全 文 ：藤梨根提取物抗肺癌作用的体内实验研究
孙雪飞，裴艳涛，杨国涛* ，尹秋伟，吴铭生
(山东大学齐鲁医院，济南 250012)
摘要:目的 研究藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌 A549 细胞裸鼠移植瘤的生长抑制及凋亡诱导作用，探讨其可
能机制。方法 用肺癌 A549细胞建立肺癌裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、治疗组(高剂量组、低剂量组)。根据
瘤体积变化绘制移植瘤生长曲线，根据终末瘤质量比较计算抑制率，移植瘤细胞凋亡指数检测采用 TUNEL法，移植
瘤细胞 Bcl-2、Bax蛋白、Ki-67抗原表达检测采用免疫组化 SP法，RT-PCR检测移植瘤 Bcl-2、Bax mRNA表达。结果
各治疗组经藤梨根乙酸乙酯提取物治疗后移植瘤生长缓慢，治疗结束时治疗组移植瘤质量及瘤体积明显低于对照组
(P均 ＜0． 01) ，高、低剂量组的瘤质量抑制率分别为 69． 00%和 45． 09%。治疗组移植瘤细胞透射电镜下均可见不同
阶段典型的凋亡细胞形态学变化。各治疗组移植瘤组织凋亡指数明显高于对照组，而增殖指数明显减低，Bcl-2 mR-
NA及蛋白表达较对照组亦明显减少，Bax蛋白及 mRNA表达较对照组明显增加，高剂量组尤其明显(P 均 ＜ 0． 01)。
结论 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌 A549细胞裸鼠移植瘤生长有抑制作用，其机制与抑制移植瘤细胞的增殖活性
和诱导癌细胞凋亡有关，而降低 Bcl-2基因表达、上调 Bax基因表达可能是其诱导细胞凋亡机制之一。
关键词:肺肿瘤;藤梨根提取物;小鼠;基因，bcl-2
中图分类号:R979． 1 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2011)41-0016-03
Inhibitory effect of Radix Actinidiae extractive on transplantation tumor of lung cancer cell
line A549 in mude mice and its mechanism
SUN Xue-fei，PEI Yan-tao，YANG Guo-tao，YIN Qiu-wei，WU Ming-sheng
(Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，P． R． China)
Abstract:Objective To study the inhibitory effect and induced apoptosis function of acetidin extractive of radix Ac-
tinidiae on transplantation tumor of lung cancer A549 cell in mude mice，and to explore its mechanism of action． Methods
Establishing the modle of transplantation tumor bearing lung cancer A549 cells in mude mice to detect the effect of aceti-
din extractive of radix Actinidiae in vivo． Control group and treatment groups (high-dose group and low-dose group)were
set for comparison． The transplantation tumor growth curve was drawn according to transplantation tumor volume，and inhibi-
tion ratio was calculated according to the last tumor weight． Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated UTP Nick End
Labeling (TUNEL)was used to examine the apoptosis index of the transplantation tumor． Immunohistochemistry (SP)was
used to examine the expressions of Bcl-2，Bax protein and Ki-67 antigen in the transplantation tumor． RT-PCR was used to
examine the expressions of Bcl-2，Bax mRNA． Results The growth of transplantation tumor in treatment groups became
slowly after taking drug． The last tumor volume and tumor weight of treatment groups were smaller than that of control group．
The tumor weight inhibiting rates of high-dose group and low-dose group were 69% and 45． 09% individually． Transmission
electron microscope also detect transplantation tumor cells to undergo apoptosis with typically apoptotic characteristics． The
apoptosis index of the transplantation tumor of treatment groups was higher than that of control group． The expressions of
Bcl-2 protein，Ki-67 antigen in treatment groups were lower than those of control group． The expressions of Bax in treatment
groups were higher than those of control group especialy the high-hose group(P ＜ 0． 01)． Conclusions The acetidin ex-
tractive of radix Actinidiae has the inhibitory effect on the growth of transplantation tumor of lung cancer A549 cell in mude
mice． To inhibit proliferation activity of transplantation tumor，to degrade the expression of Bcl-2，to up-regulation the ex-
pression of Bax，and to induce apoptosis of cancer cell may be its mechanism of action．
Key words:lung neoplasms;radix actinidiae extractive;mice;apoptosis;genes，bcl-2
基金项目:山东省中青年科学家科研奖励基金项目(2007BS03061)。
* 通讯作者
中药藤梨根为猕猴桃科猕猴桃属软枣猕猴桃的
根，临床上常用来治疗肿瘤，尤其对消化道肿瘤疗效
较佳。国内学者研究显示，猕猴桃属多种猕猴桃根
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的提取物，在体外对肿瘤细胞生长均有明显的抑制
作用，而我们既往研究结果显示藤梨根乙酸乙酯提
取物对体外培养的肺癌细胞有较好的抑制作用，并
可诱导其发生凋亡［1］。2008 年 5 月 ～ 2009 年 5 月，
为进一步验证其作用，我们用肺癌 A549 细胞建立
肺癌裸鼠移植瘤模型，观察藤梨根乙酸乙酯提取物
对体内肺癌细胞生长的影响，并探讨其可能作用机
制，为其进一步临床应用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 细胞株与实验动物:人肺癌 A549 细胞
株，购自山东省医学科学院基础所。35 只 BALB /C
(nu /nu)裸小鼠购自北京维通利华实验动物有限公
司。主要仪器和试剂:SP 免疫组化染色试剂盒、鼠
抗人 Ki-67 和 Bcl-2、Bax 单克隆抗体、TUNEL 试剂
盒均购自北京中山生物技术有限公司;RPMI 1640
培养基、胎牛血清购自 Gibco 公司;溴化乙啶、胰蛋
白酶为美国 Sigma 公司产品;捷达 801 系列形态学
分析系统为江苏捷达科技发展有限公司产品;RT-
PCR试剂盒购自 TaKaRa 公司;RNA 提取液(TR-
Izol)购自 Life Technologies公司;MJ-PTC200 PCR仪
为 MJ research 公司产品。藤梨根乙酸乙酯提取物
的制备参见文献［1］。
1． 2 方法
1． 2． 1 裸鼠移植瘤模型建立 调整细胞浓度为 1
×106 /ml，取 0． 2 ml细胞悬液接种于消毒后的裸鼠
右前肢背部皮下，经 3 ～ 7 d待接种部位出现较硬的
瘤结节时，表明制模成功。
1． 2． 2 实验分组及干预方法 当移植瘤生长至最
大直径 4 ～ 5 mm 时进行干预，将 32 只成瘤裸鼠按
随机数字法随机分为三组:高剂量组 10 只、低剂量
组 11 只和对照组 11 只。高、低剂量组用灌胃法每
日分别喂服 150、75 mg /kg藤梨根乙酸乙酯提取物;
对照组灌服等量溶剂。共治疗 28 d。实验中观察裸
鼠精神、进食、排便及体质量情况。
1． 2． 3 各组移植瘤体积、质量和抑瘤率测定 隔天
称裸鼠体质量，游标卡尺测量移植瘤长径 a 和短径
b，按公式 V = πab2 /6 计算瘤体积，依此绘制移植瘤
生长曲线。最后一次用药后 24 h 以颈椎脱位方式
处死裸鼠，剥出的肿瘤去除血污、脂肪等非瘤组织，
测量瘤质量，计算各组平均瘤质量及抑制率(IR)。
IR =［(肿瘤对照组平均瘤质量 －治疗组平均瘤质
量)/对照组平均瘤质量］× 100%。
1． 2． 4 透射电镜观察移植瘤细胞超微结构变化
将瘤组织剪成约 2 mm × 2 mm × 2 mm 大小 4 块，剪
碎后迅速放入 4%戊二醛 PBS 固定液过夜。PBS 洗
涤 3 次，1%四氧化锇固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂
包埋，超薄切片;醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色，
透射电镜观察瘤细胞的超微结构变化。
1． 2． 5 TUNEL法检测移植瘤的细胞凋亡 移植瘤
石蜡切片常规脱蜡，TUNEL 操作及凋亡指数(AI)
评定参见文献［2］。
1． 2． 6 免疫组化 SP 法检测移植瘤组织 Ki-67 抗
原、Bcl-2、Bax蛋白表达 每例移植瘤石蜡标本切片
3 张，具体染色操作及结果评定参见文献［1］，以 Ki-
67 抗原阳性表达率为增殖指数(PI)。
1． 2． 7 RT-PCR法检测瘤组织 Bcl-2、Bax mRNA 表
达 取 50 mg肿瘤组织，匀浆离心后取移植瘤细胞
1 × 106 个。引物设计及合成、RT-PCR 操作、图像结
果分析参见文献［1］。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS10． 0 统计软件，计量
数据以 珋x ± s表示，采用 t 检验进行组间比较。以 P
≤0． 05为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 裸鼠一般情况观察 裸鼠在接种 A549 细胞
后共成瘤 32 只，成瘤时间 7 ～ 10 d，成瘤率91． 43%。
治疗前后各治疗组裸鼠体质量与对照组相比差异无
统计学意义(P ＞ 0． 05)。治疗组裸鼠一般情况包括
进食水、精神、活动均无明显变化，对照组裸鼠在实
验后期活动减少、精神欠佳、进食下降。
2． 2 各组裸鼠移植瘤的生长曲线及抑制率 对照
组移植瘤生长方式符合指数生长方式，后期生长较
快，个别裸鼠移植瘤出现破溃，生长曲线拟合方程为
y = 6e0． 2855x，而各治疗组裸鼠移植瘤生长较对照组明
显减慢，高剂量组尤其明显，见图 1;各组移植瘤体
积、瘤质量和抑制率见表 1。
图 1 各组裸鼠移植瘤的生长曲线
表 1 各组移植瘤体积、瘤质量和抑制率(珔x ± s)
组别 n 瘤体积(mm3) 瘤质量(mg) 抑制率(%)
对照组 11 2 965． 34 ± 131． 3 2 647． 33 ± 156． 4 －
低剂量组 11 1 578． 92 ± 123． 5* 1 453． 71 ± 50． 7* 45． 09
高剂量组 10 876． 48 ± 87． 2＊▲ 820． 66 ± 35． 9＊▲ 69． 00
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 01;与低剂量组比较，▲P ＜ 0． 01
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2． 3 移植瘤组织超微结构观察 电镜下对照组瘤
细胞多呈不规则形，细胞周边大量胞突;细胞质内有
较多细胞器，线粒体形态规则，粗面内质网丰富，部
分呈指纹状改变;细胞核浆比值大，染色质丰富，分
布均匀，核仁多为 2 个以上。而治疗组瘤细胞可见
细胞凋亡的形态学变化，表现为部分细胞周边胞突
减少，甚至完全消失，胞内的微观结构减少、消失，线
粒体肿胀;细胞内出现大量空泡;核形态缩小，染色
质染色加深，呈新月形向核膜边缘聚集，有的可见典
型凋亡小体。
2． 4 各组 PI、AI比较 见表 2。
表 2 各组 PI、AI比较(%，珔x ± s)
组别 n AI PI
对照组 11 2． 00 ± 0． 82 80． 36 ± 7． 35
低剂量组 11 20． 46 ± 3． 47* 59． 29 ± 5． 21*
高剂量组 10 43． 73 ± 5． 32＊▲ 23． 45 ± 6． 34＊▲
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 01;与低剂量组比较，▲P ＜ 0． 01
2． 5 各组 Bcl-2、Bax 蛋白及 mRNA 表达比较 见
表 3。
表 3 各组 Bcl-2、Bax蛋白及 mRNA比较(%，珔x ± s)
组别 n Bcl-2 Bax Bcl-2 mRNA Bax mRNA
对照组 11 55． 86 ± 4． 49 22． 15 ± 6． 16 0． 831 ± 0． 084 0． 215 ± 0． 072
低剂量组 11 37． 15 ± 4． 60* 42． 06 ± 6． 72* 0． 545 ± 0． 092* 0． 435 ± 0． 079*
高剂量组 10 23． 79 ± 4． 63＊▲ 56． 91 ± 3． 15＊▲ 0． 376 ± 0． 103＊▲ 0． 694 ± 0． 110＊▲
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 01;与低剂量组比较，▲P ＜ 0． 01
3 讨论
国内研究结果显示，藤梨根复方制剂具有逆转
肿瘤多药耐药、阻止肿瘤细胞生长转移、对化放疗减
毒增效的作用。因此我们制备藤梨根乙酸乙酯提取
物，在体外研究的基础上，通过肺癌裸鼠皮下移植瘤
模型，进一步观察其对体内肺癌细胞生长的影响。
结果显示经藤梨根乙酸乙酯提取物治疗后，移植瘤
的生长速度明显减慢，各时段移植瘤体积均小于对
照组;治疗结束时治疗组移植瘤瘤质量明显低于对
照组，高剂量组抑瘤率可达 69． 00%;同时治疗组增
殖细胞核抗原 Ki-67 表达减少，凋亡率明显高于对
照组，高低剂量组之间上述观察指标亦有差别;表明
藤梨根乙酸乙酯提取物在体内仍然可明显抑制肺癌
A549 细胞的生长、增殖，并能够诱导其发生细胞凋
亡。
细胞凋亡是受多种基因精细调控的，因此在接
受死亡信号后细胞是否发生凋亡与凋亡相关基因表
达密切相关。Bcl-2 和 Bax基因是 Bcl-2 家族两个重
要的凋亡相关基因，在凋亡过程中发挥重要调控作
用。Bcl-2 蛋白可以通过稳定跨膜电位［3］、抑制凋亡
诱导因子释放［4］、阻止 caspase 的活化［5］等多种方
式抑制凋亡发生。Bax 具有拮抗 Bcl-2 的凋亡抑制
作用，而且有直接促进细胞凋亡的功能。Bcl-2 主要
通过自身二聚或与 Bax等蛋白形成异二聚体来发挥
其调控细胞凋亡的功能，而 Bcl-2 与 Bax 之间的比
值决定着接受凋亡刺激后细胞的生死［6］。本研究
结果显示治疗组移植瘤细胞 Bcl-2 蛋白及 mRNA 表
达水平均有下降，而 Bax 蛋白和 mRNA 表达水平升
高，效果随剂量增加而明显;上述指标变化与对照组
比较均有统计学意义。表明藤梨根乙酸乙酯提取物
在体内依然可以通过在 mRNA 和蛋白水平上调肺
癌细胞 Bax基因表达，下调 Bcl-2 基因表达，使 Bcl-
2 /Bax下降来诱导细胞凋亡，而对凋亡相关基因表
达的调控是藤梨根乙酸乙酯提取物体内诱导肺癌细
胞凋亡的重要分子机制之一。
实验中治疗组裸鼠的一般情况包括进食、饮水
均无明显变化，体质量无明显减轻，未观察到药物相
关性不良作用。表明藤梨根乙酸乙酯提取物对机体
无明显不良作用，这也显示出其良好的应用前景，为
肺癌的临床治疗开辟一条新的途径。
参考文献:
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(收稿日期:2011-08-12)
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