全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2009, 25(4):894～ 899
万寿菊花超临界萃取物的抗氧化活性
李大婧 1, 2 , 　吴海虹1, 3 , 　宋江峰 1, 3 , 　刘春泉1, 3 , 　刘春菊 1, 3 , 　李志强1, 3
(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所 , 江苏 南京 210014;2.东北林业大学林学院 , 黑龙江 哈尔滨 150040;3.国家农
业科技华东(江苏)创新中心农产品加工工程技术研究中心 ,江苏 南京 210014)
收稿日期:2009-02-09
基金项目:江苏省科技攻关项目(BE2006319);江苏省博士后科研资
助计划项目(0602033B)
作者简介:李大婧(1976-),女,黑龙江肇东人 ,博士 , 副教授 ,主要从
事天然产物方面的研究。 (E-mail)lidajing@ 163.com
通讯作者:刘春泉 , (E-mail)liuchunquan2009@ 163.com
　　摘要:　采用超临界 CO2萃取技术辅以乙醇为夹带剂 , 制备万寿菊花超临界萃取物(SupercriticalCO2extractsof
marigoldflower, SEMF)。从抗脂质过氧化能力 、还原能力及对羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O-2·)的清
除能力方面 , 综合考察 SEMF的体外抗氧化活性。结果表明:SEMF对脂质过氧化有较强的抑制能力 , 并具有较强
的还原能力 , 其清除·OH和 O-2·的 EC50分别为 0.000 83 mg/ml、 0.000 74 mg/ml(以叶黄素计)。 SEMF在这些体
系中均表现出较强的抗氧化能力 ,表明 SEMF是一种优良的天然抗氧化剂和自由基清除剂。
关键词:　万寿菊;超临界萃取;叶黄素;抗氧化活性
中图分类号:　S682.1+101　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2009)04-0894-06
AntioxidantActivityofSupercriticalCO2 ExtractsfromMarigoldFlower
LIDa-jing1, 2 , WUHai-hong1, 3 , 　SONGJiang-feng1, 3 , 　LIUChun-quan1, 3 , 　LIUChun-ju1, 3 , 　LIZhi-qiang1, 3
(1.InstituteofFarmProductsProcesing, JiangsuAcademyofAgriculturalSciences, Nanjing210014, China; 2.ColegeofForestry, NortheastForestryU-
niversity, Haerbin150040, China;3.EngineeringResearchCenterforAgriculturalProductsProcesing, NationalAgriculturalScienceandTechnologyInno-
vationCenterinEasternChina, Nanjing210014, China)
　　Abstract:　TheextractsfrommarigoldflowerwereobtainedbysupercriticalCO2 extractionwithethanolmodifier.Its
antioxidantactivitieswereevaluatedbyantilipidperoxidation, reducingpower, aswelashydroxylradical(·OH)andsu-
peroxideionradical(O-2·)scavenging.ThesupercriticalCO2extractsfrommarigoldflowerexhibitedstrongantioxidantac-
tivitiestoperoxidationandreducingpower.EC50 expressedbythesupercriticalCO2 extractsreflectingscavengingefects
on·OHandO-2· were0.000 83 mg/ml, 0.000 74 mg/ml, respectively(caculatedinluteincontent).Theoverallresults
suggestedthatthesupercriticalCO
2
extractswouldbeanexcellentnaturalantioxidantandfreeradicalscavenger.
Keywords:　TageteserectaL.;supercriticalCO2 extract;lutein;antioxidantactivity
　　万寿菊 (TageteserectaL.)为菊科万寿菊属植
物 ,花瓣中叶黄素含量较高 ,已成为当前工业生产叶
黄素的良好原料 。叶黄素是含紫罗酮环的二羟基类
胡萝卜素 ,具有较强的抗氧化性能 ,它能吸收对视网
膜有损害作用的蓝光 ,在老年性黄斑退化病和白内
障疾病防治方面具有重要作用。作者曾就万寿菊花
中叶黄素的新型提取分离方法及分析方法等做过深
入研究[ 1-3] 。另有研究曾报道叶黄素具有清除自由
基及抑制脂质过氧化的能力 [ 4-7] ;廖萍泰等指出叶
黄素具有淬灭单线态氧的能力 [ 8] 。而体外试验中
有关富含叶黄素的万寿菊花超临界萃取物(Super-
criticalextractofmarigoldflower, SEMF)抗氧化活性
则未见报道 ,其清除超氧阴离子自由基(O-2 ·)、羟
基自由基(·OH)、过氧化自由基(ROO·)的能力至
今未知。
有关抗氧化物质的活性检测方法主要分为 2
894
种:一种是测定目标体系中过氧化物的形成 ,抗氧化
剂通过阻断产生过氧化物的自由基链式反应发挥抗
氧化作用 ,体系中过氧化物的量越少 ,抗氧化剂的活
性就越强;另一种是测定自由基的清除率 ,抗氧化剂
通过对形成的自由基供氢或供电子以达到清除自由
基的目的。本研究以万寿菊干花颗粒为原料 ,采用
超临界流体技术制备得到 SEMF,探讨其在猪油 、亚
油酸体系中阻断 ROO·的能力 ,清除体外 O-2·、·OH
的能力及还原能力 ,旨在为万寿菊花的深加工及新
型抗氧化产品开发提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料 、仪器与试剂
万寿菊(TageteserectaL.)干花颗粒 ,购于云南
曲靖博浩生物科技有限公司。主要仪器:HA221-40-
11超临界流体萃取装置(南通华安超临界萃取有限
公司);LGJ-12真空冷冻干燥机(北京松源华兴科
技发展有限公司);FS-180万能粉碎机(江苏黎明制
药机械有限公司);722S型分光光度计(上海棱光技
术有限公司);RE52CS旋转蒸发仪(上海亚荣仪器
厂);101A-2数显电热鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科
学仪器有限公司);LD4-2离心机(北京医用离心机
厂);国产 JD-3型光照度计 (上海市嘉定学联仪表
厂);超氧阴离子清除试验自制反应箱。试剂:CO2
气体 ,食品级 , 99%(南京兰叶气体有限公司);抗氧
化剂 BHT,食品级;猪油 ,猪板油湿法熬制并经过滤
后使用(市售);正己烷 、石油醚 、无水硫酸钠 、甲苯 、
氢氧化钾 、甲醇 、氯仿 、冰乙酸 、碘化钾 、硫代硫酸钠 、
淀粉 、丙酮 、无水乙醇 、盐酸 、氢氧化钠 、维生素 E、磷
酸氢二钠 、硫酸二氢钠 、硫氰酸铵 、氯化亚铁 、铁氰化
钾 、三氯乙酸 、三氯化铁 、邻二氮菲 、硫酸亚铁 、H2
O2、蛋氨酸(MET)、氯化硝基四唑氮蓝(NBT)和维
生素 B2等 ,均为分析纯或生化试剂 。
1.2　试验方法
1.2.1　SEMF的制备　工艺流程:万寿菊干花颗粒
※粉碎※过 20目筛※超临界 CO2萃取※萃取物浓
缩 ,并用氮气吹干 。试验中选取万寿菊花颗粒 1 000
g,粉碎粒度为 20目 。超临界 CO2萃取条件为:萃取
压力 30MPa,萃取温度 55℃, CO2流量 60L/h,夹带
剂用量为原料量的 20%,动态运行 4 h,从分离釜 Ι
中得萃取物 ,静置 、过滤浓缩后得 SEMF95 g,采用
AOAC法 [ 9]测定叶黄素含量为 9%。SEMF经皂化 、
干燥 、结晶制得叶黄素晶体 [ 10] ,采用 AOAC法[ 9]测
定叶黄素含量为95%,作为试验对照品 。
1.2.2　SEMF抗氧化活性测定
1.2.2.1　Schaal烘箱法试验　取 125ml广口瓶 ,每
只加入 100 g猪油。除空白外 ,分 2组添加抗氧化
剂 ,第 1组以猪油重的 0.02%分别加入 BHT, VE、
SEMF(添加量以叶黄素计 ,以下同);第 2组分别以
猪油重的 0.01%、0.02%、0.04%添加 SEMF。以上
试验样品 ,待抗氧化剂充分溶解后放入 60 ℃烘箱
中 ,按照 GB5009.37— 85的标准方法 ,每隔 4d取样
测定猪油在放置过程中的过氧化值 (POV值)[ 11] 。
每个样品重复 3次 。
1.2.2.2　亚油酸体系测定方法　取 2 ml不同浓度
SEMF和抗氧化剂丙酮溶液 ,分别置于 10 ml的具塞
试管中 ,加入 2ml2.51%的亚油酸无水乙醇溶液 、
4ml0.05 mol/L、 pH7.0的磷酸盐缓冲液和 2 ml
蒸馏水 ,超声波混匀 ,密闭后放在暗处并置于 40 ℃
恒温水浴锅中 。空白不加抗氧化剂 ,其余处理同上。
取0.1ml这种混合溶液 ,加入 9.7 ml75%的乙醇和
0.1 ml30%的硫氰酸铵 ,再加入0.1ml0.02 mol/L
溶解于 3.5%盐酸中的氯化亚铁 ,混匀 。准确反应 5
min后 ,在 500nm测定吸光值。以后每隔 24h测定
1次[ 12] 。每个样品重复 3次。
1.2.2.3　还原能力的测定　在 10 ml试管中分别
加入不同浓度 SEMF和抗氧化剂丙酮溶液 1 ml、磷
酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L, pH6.6)2.5ml和 1%铁
氰化钾 5 ml,混匀 ,置于 50 ℃水浴中保温 20 min
后 ,加入 10% 的三氯乙酸 5 ml, 摇匀。在 4 000
r/min下离心 10 min,取上清液 2.5 ml,加入 2.5 ml
蒸馏水和 0.5ml0.1%的三氯化铁溶液 ,静止 10
min后在 700 nm处进行比色 。用蒸馏水代替样品
作空白 。反应物的吸光值增加表明还原能力增
强[ 13] 。每个样品重复 3次 。
1.2.2.4　羟基自由基的清除试验　参照金鸣等[ 14]
的方法 ,取 1ml0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶
液于试管中 ,依次加入 2ml150mmol/L磷酸盐缓冲
溶液(PBS, pH7.40)和 1 ml蒸馏水 ,充分混匀后 ,
加入 1ml0.75mmol/L硫酸亚铁溶液 ,混匀后 ,加入
1ml0.01%双氧水 (H2 O2 ),于 37 ℃水浴 60 min
后 ,在 536 nm测其吸光值 ,所测得的数据为损伤管
的吸光值 A(损)。未损伤管以 1ml蒸馏水代替损伤
管中 1 ml0.01%的双氧水(H2O2),操作方法同损
895李大婧等:万寿菊花超临界萃取物的抗氧化活性
伤管 ,可测得 536nm未损伤管的吸光值 A(未)。样
品管以 1ml样品代替损伤管中的 1ml蒸馏水 ,操作
方法同损伤管 ,可测得 536 nm样品管的吸光值 A
(样)。每个样品重复 3次。清除率计算公式如下:
清除率 =[ A(样)-A(损)] /[ A(未)-A(损)] ×
100%。以样品浓度对超氧阴离子清除率作图并进
行方程拟合 ,求得·OH清除率为 50%所需抗氧化剂
的量 ,即 EC50。
1.2.2.5　超氧阴离子自由基的清除试验 　参照
Beauchamp等[ 15]的方法并加以改进。反应在反应
箱中进行。反应箱中装有 1支 10 W的节能日光
灯 ,箱的四周衬有铝箔 ,调节反应物离灯的距离 ,用
光照度计测定 ,使其受光强度为 4 000 lx。在 5 ml
反应液中 ,使核黄素浓度为 3×10-6 mol/L,甲硫氨
酸浓度为 1 ×10-2 mol/L, NBT浓度为 1.0 ×10-4
mol/L,以不照光的试液作校正 。 25 ℃下光照 20
min,光化反应产生 O-2·。在 560nm处测得其吸光值
为 A,表示 O-2·的含量。加入不同浓度 SEMF和抗氧
化剂丙酮溶液 ,清除 O-2·,抑制 NBT的还原 ,测得吸
光值为 A1 ,以 A-A1表示 O-2·减少量 。每个样品重复
3次 。以样品浓度对超氧阴离子清除率作图并进行
方程拟合 ,求得 O-2·清除率为 50%所需叶黄素类抗
氧化剂的量 ,即 EC50。清除率计算公式如下:清除
率 =(A-A1)/A×100%
2　结 果
2.1　SEMF抗脂质过氧化作用(Schaal烘箱法)
Schaal烘箱法是最经典和最常用的测定油脂氧
化稳定性的方法 。SEMF与抗氧化剂 BHT、VE在猪
油中的抗氧化活性比较见图 1,不同浓度 SEMF抗
氧化活性比较见图 2。
　　从图 1可以看出 ,不加任何抗氧化剂的对照组
过氧化值增加很快 ,说明有大量的过氧化物形成 ,而
SEMF、VE和 BHT在浓度为 0.02%时 ,都能明显抑
制这种过氧化物的形成从而抑制猪油的氧化 ,表现
出抗氧化性 。它们的过氧化值都明显低于对照 ,其
中 , SEMF的过氧化抑制能力接近 BHT,明显高于
VE。从图 1还可以看出 ,猪油 60 ℃放置 13 d后自
动氧化增强 ,在以后的 20 d中 SEMF和 BHT都能较
好地抑制其氧化 ,测得的过氧化值增幅不大 ,呈平稳
状态 ,而添加 VE组猪油过氧化值增加较快 , 说明
SEMF在猪油中的抗氧化性强于 VE。
从图 2可以看出 ,与对照组比较 , SEMF浓度分
别为 0.01%、0.02%、 0.04%时在猪油中的抗氧化
活性变化不大 ,说明 SEMF抗氧化活性并不随着其
浓度增加而增加 ,在猪油中浓度为 0.01%时 , SEMF
就能起到很好的抗氧化作用 。同时 ,随着放置时间
的延长 , SEMF呈平稳状态 ,说明其抗氧化稳定性也
较好 。
测定温度为 60℃;抗氧化剂浓度为猪油重的 0.02%。
图 1　SEMF与其他抗氧化剂不同放置时间过氧化值的比较(猪
油)
Fig.1　PeroxidevaluesoflardtreatedwithSEMFandotheran-
tioxidantsfordiferenttime
图 2　不同浓度 SEMF不同放置时间过氧化值的比较(猪油)
Fig.2　Peroxidevaluesoflardtreatedwithdifferentconcentra-
tionsofSEMFforsometime
2.2　SEMF抗脂质过氧化作用(亚油酸法)
亚油酸体系法是一种评价抗氧化剂抑制脂质过
氧化能力的方法。吸光值高表示形成了高浓度的过
氧化物。从图 3中可以得到与 Schaal烘箱法相似的
结论:不加任何抗氧化剂的对照组的吸光值增加很
快 ,说明有大量的过氧化物形成 , 而 SEMF、VE和
BHT则能明显抑制这种过氧化物的形成 ,它们的吸
光值都明显低于对照 , SEMF与 BHT的过氧化抑制
能力几乎相同 ,都明显高于 VE。
896 江 苏 农 业 学 报 　2009年 第 25 卷 第 4期
通过与 对 照组 比较 , SEMF浓 度分 别为
0.01mg/ml、 0.05 mg/ml、 0.10 mg/ml、 0.20 mg/ml
时 ,都能抑制过氧化物的生成 , 浓度大于 0.05
mg/ml时抑制能力尤强 ,在 0.05 ～ 0.20 mg/ml的浓
度范围内吸光值趋于平稳 ,且吸光值不随浓度增加
而降低 ,说明 SEMF浓度大于 0.05 mg/ml就能起到
很好的抗氧化作用 ,随着放置时间的延长 ,抗氧化稳
定性也较好(图 4)。
图 3　SEMF与其他抗氧化剂不同放置时间的吸光值(亚油酸
法)
Fig.3　AbsorbanceofSEMFandotherantioxidantsplacedfor
diferenttimebylinoleicacidmethod
图 4　不同浓度 SEMF不同放置时间的吸光值(亚油酸法)
Fig.4　AbsorbanceofdifferentconcentrationsSEMFplacedfor
differenttimebylinoleicacidmethod
2.3　SEMF的还原能力
研究表明 ,抗氧化剂的还原能力与其抗氧化性
之间存在联系 ,还原能力越强 ,抗氧化性越强 [ 16] 。
因此 ,可以通过测定还原能力来说明抗氧化活性的
大小。图 5显示:0.10 mg/mlBHT的吸光值为
0.462, 0.10 mg/mlVE的吸光值为 0.027, 0.10
mg/ml的吸光值为 0.206, 0.01 mg/mlSEMF的吸光
值为 0.197;SEMF的还原能力高于 VE, 0.01 mg/ml
SEMF的还原能力与 0.10mg/ml叶黄素的还原能力
相差不大 ,说明 SEMF具有较强的抗氧化作用。图
6显示:SEMF的还原能力在 0.005 ～ 0.040mg/ml的
范围内 ,还原能力随着浓度的增加而呈线性增加 ,表
现出较强的抗氧化性。
图 5　SEMF与其他抗氧化剂的吸光值
Fig.5　AbsorbanceofSEMFandotherantioxidants
图 6　不同浓度 SEMF的吸光值 A
Fig.6　AbsorbanceofdiferentconcentrationsSEMF
2.4　SEMF对羟基自由基的清除能力
SEMF和其他抗氧化剂清除羟基自由基的试验
结果见图 7,不同浓度 SEMF对羟基自由基的清除
作用见图 8。
图 7显示:几种抗氧化剂清除·OH的能力不
同 , 0.01 mg/mlBHT的清除率为 40.04%, 0.01
mg/mlVE的清除率为 40.48%, 0.01 mg/ml叶黄素
的清除率为 38.68%, 0.001 mg/mlSEMF的清除率
为 52.43%,说明含有叶黄素的 SEMF清除·OH的
能力很强 。图 8显示:SEMF在 0.000 1 ～ 0.002 0
mg/ml,对·OH的清除能力随浓度增加而增加 ,相关
系数达 0.05显著水平 , 清除率达 50%的浓度
(EC50)为 0.000 83mg/ml(以叶黄素计)。 EC50值越
小 ,表明其对·OH清除能力越强 ,反之则越弱。
2.5　SEMF对超氧阴离子自由基的清除能力
SEMF与抗氧化剂 BHT、VE清除超氧阴离子自
897李大婧等:万寿菊花超临界萃取物的抗氧化活性
图 7　SEMF对羟基自由基的清除率比较
Fig.7　ScavengingratesofhydroxylradicalbySEMFandother
antioxidants
图 8　不同浓度 SEMF对羟基自由基的清除率
Fig.8　Scavengingrateofhydroxylradicalbydifferentconcen-
trationsofSEMF
由基的试验结果见图 9。 SEMF对超氧阴离子自由
基的清除作用见图 10。
图 9　SEMF对超氧阴离子自由基的清除率比较
Fig.9　ScavengingrateofsuperoxideionradicalbySEMFand
otherantioxidants
　　图 9显示:几种抗氧化剂清除 O-2·的能力不同 ,
0.100 mg/mlBHT的清除率为 59.19%, 0.100
mg/mlVE的清除率为 50.74%, 0.100 mg/ml叶黄素
的清除率为 75.72%, 0.005 mg/mlSEMF的清除率
为 84.27%,说明富含叶黄素的 SEMF清除 O-2 ·的
能力很强。图 10显示:SEMF在 0 ～ 0.005 mg/ml,对
O-2·的清除能力随浓度增加而增加 , 相关系数达
0.01显著水平 , 清除率达 50%的浓度 (EC50 )为
0.000 74 mg/ml(以叶黄素计)。 EC50值越小 ,表明
其对 O-2·清除能力越强 ,反之则越弱。
图 10　不同浓度 SEMF对超氧阴离子自由基的清除率
Fig.10　Scavengingrateofsuperoxideionradicalbydifferent
concentrationsofSEMF
3　讨 论
抗氧化性研究基于自由基理论 ,如果自由基产
生过多或清除过慢 ,则可通过攻击生命大分子物质
及各种细胞器 ,造成机体在分子水平 、细胞水平及组
织器官水平 的各种损伤 , 加速机体的 老化。
O-2·、·OH、ROO·是 3种具有代表性的自由基 。此
外 ,单一的抗氧化评价方法往往很难全面体现其生
物学意义 ,需要多种方法相互补充 [ 17] 。因此 ,本研
究选取两类抗氧化剂的活性检测方法 ,一类测定猪
油 、亚油酸中过氧化物(ROO·)的形成 ,另一类是测
定·OH(铁氧化邻二氮菲法)、O-2 ·(氯化硝基四唑
氮蓝法)的清除率。
本试验通过采用不同的检测方法评价 SEMF的
抗氧化活性 。在抑制脂质过氧化试验中 , SEMF对
猪油和亚油酸均表现出良好的抗氧化特性 ,可能是
其含有的叶黄素与 ROO·加成后形成叶黄素加合自
由基(ROO-Lutein),从而阻断自由基引发的链式反
应;在清除羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基
(O-2 ·)试验中 , SEMF均具有较强的清除能力 , EC50
分别为 0.083mg/100 ml、 0.074mg/100ml(以叶黄
素计);在还原能力和清除自由基试验中 , SEMF的
抗氧化能力呈明显的剂量效应关系。 SEMF在这些
体系中均表现出较强的抗氧化能力 ,表明 SEMF是
一种优良的天然抗氧化剂和自由基清除剂 ,这为万
寿菊花的深加工及天然功能性食品添加剂的研究与
开发奠定了理论基础。但由于 SEMF中的成分较为
复杂 ,可能含有其他生物活性物质 ,它们在抗氧化活
898 江 苏 农 业 学 报 　2009年 第 25 卷 第 4期
性表现中所占的比例及它们与叶黄素之间的协同作
用等均有待进一步研究。
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