640培养液中 , 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养 ,
0.25%胰蛋白酶消化传代。以 DMSO将 RAE溶解 ,
再用 RPMI-1640培养液稀释 ,各治疗组使药物工作
终浓度分别为 40、80、160 μg/ml,并设空白对照组 。
1.2.2　流式细胞术检测细胞凋亡率　调整细胞浓
度为 5.0×105 /ml,培养 24 h后各治疗组分别加入
不同浓度的含药培养液 ,各设 6个复瓶 ,培养 24、
48、72 h后 ,收集细胞 ,按照文献 [ 1]方法测细胞凋亡
率 。
1.2.3　免疫组化 SP法检测细胞 Bcl-2、Bax蛋白表
达　调整细胞浓度为 1.0×105 /ml,接种于含载玻
片培养板。待细胞贴壁生长良好时 ,加入不同浓度
的含药培养液 , 各设 3个复孔。培养 24、 48、 72 h
后 ,取出载玻片 , 4%多聚甲醛固定 。免疫组化检测
严格按 SP试剂盒说明书操作 。用已知阳性对照片
作阳性对照 ,以 PBS代替一抗作阴性对照。 Bcl-2、
Bax蛋白阳性染色为胞质内呈现黄色或棕黄色颗
粒 ,每例选取 4个视野进行阳性率测定。
1.2.4　RT-PCR法检测细胞 Bcl-2、BaxmRNA表达
　调整细胞浓度为 1.0×106 /ml,接种于培养板 ,细
胞贴壁后加入不同浓度的含药培养液 ,各每组设 3
个复孔 。培养 24、48、72 h后 ,收集细胞 ,按文献 [ 2]
方法对细胞 Bcl-2、BaxmRNA表达进行半定量分
析 。 Bcl-2上游引物 5′-GTGGTCCACCTGACCCTC-
CG-3′,下游引物 5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′,
扩增片断为 316 bp;Bax上游引物 5′-CAGGAT-
GCGTCCACCAAGAA-3′,下游引物 5′-ATGGTCACG-
GTCCAACCACC-3′,扩增片断为 332 bp;β-actin上
游引物 5′-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3′, 下游引
物 5′-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3′,扩增产物为
224bp。上述引物序列均由上海生物工程技术服务
有限公司合成。
1.2.5　激光共聚焦显微技术测定细胞内 Ca2+浓度
变化　调整细胞浓度为 1.0×104 /ml,接种于培养板 ,
贴壁后加入不同浓度的含药培养液 ,培养 12、24、48、
72h。参见文献[ 3]检测细胞内 Ca2 +浓度的变化。
1.3　统计学方法　采用 SPSS10.0软件进行数据处
理 ,结果以 x±s表示 ,组间比较采用 t检验 。 P≤
0.05为有统计学意义 。
2　结果
2.1　RAE对 A549细胞凋亡率的影响　对照组细
胞自发性凋亡率较低;而治疗组各浓度对 A549细
胞凋亡均有诱导作用 ,且随浓度增加和作用时间延
长 ,细胞凋亡率逐渐增加 。见表 1。
表 1　不同浓度 RAE作用不同时间后 A549细胞的
凋亡率(%, x±s)
组别 n 24h 48h 72h
对照组 6 1.87±0.82 2.19±0.75 2.75±0.94
治疗组
　40μg/ml 6 6.56±2.04＊ 13.49±4.37＊ 26.14±5.25＊
　80μg/ml 6 10.83±3.21＊ 25.57±3.86＊ 39.51±4.96＊
　160μg/ml 6 19.38±3.64＊ 38.06±5.72＊ 48.24±4.57＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.01
2.2　RAE对 A549细胞 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
　对照组 Bcl-2蛋白表达量较高 ,而 Bax蛋白表达
较低;治疗组随浓度增加和作用时间延长 , Bcl-2表
达逐渐下降 , Bax蛋白表达逐渐上升 。见表 2、3。
表 2　不同浓度 RAE作用不同时间后 A549细胞 Bcl-2
蛋白的阳性表达率(%, x±s)
组别 n 24h 48h 72h
对照组 3 57.57±3.43 55.39±6.14 57.15±5.08
治疗组
　40μg/ml 3 48.66±3.90＊ 37.87±3.65＊ 29.07±5.40＊
　80μg/ml 3 36.84±6.19＊ 29.77±4.37＊ 20.16±3.07＊
　160μg/ml 3 29.73±5.61＊ 21.32±3.46＊ 13.46±3.91＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
表 3　不同浓度 RAE作用不同时间后 A549细胞 Bax
蛋白的阳性表达率(%, x±s)
组别 n 24h 48h 72h
对照组 3 19.15±3.16 20.46±4.33 19.29±3.71
治疗组
　40μg/ml 3 26.68±2.74＊ 30.52±3.04＊ 36.55±4.62＊
　80μg/ml 3 31.88±4.37＊ 41.06±4.72＊ 46.91±4.24＊
　160μg/ml 3 35.41±3.87＊ 47.45±4.70＊ 53.51±3.69＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
2.3　RAE对 A549细胞 Bcl-2、BaxmRNA表达的影
响　对照组 A549细胞 Bcl-2表达量较高 ,而 Bax
mRNA表达量相对较低;治疗组随浓度增加和作用时
间延长 , Bcl-2mRNA表达逐渐减少 ,而 BaxmRNA表
达逐渐增强。见表 4、5。
表 4　不同浓度 RAE作用不同时间后 A549细胞
Bcl-2 mRNA表达( x±s)
组别 n 24h 48h 72h
对照组 3 0.831±0.054 0.820±0.075 0.856±0.064
治疗组
　 40μg/ml 3 0.667±0.048＊ 0.573±0.052＊ 0.492±0.046＊
　 80μg/ml 3 0.596±0.104＊ 0.445±0.092＊ 0.349±0.088＊
　 160μg/ml 3 0.501±0.116＊ 0.376±0.079＊ 0.276±0.103＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
13
山东医药 2009年第 49卷第 9期
表 5　不同浓度 RAE作用不同时间后 A549细胞
BaxmRNA表达( x±s)
组别 n 24h 48h 72h
对照组 3 0.195±0.052 0.237±0.044 0.199±0.093
治疗组
　40μg/ml 3 0.325±0.048＊ 0.380±0.058＊ 0.430±0.066＊
　80μg/ml 3 0.401±0.088＊ 0.435±0.079＊ 0.521±0.084＊
　160μg/ml 3 0.494±0.075 0.583±0.071＊ 0.614±0.110＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
2.4　RAE作用后 A549细胞胞内 Ca2+浓度变化　
见表 6。
3　讨论
中药抗肿瘤具有低毒 、安全的优势。使用藤梨
根组方治疗肿瘤在我国由来已久 ,民间流传用壁虎
(米炒焦研粉)、藤梨根煮红枣治疗胃癌 、肺癌 ,效果
较好 。近年研究表明 ,藤梨根复方制剂在体内外均
表 6　不同浓度 RAE作用不同时间后细胞内 Ca2+染色荧光强度( x±s)
组别 n 细胞内Ca
2+染色荧光强度
12h 24h 48h 72h
对照组 3 238.45±43.07 254.75±32.67 247.70±51.08 265.44±40.86
治疗组
　40μg/ml 3 724.55±142.20＊ 553.47±132.98＊ 610.42±118.95＊ 631.83±147.66＊
　80μg/ml 3 916.39±133.61＊ 754.73±154.84＊ 694.76±145.72＊ 720.54±136.60＊
　160μg/ml 3 1367.42±120.35＊ 872.06±120.45＊ 903.11±141.86＊ 997.01±130.24＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
有抑制肿瘤转移 [ 4] 、逆转多药耐药 [ 5] 、对化放疗减
毒增效 [ 6]的作用 。但上述研究是采用藤梨根复方
制剂进行 ,关于藤梨根单体及其有效成分的抗肿瘤
研究少见报道。我们既往的研究显示 , RAE在体外
可明显抑制肺癌 A549细胞的生长和增殖 ,但其作
用机制尚不明确 [ 7] 。本研究结果显示 , RAE在体外
可明显促进肺癌 A549细胞凋亡 ,并存在时相性和
剂量依赖性 ,表明诱导肺癌细胞凋亡是 RAE抗肺癌
作用的重要机制 。
细胞凋亡受多种基因调控 ,并通过凋亡相关的
信号传导系统介导来实现 ,因此在接受死亡信号后
细胞是否凋亡 ,与凋亡相关基因表达密切相关 。
Bcl-2和 Bax基因是 Bcl-2家族的两个重要的凋亡相
关基因 , Bcl-2蛋白主要定位于线粒体外膜的胞质
面 、内质网膜 、核膜上 ,起离子通道和停靠蛋白的双
重作用 ,可通过稳定跨膜电位 、抑制凋亡诱导因子释
放 、阻止 Caspase活化等多种方式抑制凋亡发生;而
Bax不但拮抗 Bcl-2的凋亡抑制作用 ,而且具有直接
促进细胞凋亡的功能 ,当 Bax在细胞内超表达时 ,细
胞对死亡信号的反应增强 ,细胞死亡增多 [ 8] 。 Bcl-2
高表达时 ,可形成 Bcl-2同源二聚体 ,细胞凋亡被抑
制;Bax高表达时 ,则形成 Bax同源二聚体 ,加速细
胞凋亡 , Bc1-2/Bax异二聚体可以抵消 Bcl-2同二聚
体的抑凋亡作用 ,而发挥促凋亡的功能。因此 , Bcl-
2与 Bax的比值决定了细胞是否接受凋亡诱导信
号 ,以及接受凋亡刺激后细胞的生死 [ 9] 。本研究显
示 ,对照组 A549细胞 Bcl-2蛋白及 mRNA表达水平
较高 ,而 Bax蛋白及 mRNA表达水平低 , Bcl-2/Bax
比值升高 ,表明抗凋亡的因素占优势 ,与对照组细胞
凋亡指数较低的结果相符。而经过 RAE处理后 ,
A549细胞 Bcl-2蛋白及 mRNA表达水平均有下降 ,
Bax蛋白和 mRNA表达水平均升高 ,且药物作用效
果存在量效和时效关系;上述指标变化与对照组比
较均有统计学意义 ,并且 RAE对凋亡相关基因表达
调控的强度与本实验中药物作用后细胞凋亡变化的
检测结果趋势一致。表明 RAE可通过在 mRNA和
蛋白水平上调肺癌 A549细胞 Bax基因的表达 ,下
调 Bcl-2基因的表达 ,使 Bcl-2 /Bax比值下降来诱导
A549细胞凋亡 ,而对凋亡相关基因表达的调控是
RAE诱导肺癌细胞凋亡的分子机制之一 。
细胞凋亡的诱导和抑制也与凋亡信号转导通路
有关。研究表明 ,在多数细胞凋亡过程中 ,胞内的
Ca2 +浓度均有增加[ 10] 。 Ca2+作为重要的细胞内信
号传导的第二信使 ,可通过多条途径诱导细胞凋亡。
本研究结果显示 ,对照组 A549细胞内 Ca2+浓度恒
定 ,随时间延长无明显变化;而治疗组在用药后 12h
细胞内 Ca2 +浓度即明显升高 ,随浓度加大升高逐渐
明显 ,具有剂量依赖性;此后随作用时间延长 ,细胞
内 Ca2+浓度出现减低 ,但作用 72h时各治疗组细胞
内 Ca2 +荧光强度仍明显高于对照组。这与文献[ 11]
报道 Ca2+升高与细胞早期凋亡的启动有关相一致。
表明 RAE可以通过升高肺癌细胞内 Ca2+浓度达到
诱导肺癌细胞凋亡的目的 ,这也是 RAE诱导肺癌细
胞凋亡的分子机制之一 。
综上所述 , RAE可通过下调 Bcl-2基因表达 、上
调 Bax基因表达使 Bcl-2 /Bax比值下降 ,同时升高
细胞内 Ca2+浓度 ,实现对 A549细胞凋亡的诱导 ,且
其凋亡诱导作用存在时效性和量效性。这种诱导凋
亡作用是 RAE抗肺癌的机制之一 ,而对凋亡相关基
因和细胞内 Ca2+浓度的调控是其诱导肺癌细胞凋
14
山东医药 2009年第 49卷第 9期
亡的分子机制。本研究在深层次上认识藤梨根的药
理作用机制 ,为其临床应用提供了实验和理论依据 。
[参考文献 ]
[ 1] 韩萍 ,裴兰英 ,李娟 ,等.葛根粗提物 、葛根素对肺癌 H446细胞
增殖的抑制作用及其机制 [ J].山东医药 , 2008, 48(15):7-9.
[ 2] 雷海鸣 ,卞建民 ,詹志林 ,等.肝癌细胞中 PI3K信号通路对骨桥
蛋白表达的影响 [ J] .山东医药 , 2007, 47(27):20-21.
[ 3] 马贵喜 ,李鸣皋 ,韩磊 ,等.缺氧对血管内皮细胞内 Ca2+的影响
以及合贝爽的保护作用 [ J].山东医药 , 2007, 47(16):18-19.
[ 4] 潘云华 ,潘琦.复方三根制剂对 T739小鼠肺癌转移的实验研究
[ J] .浙江中西医结合杂志 , 2005, 15(2):76-78.
[ 5] 冯正权 ,郭勇 ,朱宁希 ,等.复方三根制剂逆转多药耐药的实验研
究 [ J] .中国肿瘤 , 2003, 12(6):370-371.
[ 6] 王洪真 ,王海滨 ,高宏 ,等.DCF方案联合扶正和胃汤治疗进展
期胃癌 34例临床观察 [ J] .中国中西医结合杂志 , 2007, 27
(10):927-929.
[ 7] 孙雪飞 ,杜贾军 ,孟龙 ,等.藤梨根提取物抗人肺腺癌 A549细胞
生长的实验研究 [ J] .山东医药 , 2006, 46(9):40-41.
[ 8] CoryS, AdamsJM.TheBcl-2family:regulatorsofthecellularlife-or-
deathswitch[J].NatRevCancer, 2002, 2(9):647-656.
[ 9] CoultasL, StrasserA.TheroleoftheBcl-2proteinfamilyincancer
[ J].SeminCancerBiol, 2003, 13(2):115-123.
[ 10] RaySK, FidanM, NowakM.OxidativestressandCa2+influxup-
regulatecalpainandinduceapoptosisinPC12cels[J].BrainRes,
2000, 852(2):326-334.
[ 11] PopescuBO, Cedazo-MinguezA, PopescuLM, etal.Caspasecleav-
ageofexon9deletedpresenilin-1isanearlyeventinapoptosisin-
ducedbycalciumionophoreA 23187 inSH-SY5Yneuroblastoma
cels[ J] .JNeurosciRes, 2001, 66(1):122-134.
(收稿日期:2009-02-10)
·经验交流·
金水宝胶囊联合复方肾炎片治疗糖尿病肾病疗效观察
李雪芹 ,黄斐斐
(即墨市人民医院 ,山东即墨 266200)
　　糖尿病肾病(DN)目前尚无特效疗法。近年来 , 我们应
用金水宝胶囊联合复方肾炎片治疗 DN患者 36例 , 观察用
药前后患者尿蛋白 、肾功能的改变情况。现报告如下。
临床资料:选择 DN患者 36例 , 男 20例 、女 16例 , 年龄
33 ～ 70岁 、平均 45岁。均合并蛋白尿 , 尿蛋白定量 0.78 ～
7.90 g/24 h。合并糖尿病视网膜病变 20例 ,合并高血压 16
例。肌酐清除率(Ccr)>75 ml/min8例 , 48 ～ 75 ml/min10
例 , 24 ～ 47ml/min12例 , <24 ml/min6例 。排除肾脏疾病 、
泌尿系统感染及酮症酸中毒患者。
方法:患者均采用饮食控制疗法 , 20例应用胰岛素控制
血糖者继续使用 , 16例口服糖适平 30 ～ 60 mg/d;高血压患
者口服依那普利及长效硝苯地平 ,未用其他降糖药。控制血
糖 、血压相对稳定(空腹血糖 5.4 ～ 0.8 mmol/L,血压 <150/
90 mmHg)。 2周后复查血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、Ccr、
24 h尿蛋白定量作为自身对照 , 然后口服复方肾炎片 3片 /
次 、金水宝 5粒 /次 , 3次 /d,治疗 8周后重复以上检查。数据
采用 x±s表示 , 治疗前后比较采用 t检验。
结果:治疗 8周后 , 尿蛋白由(3.6±1.70)g/24 h降至
(1.6 ±0.76)g/24 h, 治疗前后比较有统计学差异(P<
0.01)。其中 10例合并肾病综合征者治疗 8周后 ,尿蛋白由
(6.4±1.40)g/24 h降至(2.4±0.69)g/24 h, 效果显著。患
者治疗前后肾功能指标变化见表 1。
讨论:DN是糖尿病的主要慢性并发症之一 , 是年轻糖尿
病患者死亡的重要原因。 DN早期因起病隐匿 、进展缓慢易
被忽视 ,一旦进入大量蛋白尿期 ,肾功能的损害速度加快 ,且
表 1　DN患者治疗前后肾功能指标变化( x±s)
检测时间 Scr(μmol/L) BUN(mmol/L) Ccr(ml/min)
治疗前 280.0±182.4 11.50±4.20 48.0±24.2
治疗后 186.0±103.0＊ 8.93±5.00＊ 54.0±25.3＊
　　注:与治疗前比较 , ＊P<0.05
不易逆转 ,最终发展成肾功能衰竭。 DN的治疗目前主张早
期应限制蛋白摄入量 ,但低蛋白饮食不能保证营养和正氮平
衡 ,而且可能导致体内氨基酸代谢紊乱 , 尤其是必需氨基酸
水平下降。研究显示 ,对慢性肾功能不全患者应用必需氨基
酸治疗 ,不仅可以弥补体内必需氨基酸的不足 , 改善营养状
态 ,而且还有可能通过促进非必需氨基酸的合成 , 从而降低
蛋白质代谢最终产物在体内的积聚。金水宝胶囊是采用微
生物深层液体培养方法制作的发酵虫草菌粉 , 具有与天然冬
虫夏草同样的成分 ,含有多种人体必需氨基酸。复方肾炎片
的主要药物组成为丹参 、黄芪 、黄芩 、黄精 、茯苓 、牵牛子 、山
楂 、白茅根等中药。方中黄芪补气摄血 , 固表御邪 , 有补气 、
利水 、消肿等功效 , 能减少尿蛋白 、降低血清胆固醇和甘油三
酯;白茅根含有鼠李糖苷 、葡萄糖苷等成分 , 具有清热利湿 、
凉血止血 、解毒消肿的作用 , 其与车前子联合具有增加白细
胞吞噬能力 、扩张肾毛细血管 、增加肾血流量和利尿的作用。
本文结果显示 , 金水宝胶囊联合复方肾炎片治疗 DN可明显
降低患者的尿蛋白 ,改善其肾功能 ,治疗效果确切 , 值得临床
推广应用。
(收稿日期:2008-12-11)
15
山东医药 2009年第 49卷第 9期