全 文 ：收稿日期:2012-07-26; 修订日期:2012-11-27
基金项目:新疆乌鲁木齐市天山区科学技术计划项目
( No． tsqkjjh20110711)
作者简介:王 雪( 1979-) ，女( 汉族) ，新疆沙湾人，现任新疆维吾尔自治
区药物研究所助理研究员，硕士学位，主要从事中药药理学研究工作．
* 通讯作者简介:黄 华( 1965-) ，女( 汉族) ，江西樟树人，现任新疆维吾
尔自治区药物研究所研究员，硕士学位，主要从事中药药理学研究工作．
天山堇菜提取物体内外抗流感病毒作用的初步研究
王 雪，姚 华，王林林，杨巧丽，刘 燕，史玉柱，黄 华*
(新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)
摘要:目的 观察天山堇菜提取物体内、外的抗流感病毒作用。方法 体外以 MDCK细胞为宿主，采用 MTT法和病毒致细
胞病变( CPE) 法测定样品抑制甲型流感病毒济防 90 － 15、A/PR /8 /34 的半数抑制浓度( IC50 ) ，并计算选择指数( SI) 。体
内抗病毒实验用流感病毒鼠肺适应株( PR8) 滴鼻感染小鼠建立流感病毒性肺炎模型，以死亡保护率、生命延长率和肺指
数等为指标，评价样品的保护作用。结果 天山堇菜提取物对甲型流感病毒济防 90 － 15、A/PR /8 /34 致 MDCK 细胞病变
的 IC50分别为 32． 90，28． 75 μg·ml
－1，SI分别为 7． 86、9． 00;天山堇菜提取物 500 mg·kg －1可明显延长小鼠流感病毒性肺
炎模型的平均存活天数，其生命延长率为 38． 5%、死亡保护率为 54． 5% ;天山堇菜提取物 500，250 mg·kg －1均对流感病
毒性肺炎小鼠肺指数有明显的抑制作用，抑制率分别为 28． 3%，14． 5%。结论 天山堇菜提取物具有一定的抗流感病毒
作用。
关键词:天山堇菜提取物; 流感病毒; 死亡保护率; 肺指数
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 02． 063
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 02-0382-02
天山堇菜，维药名为比那夫西(Herba Violae tianshanicae)是
堇菜科(Violaceae)植物天山堇菜 Viola tianshanica Maxim 的干燥
全草，收载于部颁药品标准《维吾尔药分册》。其气味微苦辛，
凉，清热解毒，具有调理、软化、发汗的作用［1］。主要用于轻泻异
常胆液质，调节血液热性过盛，生津止渴，发汗退烧。临床用于热
性感冒，发烧，头痛，咽痛，肢肿，小儿惊厥，也可外用于疔疮肿痛
等症［1，2］。其药用部位是全草，全草经预试检出含挥发油、黄酮
类、生物碱、氨基酸、粘液质皂苷，鞣质等［2］。一直以来，天山堇
菜作为一种维吾尔民族药在新疆民间广泛应用，但对其药理作用
方面的研究却很少。本文对其体内、外抗流感病毒作用进行了初
步的研究，现将实验结果报道如下。
1 材料与仪器
1． 1 药品及药材 天山堇菜，购自新疆维吾尔医院。阳性对照
药，利巴韦林，0． 1g /片，国药准字 H20033538，江西汇仁药业有
限公司生产，批号:0911025。达菲，上海药物所生产，批号:
20090712。
1． 2 试剂 DMEM 液体培养基，批号 701998，GIBCO 公司;细胞
培养液，含 10%胎牛血清的 DMEM液体培养基。维持液，除不含
胎牛血清外，其他均同细胞培养液。洗液为含有 2%双抗(硫酸
链霉素和硫酸卡那霉素)的 MEM培养液。
1． 3 仪器 BHC － 1300ⅡA/B3 型生物安全柜(苏净集团安泰公
司) ;HH． CP － 01 型 CO2 培养箱(上海福玛试验设备有限公司) ;
XDS － 1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂) ;MDF － 382E 型超低温
冰箱(日本三洋电器) ;UPH － II － 5 型纯水仪(成都超纯科技有
限公司)。
1． 4 细胞和病毒 狗肾传代细胞(MDCK)、甲型流感病毒(济防
90 － 15)、(A/PR /8 /34)、流感病毒鼠肺适应株 PR8 均购自中国
预防医科院病毒研究所，病毒经鸡胚传代后 － 70℃低温冰箱保存
备用。
1． 5 动物 昆明种小鼠(清洁级)120 只，体质量 18 ～ 20 g ，雌雄
各半，购自新疆实验动物研究中心，动物合格证号:SCXK(新)
2011 － 0001。
2 方法
2． 1 样品的制备 取天山堇菜药材，加 10 倍量水，回流提取，合
并提取液，减压浓缩至浸膏，混悬溶解后上 AB － 8 型大孔吸附树
脂柱，收集 50% 乙醇洗脱部位，干燥后得到天山堇菜提取物，每
克相当于药材 106 g。
2． 2 天山堇菜提取物体外抗流感病毒作用
2． 2． 1 测定样品对 MDCK 细胞的毒性［3 ～ 6］ 天山堇菜提取物溶
于 DMSO，配成适宜初始浓度，与利巴韦林及达菲分别用维持液
作 3 倍稀释(1∶ 3，1∶ 9，1∶ 27…1∶ 6561) ，各 8 个稀释度，加到
接种 MDCK 细胞并已长成单层的 96 孔培养板中，100 μl /孔，每
稀释度 4 个复孔，同时设细胞对照。将培养板置 35℃ 5% CO2
培养箱中培养，每日观察细胞生长情况，确定细胞不出现明显退
变的最低稀释倍数为最大无毒浓度(TC0) ，并按 Reed － Muench
法计算 50%毒性浓度(TC50)。
2． 2． 2 测定药物对病毒致细胞病变(CPE)的影响［6，7］ 取已接种
MDCK细胞并长成单层的培养板，吸弃培养液，分别接种 100 倍
的半数组织培养感染剂量(100TCID50)的不同病毒液 100 μl，置
35℃ 5% CO2 培养箱中吸附 1 h 后，吸弃病毒液，用洗液洗细胞
表面 2 次，设细胞对照组、病毒对照组、利巴韦林及达菲(取 TC0
及 TC0 以下 7 个 3 倍倍比稀释浓度，共 8 个浓度)组、天山堇菜提
取物(取 TC0 及 TC0 以下 7 个 3 倍倍比稀释浓度，共 8 个浓度)
组，4 孔 /组;各给药组依次加入不同稀释度的药液，对照组加维
持液，100 μl /孔;培养板置 37℃，5% CO2 培养箱中培养，每日倒
置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达 4 级时
记录实验结果，并按 Reed － Muench 法计算 IC50，SI = TC50 / IC50。
细胞病变按 6 级标准判断，即:“ －”:细胞生长正常，无病变出
现;“±”:细胞病变少于整个单层细胞的 10%;1:细胞病变约占
整个单层细胞的 25%以下;2:细胞病变约占整个单层细胞的
50%以下;3:细胞病变约占整个单层细胞的 75%以下;4:细胞病
变约占整个单层细胞的 75%以上。
2． 3 天山堇菜提取物体内抗流感病毒作用
2． 3． 1 对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用［8，9］ 取小鼠 60
只，体质量 18 ～ 20 g，按体质量、性别随机分为模型组、利巴韦林
(60 mg·kg －1)组和天山堇菜提取物 0． 25，0． 5 g·kg －1两个剂量
的给药组，天山堇菜提取物组和利巴韦林组按上述剂量灌胃给
药，模型组灌胃等量的蒸馏水，2 次 /d，连续 6 d。于第 3 天给药
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 2 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 2
后，各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以 2LD50浓度的流感病毒鼠肺适
应株 PR8 滴鼻感染，0． 05 ml /只。记录感染后各组小鼠的死亡情
况，于感染后第 14 天计算死亡率、死亡保护率及平均存活天数、
生命延长率。
2． 3． 2 对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的抑制作用［9 ～ 11］ 取小鼠
60 只，体质量 18 ～ 20 g，按体重、性别随机分为对照组、模型组、
利巴韦林(60 mg·kg －1)组和天山堇菜提取物 0． 25，0． 5 g·kg －1
2个剂量的给药组，天山堇菜提取物组和利巴韦林组按上述剂量
灌胃给药，模型组灌胃等量的蒸馏水，每天 2 次，连续 6 d。于第
3 d给药后，除对照组外，各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以 5LD50浓
度的 PR8 滴鼻感染，每只 0． 05 ml。第 7 天称取小鼠体重后解剖，
摘取全肺称重，计算肺指数值及抑制率。
2． 4 统计处理 实验所得计量数据均用 珋x ± s 表示，采用 SPSS
13． 0统计软件进行 t检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3． 1 天山堇菜提取物体外抗流感病毒作用 结果见表 1。
表 1 天山堇菜提取物对流感病毒致细胞病变的影响
组别
TC50 /
μg·ml － 1
A /济防 /15 /90
IC50 /μg·ml － 1 SI
A /PR /8 /34
IC50 /μg·ml － 1 SI
天山堇菜 258． 69 32． 90 7． 86 28． 75 9． 00
达菲 1260 0． 27 4666． 7 26． 11 48． 26
利巴韦林 1164 2． 87 405． 57 26． 11 44． 58
TC50:药物半数有毒浓度;IC50:药物对病毒半数抑制浓度;SI:选择指数，SI =
TC50 / IC50
由上表可看出，天山堇菜提取物对流感病毒 A/济防 /15 /90
的 IC50平均为 32． 90 g·ml
－1，SI为 7． 86，对 A/PR /8 /34 的 IC50平
均为 28． 75 g·ml －1，SI为 9． 00。说明天山堇菜提取物在体外对
流感病毒 A/济防 /15 /90，A/PR /8 /34 有一定的抑制作用，阳性对
照药达菲与利巴韦林抗流感病毒作用的结果与本实验室以往的
结果一致，实验系统成立，实验结果可信。
3． 2 天山堇菜提取物体内抗流感病毒作用
3． 2． 1 对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用 结果见表 2。
表 2 对小鼠流感病毒性肺炎模型的保护作用(珋x ± s)
组别
剂量 /
mg·kg － 1
死亡数
死亡率
(%)
死亡保护率
(%)
平均存活天数
/d
生命延长率
(%)
模型 11 91． 7 － 7． 83 ± 2． 25 －
利巴韦林 60 1 8． 3 90． 9 13． 83 ± 0． 39* 76． 5
天山堇菜 250 8 66． 7 27． 3 9． 17 ± 3． 61 17． 9
提取物 500 5 41． 7 54． 5 11． 00 ± 3． 74＊＊ 38． 5
与模型组比较，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01;n =12
结果，由上表可以看出天山堇菜提取物 500 mg·kg －1可明显
延长流感病毒性肺炎小鼠的平均存活天数(P ＜ 0． 05) ，其死亡保
护率与生命延长率分别为 54． 5%、38． 5%，说明天山堇菜对小鼠
流感病毒性肺炎模型具有一定的保护作用。
3． 2． 2 对小鼠流感病毒性肺炎模型肺指数的影响 结果见表 3。
表 3 对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的抑制作用(珋x ± s)
组别 剂量 /mg·kg －1动物数 /只 肺指数 抑制率(%)
对照 － 12 0． 72 ± 0． 02 －
模型 － 12 1． 73 ± 0． 03＊＊ －
利巴韦林 60 12 1． 05 ± 0． 07## 39． 3
天山堇菜 250 12 1． 48 ± 0． 06## 14． 5
提取物 500 12 1． 24 ± 0． 06## 28． 3
与对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01;与模型组比较，#P ＜ 0． 05 ，##P ＜ 0． 01;n
= 10
结果，由上表可以看出模型组肺炎小鼠肺指数显著高于对照
组，阳性对照药利巴韦林可显著降低流感病毒性肺炎小鼠的肺指
数，说明模型是成功的，实验系统成立;与模型组比较，天山堇菜
提取物 250，500 mg·kg －1均可明显降低流感病毒性肺炎小鼠的
肺指数(P ＜ 0． 01) ，对小鼠流感病毒性肺炎模型具有一定的保护
作用。
4 讨论
流行性感冒病毒属正粘科 RNA 病毒，引起流行性感冒呈周
期性大流行，严重威胁人类健康。因为流感病毒不断变异、主要
用于流感治疗的西药对新出现的变异株敏感性降低以及缺乏用
药安全性，使得化学药物难以发挥作用。流感至今仍是人类不能
有效控制的世界性传染病，因此，尽快研制新型抗流感病毒药物
已成为当务之急。中草药为我国的传统医学瑰宝，是抗流感的传
统药物。天山堇菜为维吾尔医防治流感的常用传统药材，但对其
抗流感病毒的作用及其机制缺乏系统性的研究，本文通过体外细
胞模型以及体内流感病毒性肺炎小鼠模型的研究发现，天山堇菜
提取物在体外对甲型流感病毒 A/济防 /15 /90、A/PR /8 /34 具有
一定的抑制作用，在体内实验中，能显著降低流感病毒性肺炎小
鼠的肺指数，显著性增加其平均存活天数，对流感病毒性肺炎小
鼠具有明显的保护作用。说明天山堇菜具有一定的抗流感病毒
作用，在防治流感方面可能有良好的开发前景。本文的研究为今
后对其抗流感病毒作用的有效部位及成分、以及作用机理的进一
步研究奠定了一定的基础。
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