全 文 ：山东科学
SHANDONG SCIENCE
第 26 卷 第 6 期 2013 年 12 月出版
Vol． 26 No． 6 Dec． 2013
收稿日期:2013-09-28
基金项目:国家科技重大专项(2010ZX09401-302-5-12);山东省科技发展计划项目(2008GG2NS02022)
作者简介:李佳(1972 －)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药资源与质量控制。
* 通讯作者，张永清，男，教授，研究方向为中药资源与质量控制。
DOI:10． 3976 / j． issn． 1002 － 4026． 2013． 06． 006 * 中药与天然活性产物专栏*
甜地丁总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究
李佳，刘红燕，刘谦，张永清*
( 山东中医药大学，山东 济南 250355)
摘要:为研究甜地丁总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性，本文利用 L9( 34 ) 正交试验，探讨了提取条件对总黄酮提取量的
影响，并采用 Fenton体系和邻苯三酚自氧化法评价了该提取物的体外抗氧化能力，采用多元线性回归对总黄酮与抗氧化
活性相关性进行了分析。结果显示最佳提取条件为 20倍量 75%乙醇，提取 4次，提取时间为 30 min，此条件下的黄酮得
率为 3． 423% ;甜地丁总黄酮对·OH和 O2 －·清除能力与浓度呈较明显的量效关系，且抗氧化作用与总黄酮量之间正相
关。甜地丁总黄酮具有较强的抗氧化能力，是一种天然有效的抗氧化剂。
关键词:甜地丁;总黄酮;抗氧化;相关性
中图分类号:Ｒ961 文献标识码:A 文章编号:1002-4026(2013)06-0024-04
Optimal extraction and antioxidative activity
of total flavonoids from Herba Gueldenstaedtiae
LI Jia，LIU Hong-yan，LIU Qian，ZHANG Yong-qing *
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)
Abstract ∶ We addressed the impact of extraction conditions on the extraction amount of total flavonoids with L9(34)
orthogonal test． We also evaluated its antioxidative activity by Fenton system and pyrogallol autooxidation method． We
further analyzed the correlation between total flavonoids and antioxidative activity with multiple linear regression． Ｒesults
show that the optimal extraction conditions are 75% ethanol (solid and liquid ratio of 1:20)，4 times extraction and
extraction time of 30 min． Its optimal extraction rate is 3． 423%． Obvious dose-effect relationship is shown between
concentration and its clearance capability to ·OH and O2-·． Positive correlation is also exhibited between antioxidative
activity and total flavonoids amount． Total flavonoids from Herba Gueldenstaedtiae have stronger antioxidative activity and
are effective natural antioxidants．
Key words∶ Herba Gueldenstaedtiae;total flavonoids;antioxidative activity;correlation
甜地丁为我国民间传统药材，来源于豆科植物米口袋(G． verna(Geogri)A． Bor．)的干燥全草［1］，具有清
热解毒、凉血消肿的功能，临床用于治疗疔疮、痈疽及一切化脓性炎症，主要含有黄酮、萜、挥发油、甾醇及有
机酸等成分［2］。药理研究［3 － 4］表明，甜地丁黄酮具有抗氧化活性。黄海兰等［4］对甜地丁乙酸乙酯提取物清
除自由基活性成分进行了追踪，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷、芹菜素和 4，7-二羟基黄酮 3 种黄酮类成分，发现
第 6 期 李 佳，等:甜地丁总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究
其清除自由基活性的大小主要取决于酚羟基的数目，抗氧化活性顺序为槲皮素-3-O-葡萄糖苷 ＞芹菜素 ＞
4，7-二羟基黄酮，进一步阐明了其抗氧化活性能力与其特殊结构有关。但关于其提取工艺及与抗氧化活性
相关性分析未见报道。为此，本文对甜地丁黄酮提取工艺及清除羟自由基、超氧阴离子自由基的抗氧化活性
进行了研究，以期为该味药材黄酮类成分的药理活性研究及天然食品抗氧化剂的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验材料
米口袋(G． verna(Geogri)A． Bor．)采自山东长清，晒干后粉碎，过 60 目筛，备用。
1． 1． 2 试剂
芦丁标准品(济南市药检所提供)，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma 公司，批号:S43654-357)，试
剂均为分析纯;蒸馏水(自制)。
1． 1． 3 仪器
721 型紫外-可见分光光度计;FA1104 型电子天平(上海天平仪器厂);HH-S4 双孔四列电热恒温水浴锅
(北京科伟永鑫仪器厂) ;101-(1)A数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 甜地丁总黄酮的提取工艺
粉碎后的干燥甜地丁→加石油醚→索氏提取除脂→抽滤得滤渣→乙醇回流提取总黄酮→浓缩滤液→
75%乙醇溶液定容。
1． 2． 2 标准曲线绘制
精密称取 60 ℃干燥至恒重的芦丁对照品 5． 10 mg，置 50 mL量瓶中，用 80%乙醇溶解稀释并定容至刻
度。精密量取 0、1、2、3、4、5、6、7 mL分别置于 10 mL容量瓶中，加 0． 72 mol /L的 NaNO2溶液 0． 3 mL，摇匀，
放置 6 min;加入0． 47 mol /L的 Al(NO3)3溶液 0． 3 mL，振摇，放置 6 min;再加入 1 mol /L的 NaOH 溶液 2 mL，
振摇并加水至刻度，放置 15 min。全波长扫描发现 510 nm处有最大吸收峰，在 510 nm处测吸光度，得回归
方程:A = 0． 0106C － 0． 0003(r = 0． 9993，n = 7)，表明对照品在 10． 20 ～ 71． 40 μg /mL范围内呈良好线性。
1． 2． 3 正交试验分析
在单因素实验研究的基础上，利用正交试验，进一步优化提取工艺，条件如表 1 所示。
表 1 正交试验提取工艺的因素水平表
Table1 Factor levels of the extraction technology of orthogonal array design
因素水平 A 乙醇浓度 /% B 液料比 /(mL /g) C提取时间 /min D提取次数
1 55 20:1 30 2
2 75 30:1 45 3
3 85 40:1 60 4
1． 2． 4 总黄酮含量测定
样品各精密称取 5 份，每份约 0． 5 g，按最佳提取工艺制备样品供试液，含量测定按 1． 2． 2 方法进行，计
算总黄酮含量。
1． 2． 5 总黄酮体外抗氧化活性研究
采用 Fenton体系和邻苯三酚自氧化法，对最佳条件下提取的总黄酮体进行外抗氧化性测定。
1． 2． 5． 1 甜地丁总黄酮对·OH清除实验
Fenton反应体系是用来产生羟自由基(·OH)最常用的体系［5］，而·OH 清除率是反映物质抗氧化作用
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山 东 科 学 2013 年
的重要指标。实验方法参照文献［6］。
1． 2． 5． 2 清除超氧阴离子自由基( O2 －·) 的活性
参照文献［7］采用邻苯三酚自氧化法在 299 nm处测定样品对 O2 －·的清除能力，计算清除率。
1． 2． 6 甜地丁总黄酮与抗氧化活性相关性分析
以羟自由基清除率(X1)、超氧阴离子自由基清除率(X2)为横坐标，甜地丁总黄酮量(Y)为纵坐标，采用
SPSS16． 0 对实验结果进行线性回归考察。
2 结果与分析
2． 1 正交试验结果分析
由实验结果可知乙醇浓度和提取次数对总黄酮提取率有显著影响，影响程度依次为 A ＞ D ＞ C ＞ B。考
虑到实际情况，确定最佳提取工艺为 A2D3B1C1，即 20 倍量 75%乙醇，提取 4 次，提取时间为 30 min。在此条
件下的总黄酮得率为 3． 423%，ＲSD = 0． 16%(n = 3)。
表 2 正交试验及结果分析
Table 2 Orthogonal experiment and its result analysis
实验号 A B C D
提取率 /%
提取率 1 提取率 2 提取率 3
1 1 1 1 1 3． 33 3． 31 3． 33
2 1 2 2 2 3． 65 3． 77 3． 78
3 1 3 3 3 3． 65 3． 54 3． 66
4 2 1 2 3 3． 54 3． 74 3． 73
5 2 2 3 1 3． 51 2． 53 3． 50
6 2 3 1 2 3． 61 3． 63 3． 64
7 3 1 3 2 2． 69 2． 69 2． 69
8 3 2 1 3 2． 22 3． 21 3． 25
9 3 3 2 1 2． 67 2． 66 2． 64
Ⅰ j 32． 02 29． 05 29． 53 28． 48
Ⅱ j 32． 43 30． 42 30． 18 30． 15
Ⅲ j 24． 72 29． 70 29． 46 30． 54
Ｒ 7． 30 0． 65 1． 72 3． 06
图 1 总黄酮对·OH和 O2 －·的清除作用
Fig． 1 Scavenging effects of total flavonoids to ·OH and O2 －·
2． 2 体外抗氧化活性研究
甜地丁总黄酮对·OH和 O2 －·的清除能力随
浓度的增大而增大，在浓度为 45． 6 μg /mL时达到
最大值，表明甜地丁总黄酮对·OH 和 O2 －·清除
能力与浓度呈较明显的量效关系(图 1)。
2． 3 甜地丁总黄酮与抗氧化活性相关性分析
把总黄酮量(Y)作为因变量，X1、X2 作为自变
量带入回归方程进行全回归。总体参数如下:相关
系数为 0． 944，决定系数为 0． 890，反映了总体回归
效果较好;方差显著性检验结果显示 F = 12． 183，
P ＜0． 05，回归标准残差正态 P-P图(图 2)显示自变
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第 6 期 李 佳，等:甜地丁总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究
表 3 回归系数及显著性检验表
Table 3 Ｒegression coefficient and significance analysis table
拟合系数
非标准化系数
B 标准误差
标准系数 t检验数值 统计显著性
回归系数 95%置信区间
下限 上限
常数 － 18． 626 16． 070 － 1． 159 0． 330 － 69． 771 32． 513
X1 2． 314 1． 665 0． 726 1． 281 0． 290 － 3． 167 7． 434
X2 0． 514 1． 276 0． 228 0． 403 0． 714 － 3． 546 4． 574
图 2 回归标准残差正态 P-P图
Fig． 2 Normal plot of regression standard residuals
量(Xn)与因变量(Y)服从正态分布，证明甜地丁总黄酮含量与
抗氧化活性之间存在显著的线性关系。进而对其进行多元线
性回归分析，得到回归系数分析表(表 3)。由表 3 得拟合方程:
Y = － 18． 626 + 2． 314X1 + 0． 514X2，标准化后，拟合方程:
Y = － 18． 626 + 0． 726X1 + 0． 228X2。
4 讨论
黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，具有抗衰老、增强
机体免疫力等多种生理活性，且具有高效、低毒的优点，是近年
来众多学者研究的热点。其抗氧化作用机制主要与其特殊结
构有关，可以通过与金属离子发生相互作用而具有抗氧化活
性［8］，还可通过酚羟基与自由基进行抽氢反应生成稳定的半醌
自由基，中断链式反应［9 － 10］而具有抗氧化活性。
本实验采用正交试验设计，对甜地丁中总黄酮的提取工艺进行了优化，并对其体外抗氧化活性进行了评
价，结果表明，甜地丁总黄酮具有良好的清除·OH和 O2 －·的能力，表现出良好的体外抗氧化活性。由于甜
地丁来源丰富，且属于无毒无副作用的天然产物，故将其作为抗氧化剂开发将会具有广阔的前景。
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