全 文 ：第 9 1卷
9 9 14年
第 4期
8月
湖 南 医 科 大 学学报
U L L BE T I NOH F U A N NM E D IC A LU N IVR E ST Y I
Vo l
.
9 1 No
.
4
A u. g9 9 14
板兰根 、 喜树果抗 H FR SV和 H SV一 2
作用的实验研究
病毒研究室 李闻文 施 凯
提要 将 肾综合征 出血 热病毒 (H FR S v)和单纯疙疹病毒 I型 (H V S一 2 )分 另,!吸附于 v e r o 一。 细
胞和 B G M 细胞 , 并分别 加入 不 同浓度板 兰根针 荆和喜树煎荆 。 培养后前者用 问接免疫 关光检浏 病
毒杭原 , 关光反应 阴性 ; 后者 笠显徽镜下 观察细胞 病变 , 发现细胞 生长正常 。 撤药后 继续培养并按
原法检测 , 结果 均为阴性 。 说明两 药物均有 杀病毒作用 。
关键词 板兰根 ; 喜树果 ’ ; 出血热病毒 , 流行性 ; 人单纯疤疹病毒 ; 细胞株 ;
B G M 细胞 ; ’ ; V E R O 细 胞 ; 免疫关光技米
肾综 合 征 出 血 热病 毒 ( h e m o r r h a g i e
f e v e r w i t h r e n a l s y n d r o m e v i r u s
,
H F R S V )在
我国广泛流行 , 流行地区有扩大和 向城郊区
发展趋势 , 其发病率和病死率均高 。 目前国
内外尚无防治的特效药物 , 但中药方剂抗病
毒有一定疗效 〔 , , 2〕 。 单纯疙疹病毒 I 型 ( h e r -
p e s s im p l e x v i r u s
一
2
,
H S V
一
2 ) 在人群中感染
较为普遍 , 孕妇生殖器感染可引起早产 、 流
产 、 死胚 、 畸形以及智力低下等 , 并与子宫
颈癌的发 生密切相关 。 国外抗 H S V 植物药
的实验研究始于六十年代〔 3· ` , , 国内亦于六十
年代开始则以组织培养技术的研究为主 〔5 〕 。
近 50 种 中草药 的抗 H S V 研 究 亦 有 报
道 “ 一 “ , 。 喜树果等有抗 H SV 一 1作用 〔 7〕 , 但单
味中草药板兰根 、 喜树果分别抗 H F R S v 和
H SV 一 2 的实验研究尚未见报道 。 本试验还
设计撤药方案 , 进一步证实药物仅仅是抑制
病毒生长还是杀灭病毒 , 以期为中草药抗病
毒的临床应用提供实验依据 。
材料与方法
1
.
1 材并 l( ) 药物与试剂 : 板兰根针剂由山西省
万荣制药厂生产 . 喜树果煎剂自制 , 即从喜树上摘取
成熟果子 , 供干去外壳 , 109 加蒸馏水至 1 4 o m l , 隔
水加热煎煮 , 浓缩至 10 m l , 以 0 . 5 7 k g c/ m Z 持续
3 o m in 高 压蒸气灭菌备用 、 羊抗人荧光抗体购 自北
京生物制品厂 。 ( 2) 病毒 : H F R S V 系本实验室分离
株 , H S V 一 2 由安徽医科大学微生物教研究室赠送 。
( 3) 细胞 : V er 。 一 E 。 细胞由北京病毒研究所赠送 ,
B G M 细胞由海南省卫生防疫站提供 。
1
.
2 方法 将 V er o 一 E 6 细胞 、 B G M 细胞培养成单
层 。 营养液用含 15 %小牛血清的最低需要量培养基
(M in im
a l E s s e n t i a l M
e d i u m
,
M E M )
, 维持液含 5 %
小 牛血清的 M E M 。 首先分别作板兰根对 v e or 一 E 6
细胞 , 喜树果对 B G M 细胞毒力试验 , 即正常细胞培
养对不同浓度药物的耐受能力测试 。 ( 1) H E R s v 间
接免疫荧光测定 : 用 10 0 个 50 %的组织细胞感染量
( T i s s u e C e l l I n f e e t io n M
e
d i
a n
l无 s e T C I D s 。 ) 的
H F R Sv 于 3 7 ℃吸附于 V e r o 一 E ` 细胞培养管 1 . s h ,
分别加入含 l : 1 0 0 、 l : 1 0 0 0 、 - : 一0 0 0 0 不同浓度板
兰根维持液 、 同时 , ①加入 1 : 10 0 浓度的病毒哇 , 作
为药物对照 。 ②不加药物作空白对照 。 ③不感染病毒
19 9斗 l卜 1 2 收摘
3 0 9
作为条件对照即 正常细胞讨照 。 共培养 7天 , 每天在
显微镜下观察细胞生长情况 。 然后用 V e r s e n e 消化
细胞 , 滴片培养 , 冷丙酮固定 , 加标准抗出血热病毒
血清 , 3 7 C 吸附 hl , 洗涤 3 次 , 再加荧光素标记的
羊抗人抗体于 37 C孵育 3 o m in , 洗涤 3 次 . 在荧光显
微镜下观察 。 如果细胞浆内有针尖样荧光为阳性 , 否
则为阴性 。 若试验组荧光阴性 , 则余下一半试管用 不
含板兰根的常规 M E M 继续培养观察 7 天 , 再次作
荧光检测 。 ( 2) 喜树果对 H S V 一 2 试验 : 把含有不同
浓度喜树果维持液加在 已感染的 H S V 一 2 的 B G M 细
胞培养管内 , 同样作各种对 照 。逐 日在光学显微镜下
连续观察 4 天 , 如果有病毒生长繁殖 , 则 出现细胞病
变效应 ( C y t o p a t h i。 e f f e e t , C P E ) 即细胞肿胀 、 变圆 、
细胞融合 、 部分细胞脱落 。 若病变检测阴性 , 则用不
含药物的维持液继续培养 , 继续观察 4 天 〔” 。 上述试
验撤出药物后若仍无病毒生长繁殖 二 即可说明该病
毒已被杀灭而非抑制作用 。
2 结 果
.2 1 板 兰根对 H F R S V 的作 用 结果见附表 。
附表 不同浓度的板兰根对 H E R S V 的作用
板兰根浓度观测项 目
l
:
1 0 0 1
:
1 0 0 0 l
:
1 0 0 0 0
药物对照 空白对照 条件对照 板兰根对照
( 1。一 ’病毒哇 )( 仅感染病毒 ) (仅药宿主细胞) (仅板兰根 )
宿 主细胞状 态
免疫荧光检测
第一次
第二次
正 常 正常 正常 正常 正常 正常 正常
阴性
阴性
阳性
阳性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阴性
阴性
从药物毒力试验得知 , 正 常细胞不能耐受 1 : 10 板
兰根 。 如附表所示 , 条件对照和板兰根对照 , 细胞生
长正常 , 前后 两次间接免疫荧光检测均阴性 。 空白对
照即病毒对照 , 细胞生长正 常 , 两次荧光均阳性 。 不
同浓度板兰根试验中细胞生长正常 。 1 : 1 0 根兰根
试验第一次荧光阴性 , 撤除药物后继续培养仍为阴
性 , 而 1 : 10 0 0 , 1 : 1 0 0 0 0 板兰根两次荧光均为阳
性 。 结 果表 明板兰根对 H F R S V 是杀灭作用 而非抑
制作用 , 1 : 1 0 0 浓度的板兰根有效 , 而 1 : 1 0 0 0 以
下浓度板兰根则无作用 。
2
.
2 喜树果 对 H S V 一 2 的 作 用 正常 B G M 细胞
能耐受 z : 1 0 0 浓度喜树果 。 l : 1 0 0 、 l : 1 0 0 0 喜树
果在前 4 天培养感染了 H SV 一 2 的细胞培养中 , 逐
日光镜下观察 , 无 C P E 出现 , 即无病毒生长繁殖 。 在
撤除上述药物 4 天 后 , 仍无病毒生长繁殖 , 而 1 :
1 0 0 0。 喜树果在病毒感染中产生 C P E , 即不能控制
病毒的生长繁殖 . B G M 正常细胞对 照 , 1 , 10 0 、 :1
1 0 0 。喜树 果对照 , 细胞 生 长正常 。 H S V 一 2 阳性对
照 , 即在光学 显微镜下产 生 C P E , 其病变特点为细
胞肿胀 、 变圆 、 细胞融合 , 部分脱落 , 大约 4 天后
全部脱落 。 结果表明 : 1 : 1 0 0 。 以内喜树果对 H S v 一
2 有杀灭作用 而非抑制作用 , 1 : 1 0 0 0 0 喜树果浓度
则无效 , 重复试验结果一致 。
3 讨 论
目前对 H F R S V 的形态结构 、 分子生物
学及其疫苗的研制国内外 已有广泛深入的研
3 1 0
究 , 临床诊断方面亦有突破性进展 。 病毒哇
在体外对出血热病毒有杀灭作用 , 临床亦有
一定疗效 。 由于出血热病毒分离成功较迟 , 中
草药抗 H F R S V 的研究起步较晚 。 目前中草
药特别是单 味 中草药抗病毒的研究报道少
见 , 尚无杀灭 H F R SV 的特异性药物 , 临床上
对病毒性疾患主要以对症支持疗法 。 因而寻
找有效的中草药治疗 H F R S V 感染是一行之
有效的简易途径 〔2 , 。 业 已证实板兰根有清热
解毒 、 广谱抗病毒 、 抗细菌作用 。 本试验表
明板兰根对 H F R SV 有杀灭作用 。 作者认为 ,
板兰根分布广泛 , 来源丰富 。 若能精制加工
提取有效成份 , 减少副毒作用 , 或与其它中
草药的有效成分或化学药物合用 , 则可加强
其抗病毒作 , 力图制成静脉注射剂 , 发挥其
强而快抗病毒效应 , 此方面有待进一步深入
研究 。 碘昔 、 阿糖腺昔 , 无环鸟昔等核昔类
药物 已用于 H S V 一 2 的临床治疗 , 但多有毒性
反应 “ “ · ” ’ 。 喜树果系琪科植物喜树 ( C a m p -
t o t h e e a a e u m i n a t a ) 的果实 , 也是 目前临床应
用的抗肿瘤药物之一 , 它的主要成分是喜树
碱 。 本试验表明 , 它有杀灭 H S V 一 2 的作用 , 近
年来研究发现 H S V 一 2 与宫颈癌发生有密切
关系 。若能将喜树果的有效成份应用于临床 ,
湖南医科大学学报 1 99 4 ; 1 9 ( 4 )
对控制 H S v 一 2 感染 , 减低子宫颈癌的发病率
具有重要意义 。 以往研究中草药抗病毒几乎
都是一次性用药 。 不能区分药物是杀灭病毒
还是抑制病毒 。 在用药一定时间 , 未发现病
毒生长繁殖时 , 撤除药物 , 根据有无病毒重
新生长繁殖 , 可进一步判别药物的杀病毒作
用或抑制病毒作用 , 这在研究中草药或其他
药物抗病毒作用方法上属一改进 。 本研究结
果为 中草药抗病毒的 临床应用提 供实验 依
据 。
参 考 文 献
1
. 乔治渠 . 流行性出血热中 医研究概况 . 中 国医 药学
报 , 1 9 8 8 ; 3 ( 3 ) : 5 2
2
. 吴成 . 清热解毒法治疗流行性出血热探讨 . 甘肃中
医 , 1 9 8 8 ; ( l ) : 1 9
3
.
H e r r m a n n E C
.
A n t i v i r a l S b u s t a n e e s i n p l a n t s o f t h e
m i n t fa m i ly ( la b i a t a e ) N o n t a n n i a p o l y P h e n o l o f m e li s
-
s a o f f i e i n a l i s
.
P r o e oS
e E x P B i o l M
e d
, ] 9 6 7 ; 12 4
:
8 6 9
一 8 7 4
4
.
F u r u s a w a E
.
A e r i v l r y o f
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e o l u m b i a S K a n d L C M
v i r u s i n f e e t i o n i n m i e e
.
P r o e
E x P B i o l M e d
,
1 96 8 ; 1 2 8
: 1 19 6
5
. 郑 民实 . 我 国使用组织培养技术在病毒学与立克次 氏
体学方面的成就 . 生物学动态 . 1 9 6 6 ; ( 3) : l
6
. 中医研究院中药研究所病毒组 . 中草药对呼吸道致 细
胞病变作用 的影响 . 新医药学杂志 , 19 7 3 ; ( 1 ) : 26
7
. 陈祖基 , 宋洁贞 , 张勇 . 中草药抗单纯应诊病毒的实验
研究 . 中医杂志 , 19 8 0 ; 2 1 ( 2 ) : 15 3
8
. 郑 民实 . 47 2 种中草药抗单纯疤疹病毒 的实验研究 .
中西 医结合杂志 , 1 9 9 0 ; 9 ( 1 ) : 3 9
9
. 李闻文 , 施凯 . 喜树果粗提液体外抗单纯疙疹病毒 l
型试验 . 湖南 医学 , 19 9 3 ; 1 0 ( 2 ) : 7 4
1 0
. 郑 民实 . 施仲贤 , 陈瑞琪 , 等 . 中草药在组织培养 内
的抗病毒实验研究 . 药学道报 , 19 81 ; 16 (7 ) : 3 8
1 1
. 王志玉 , 韩世杰 . 异丙肌昔 、 环胞昔对 H S V 的抑制
作用 . 山东医学院报 , 1 9 8 5 ; 2 3 ( 4 ) : 2 6
E X P E R IM E N T A L S T U D I E S O N T H E V I R I C I D
E F F E C T S O F R A D I X I S A T I D I S
A N D C A M P T O T H E C I N E A G A I N S T H F R S V A N D H S V 一 2
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H e m o r r h a g ie f e v e r w i t h r e n a l s y n d r o m e v i r u s ( H F R S V ) a n d h e r p e s s im p l e x v i r u s t y p e 11
( H SV
一
2 ) w e r e in o c u l a t e d r e s p e e t i v e l y w i t h V e r o
一
E
6 e e l l s a n d B G M e e l l s
.
T h e n R a d i x i
s a r i d i s
( i n je e t i o n ) a n d C a m P t o t h e e i n e ( d e e o e t io n o f m e d i e i n a l h e r b s ) w e r e e o 一 e u l t u r e d w i t h
H F R S V a n d H S V
一
2 f o r 7 a n d 4 d a y s r e s p e e t i v e l y
.
W i t h i n d i r e e t im m u n o f l u o r e s e e n t t e e h n l ( a u e
i n s p e e t i o n H F R S V w a s n e g a t iv e
.
U n d e r m i e r o s e o p e n o n e y t o p a t h i e e f f e e t o f H S V
一
2 w a s o b
-
s e r v e d
.
If b o t h H F R S V a n d H S V
一
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一 ’
R a d i x i s a t id is h a d v x r i e id a l e f f e e t a g a i n s t H F R S V r a t h e r t h a n i n h ib i t e d
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板兰根 ,喜树果抗 H F R S V 和 H S V 一 2 的研究 李闻文等 3 1 1