全 文 ：　作者简介:惠伯棣 ,男 ,教授 ,博士 ,硕士生导师　　Tel:(010)62004587
万寿菊花中叶黄素及其酯体外淬灭单线态氧能力的比较
惠伯棣1 ,裴凌鹏2 ,李京3 ,张艳3(1.北京联合大学应用文理学院 , 北京 100083;2.中国中医科学院 , 北京 100700;3.首都师范大学生命
科学院 ,北京 100037)
摘要:目的　比较万寿菊花中叶黄素及其酯体外淬灭单线态氧能力。方法　反相高效液相色谱(RP-HPLC)从万寿菊的花中制
备叶黄素单体及酯两个组分。应用微弱发光检测技术测定和比较两者在体外淬灭单线态氧的能力。结果　叶黄素单体和酯
均具有体外淬灭单线态氧的能力 ,最小有效剂量分别为>0.1 g·L-1和>0.01 g·L-1。结论　在研发以抗氧化功能为机制的药
品时 ,应认真考虑应用叶黄素酯的可能性。
关键词:叶黄素;叶黄素酯;淬灭;单线态氧
中图分类号:R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2006)18-1385-03
Comparison of Ability to Quench Singlet-Oxygen by Lutein and Its Esters from Marigold Flower in vitro
HUI Bo-di1 ,PEI Ling-peng2 ,LI Jing3 ,ZHANG Yan3(1.College of Applied Arts and Science , Beijing Union University , Beijing 100083 ,
China;2.China Academy of Traditional Chinese Medicine , Beijing 100700 , China;3.College of Life Science , Capital Normal University , Beijing
100037 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To compare the ability to quench singlet-oxygen of lutein and its esters from marigold flower in vitro.METH-
ODS　Two fractions , free compound and esters of lutein were prepared by HPLC from the flower of marigold.The singlet-oxygen quenching a-
bility by the fractions was determined with ultra weak luminescence analysis consequently.RESULTS　All of the fractions , esters and free
compound , extinguished singlet-oxygen in vitro , with the minimum amount of 0.01 g·L-1 and >0.1 g·L-1 , respectively.CONCLUSION　
Those observations suggest that the application of esters , but not free compound , in pharmaceutical products with anti-oxidation function should
be considered.
KEY WORDS:lutein;lutein ester;quenching;singlet-oxygen
　　叶黄素(lutein)是一种含羟基的类胡萝卜素 ,习称
叶黄素或黄体素。叶黄素分子的 C40链含多个共轭双
键结构 ,在理论上可以存在多个几何异构体。研究表
明 ,叶黄素对人眼视网膜黄斑有明显的保护作用 ,可防
止黄斑衰退症 ,并具有淬灭体内自由基 、调节人体免疫
等功能。这些功能均被认为与叶黄素的淬灭自由基能
力有关[ 1-3] 。因此 ,研究叶黄素淬灭自由基的能力及机
制对了解其多种防治功能有重要的意义。
万寿菊(Tagetes erecta L.)是菊科(Composite)万
寿菊属(Tateges L.)的植物。万寿菊花含有丰富的
类胡萝卜素化合物 ,主要为叶黄素 、玉米黄素 、β-胡
萝卜素等。叶黄素在万寿菊花中主要以酯的形式存
在 ,其中大部分为全反式异构体 。在从万寿菊的花
中制备叶黄素单体时 ,首先须将叶黄素酯萃取出来 ,
然后通过水解(皂化)反应得到单体 。在以叶黄素的
药用功能为基础 ,用万寿菊花做原料研发药用产品
时 ,首先面临的选择是使用酯还是单体的问题 。因
此 ,比较酯和单体的生物学功能和效价具有十分重
要的意义。
本项研究中 ,首先使用反相高效液相色谱获得
了叶黄素酯和单体组分 ,随后用化学发光检测技术
比较了它们在体外淬灭单线态氧的能力 ,并指出了
它们在体外有效淬灭单线态氧的最小作用量。
1　材料与方法
1.1　叶黄素酯和单体的制备和鉴定
取一定量的万寿菊干花颗粒于研钵中加入 2 ～
4倍体积的正己烷研磨 4 ～ 6遍 ,收集 、合并上清液。
上清液中含有大量的叶黄素酯。使用真空旋转干燥
仪 ,在 45 ℃, -0.08 MPa , 60 ～ 90 r·min-1条件下浓
缩萃取液至原体积的 1/4。将浓缩物置于三角瓶
中 ,加入等量 10%的氢氧化钾-乙醇溶液 ,搅拌过夜
(>12 h),进行酯的皂化[ 4] 。皂化完全后 ,用乙醚和
2%的氯化钠水溶液在分液漏斗中将皂化产物萃取
到乙醚相中 ,得到叶黄素单体组分。
使用 HPLC分离皂化前 、后样品中的相关组分。
根据其色谱行为和光谱特征对各组分进行鉴定 。收
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集叶黄素酯 、叶黄素反式及顺式异构体组分。收集
后的组分避光 、氮气吹干 ,用甲醇溶解后 ,在分光光
度计上进行浓度测定 。样品中叶黄素类化合物(包
括酯和单体)的浓度可根据式(1)计算得到:
x=(A×y)/(A1%1 cm ×100) (1)
其中:x=样品中所含的叶黄素类化合物质量
(g);y =样品溶液的体积(mL);A =样品的吸光度
值;A1%1 cm=吸光系数 。在此 ,采用值为 2 200。
调整叶黄素酯和单体的含量 ,分别配成不同质
量浓度的溶液。每个组分计有 4种不同质量浓度的
溶液 ,为:0.1 ,0.01 ,0.001及 0.000 1 g·L-1 。
1.2　体外淬灭单线态氧功能的比较
用次氯酸钠氧化过氧化氢可产生单线态氧[ 见
反应式(2)] 。该反应所产生的光子可以被微弱发光
分析仪计数 。当淬灭剂存在时 ,该反应所释放的光
子数量下降[ 4] 。该反应在本项研究中被用来检验和
比较不同组分淬灭单线态氧的能力 。
NaClO+H2O2※NaCl+H2O+O2 (2)
在本项研究中 ,首先比较了 400 , 425 , 440 , 460 ,
490 ,535 ,555 ,575 , 620 , 640及 705 nm 滤光片的光子
计数值 ,以选择最佳灵敏度的滤光片。
在进行测量时 ,首先用14C源校正仪器至 30 000
光子计数值 。样品的测量条件为:采集间隔 1 s ,收
集时间100 s。在测量样品时 ,在测量杯中顺次加入
2 mL 次氯酸钠溶液 、1mL 甲醇 ,0.2 mL样品溶液 ,混
匀后将测量杯放入测量池中 ,开始测量。在开始光
子计数程序后 10 s ,注入 30%双氧水 0.6 mL启动反
应。完成计数后 ,保存数据。空白对照样品为甲醇 。
由于该反应的稳定性不易控制 ,为确保实验结果的
准确性 ,每个样品重复测量6次 ,取平均值计算结果。
2　结果与讨论
2.1　滤光片的选择
根据报道 ,在对NaClO 和 H2O2反应所释放的光
子进行计数时 ,可以使用 634 ,705及 1 268 nm等滤光
片[ 4-5] 。由于在本项研究中所使用的光子计数器(BP-
CL-4型)在 700 nm以上的计数灵敏度明显衰减 ,所
以进行不同滤光片的光子计数值比较时所选择的最
长波长滤光片为 705 nm。通过不同滤光片 NaClO和
H2O2反应的光子计数值比较 ,640 nm的滤光片灵敏度
最高。因此 ,在测量样品时选用了该滤光片。
2.2　叶黄素酯和单体组分的制备及鉴定
未皂化样品中的叶黄素酯为一组极性略有不同
的混合物 ,极性较弱 ,在反相色谱过程中 ,保留时间较
长 ,经皂化可形成叶黄素单体。单体的极性远较酯
强 ,因此 ,保留时间较短。HPLC 条件:色谱柱:Dia-
monsilTM(4.6 mm×25 cm ,5 μm);流动相A:乙腈-水=
9∶1;流动相 B:乙酸乙酯;线性梯度洗脱:B 在 25 min
内由 0增加至 100%:流速:1mL·min-1;检测波长:450
nm;波长范围:250 ～ 550 nm;进样量:25μL。万寿菊花
萃取物皂化前后色谱图的比较见图 1。未皂化的样
品在 20 min后有一组峰出现 ,在皂化后的样品色谱图
上不再出现这组峰 ,而在10 min处有一主峰出现 。保
留时间为20 min后和 10 min两个组分的电子吸收光
谱图比较见图 2。根据其色谱行为和光谱特征 ,未皂
化样品中保留时间在 20 min之后的组分被鉴定为叶
黄素酯的混合物:皂化样品中保留时间为 10 min的组
分被鉴定为叶黄素单体的全反式异构体。在 HPLC
上收集叶黄素酯 、全反式叶黄素单体组分。
图 1　万寿菊花萃取物皂化前后色谱图比较
Ⅰ -反式叶黄素;Ⅱ-叶黄素酯;—-皂化前;┈-皂化后
Fig 1　HPLC chromatogram of extracts before and after saponifica-
tion from marigold flower
Ⅰ -all E-lutein;Ⅱ-lutein easters;—-before saponification;┈-after saponification
图 2　叶黄素酯和反式叶黄素单体的电子吸收光谱图比较
1-酯;2-全反式单体
Fig 2　Electronic absorption spectra of esters and all E-isomer
1-ester;2-isomer
在自然界中 ,叶黄素经常与玉米黄素同时存在
于生命体中。在万寿菊花的萃取物中也含有一定数
量的玉米黄素 。两者在分子结构上非常相似 ,属同
分异构体 ,在反相 C18柱上分离不开 。图 2组分Ⅰ中
估计含有 3%～ 5%的玉米黄素[ 6] 。叶黄素与玉米
黄素均具有抗氧化功能 。
2.3　淬灭单线态氧能力的比较
用 BPCL 微弱发光检测仪分别测量梯度浓度叶
黄素酯及叶黄素单体淬灭次氯酸钠-双氧水体系产
生的单线态氧 ,并比较两者有效淬灭单线态氧的最
·1386· Chin Pharm J , 2006 September , Vol.41 No.18 　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2006年 9月第 41卷第 18期
　
小作用剂量。与对照比较 ,从 HPLC 收集的叶黄素
酯组分及叶黄素单体组分均具有淬灭单线态氧作
用 ,且随着组分浓度的增加淬灭单线态氧能力也增
加 ,结果见图 3 , 4。叶黄素酯和单体体外有效淬灭
单线态氧最小作用剂量比较见图 5。从图 5可以观
察到 ,两者有效淬灭单线态氧的最小作用剂量分别
为:酯:0.01 g·L-1;单体:>0.1 g·L-1 。
图 3　叶黄素酯淬灭 NaClO-H2O2体系中单线态氧的能力
1-对照组;2-0.000 1 g·L-1;3-0.001 g·L-1;4-0.01 g·L-1;5-0.1 g·L-1;
6-1 g·L-1
Fig 3　Photon count of NaClO and H2O2 reaction with esters as free
radical quencher
1-control;2-0.000 1 g·L-1;3-0.001 g·L-1;4-0.01 g·L-1;5-0.1 g·L-1;
6-1 g·L-1
图 4　叶黄素单体淬灭 NaClO-H2O2体系中单线态氧的能力
1-对照组;2-0.000 1 g·L-1;3-0.001 g·L-1;4-0.01 g·L-1;5-0.1 g·L-1;
6-1 g·L-1
Fig 4　Photon count of NaClO and H2O2 reaction with all E-isomer
as free radical quencher
1-control;2-0.000 1 g·L-1;3-0.001 g·L-1;4-0.01 g·L-1;5-0.1 g·L-1;
6-1 g·L-1
图 5　叶黄素酯和单体体外有效淬灭单线态氧最小作用剂
量比较
1-单体;2-酯
Fig 5　Comparison of minimum dosage between ester and free com-
pound of lutein
1-monomer;2-ester
3　结　论
在本项研究中 ,应用微弱发光检测方法比较了
万寿菊花中叶黄素单体及酯两个组分在体外淬灭单
线态氧的能力 。结果表明 ,叶黄素单体和酯均有体
外淬灭单线态氧的能力 ,最小有效剂量分别为>0.1
和 0.01 g·L-1 。如果从量效关系上来看 ,酯优于单
体 。因此 ,在研发具有抗氧化功能的药品时 ,应认真
考虑应用叶黄素酯的可能性 。
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(收稿日期:2005-04-07)
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