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石参提取物诱导 MKN 45 细胞凋亡的
初步研究
刘鸿儒，王玉堂，刘学波*
( 西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100)
摘 要:通过石参提取物作用于人胃癌 MKN－45 细胞，检测其对细胞活性的影响并探讨其作用机制。利用 MTT 法检
测石参提取物对细胞活性的影响;采用 AO /EB双荧光染色检测石参提取物对细胞形态的影响; 使用 JC－1 荧光探针检
测线粒体膜电位变化;利用 Western blot检测石参提取物对细胞凋亡内源性通路的信号蛋白表达。结果表明浓度为
20、30mg /mL的石参提取物能够抑制 MKN－45 细胞的活性，使细胞形态发生改变; 10、20、30mg /mL的石参提取物可引
起细胞线粒体膜电位下降，并引起 Bcl－2 的表达量下降，Bax、细胞色素 c 和 caspase－3 的表达量增加，PAＲP 被剪切。
提示石参提取物可通过线粒体途径诱导 MKN－45 细胞凋亡。
关键词:石参，MKN－45 细胞，凋亡，线粒体途径
Preliminary study on apoptosis of MKN－45 cells induced by
extracts from Eremurus chinensis Fedtsch.roots
LIU Hong－ru，WANG Yu－tang，LIU Xue－bo*
( College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China)
Abstract: The impact of extracts from Eremurus chinensis Fedtsch.roots( ECFE) on MKN－45 cells and mechanisms
were discussed.Cell viability was determined by the MTT assay.Morphologic changes was evaluated by AO /EB.
Mitochondrial membrane potential of cells was detected via JC－1.Western blot was used to analyse signal proteins in
the intrinsic pathway of apoptosis.ECFE reduced the MKN－45 cells viability at higher concentrations( 20，30mg /mL) ，
and the alteration of cells was changed.Meanwhile，mitochondrial membrane potential of cells was declined when
cells were treated with 10～30mg /mL ECFE.As such，the expression of Bcl－2 was reduced while Bax，cytochrome c
and caspase－3 were all increased.PAＲP was cut.ECFE inhibit viability of MKN－45 cells，and induce apoptosis
through mitochondrial pathway.
Key words: Eremurus chinensis Fedtsch.; MKN－45 cells; apoptosis; mitochondrial pathway
中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2014)17－0343－04
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2014． 17． 068
收稿日期:2014－01－09 * 通讯联系人
作者简介:刘鸿儒( 1989－ ) ，女，在读硕士，研究方向:营养与功能食品
因子。
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金( 2452013QN060) 。
胃癌的发病率和死亡率居全世界恶性肿瘤的前
列［1］，在我国同样居高不下，且死亡率仍有上升趋
势［2－3］，严重威胁着人类的生命健康。现今胃癌的治
疗仍以手术为主，但术后的复发率较高，而在辅助化
疗中常见接触药物之后产生的耐药性［4－5］，也是术后
存活率不高的原因之一［6］。一些食品中的天然活性
成分毒副作用小，具有预防和治疗的双重功效，已成
为近年来的研究热点之一。
癌症发生的本质是癌细胞增殖与凋亡的失衡。
因此抑制癌细胞增殖与诱导癌细胞凋亡已成为防治
恶性肿瘤的主要手段之一［7］。各种天然食品的提取
物中含有大量的生物活性物质，对恶性肿瘤具有一
定程度的抑制作用［8－10］。这些提取物可通过肿瘤细
胞内不同的通路诱导细胞调亡，具有防癌和抑制肿
瘤的潜质。
石参又名石蒜苔、崖参，是百合科独尾草属
(Eremurus chinensis Fedtsch.)［11］的根。石参作为一种
山野菜，味道甘甜，营养丰富，曾被列为贡品，有“崖
参上皇宴”的美谈［12］。石参中除了富含蛋白质、脂类
和矿质元素等之外，还含有功能性多糖、酚类和黄酮
类化合物、甾体以及蒽醌类化合物等多种活性成
分［13－15］。已有的研究表明石参提取物具有很强的抗
氧化活性，抑制自由基损伤生物大分子，且可以诱导
肝癌细胞的凋亡［16－17］。在新疆少数民族地区有用独
尾草根焙干磨粉冲服用于治疗消化道顽疾的习
惯［18］，但其作用机理还尚不明确。本研究拟通过利
用石参的提取物诱导人胃癌细胞 MKN－45 凋亡，探
344
讨其对胃癌细胞的作用及相关作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
石参 购于陕西汉中略阳;人胃癌 MKN－45 细
胞 中科院上海细胞库;DMEM 培养基、胎牛血
清 美国Hyclone公司;抗生素(青霉素 /链霉素)、胰
蛋白酶、吖啶橙 /溴化乙锭(acridine orange /ethidium
bromide，AO /EB) 江苏碧云天公司;噻唑兰(3－(4，
5－ Dimethylthiazol － 2 － yl)－ 2，5 － diphenyltetrazolium
bromide，MTT) 美国 Amresco 公司;JC － 1 荧光探
针 美国Thermo公司;Anti－Bax Antibody、Anti－Bcl－2
Antibody、Anti － cytochrome c Antibody、Anti － Cleaved
Caspase－3 Antibody、Anti－α－ tubulin Antibody、Anti－
PAＲP Antibody、标记二抗 美国 Santa Cruz 公司;
PVDF膜、ECL 发光液 美国 Millipore 公司;磷酸盐
缓冲液(phosphate buffered saline，PBS) 实验室
配制。
680 酶标仪、165 － 8001 垂直电泳槽、ChemiDoc
XＲS凝胶成像系统 美国 Bio－Ｒad 公司;QYC110 台
式恒温振荡器 上海福玛公司;微量移液枪、5417Ｒ
高速冷冻离心机 德国 Eppendorf 公司;BCN－1360B
生物洁净工作台 北京东联电子技术开发公司;
3110 型细胞培养箱 美国 Thermo Scientific 公司;
LX71 倒置荧光显微镜 日本奥林巴斯株氏会社。
1.2 实验方法
1.2.1 石参提取物制备 将石参烘干粉碎，用 60%
(V /V)乙醇超声波(超声功率 500W)提取 2h，使用
相同条件重复提取残渣，合并提取液旋转蒸发，冷冻
干燥后得到石参提取物［17］。
1.2.2 人胃癌 MKN－ 45 细胞的培养 将人胃癌
MKN－45细胞置于含 10% 胎牛血清、1% 双抗的
DMEM高糖培养基中，在 37℃、5% CO2 的培养箱中
培养，长满 80% ～90%时传代，选取对数生长期的细
胞用于实验。
1.2.3 MTT法测定石参提取物对 MKN－45 细胞的毒
性作用 将 MKN－45 细胞接种到 96 孔板中，每孔
100μL细胞液，种板密度为 3 × 104 个 /孔，于 37℃、
5% CO2 培养箱中培养。24h后弃去培养基并用 PBS
清洗，然后加入含有不同浓度石参提取物(0、10、20、
30mg /mL)的无血清培养基(0mg /mL 为对照组)，每
孔 100μL，每组 10 复孔(其中 4 复孔为空白，不加入
MTT)，继续培养。24h后弃去培养基并用 PBS 清洗，
每组 6 孔加入 100μL 含 MTT(0.5mg /mL)的无血清
培养基，培养 4h 后弃去培养基，每孔加入 100μL
DMSO，充分溶解。用酶标仪测量各孔在 490nm 的光
密度(OD值)。按公式(1)计算细胞相对存活率:细
胞相对存活率(%)=(处理组 OD 值－处理组空白
OD值)/(对照组 OD 值－对照组空白 OD 值)× 100
(1)
1.2.4 石参提取物对 MKN－45 细胞形态学的影响
AO能够穿过细胞膜完整的细胞，嵌入核 DNA 发出
明亮绿色荧光。EB 仅能穿过细胞膜受损的细胞，嵌
入核 DNA发出橘红色荧光，凋亡的细胞橘红色荧光
增强增多。将 MKN－45 细胞接种于 6 孔板(密度为
1.5 × 105 /孔)，37℃、5% CO2 培养箱中培养 24h 后，
经不同浓度石参提取物(0、10、20、30mg /mL)处理
24h，弃去原培养基后用 PBS 清洗，每孔加入 60μL
AO /EB(AO ∶ EB = 1 ∶ 1)，置于荧光显微镜下观察
拍照。
1.2.5 线粒体膜电位测定 前期培养过程与 1.2.3 相
同，在用含不同浓度石参提取物 (0、10、20、
30mg /mL)的无血清培养基培养细胞 24h 后，弃去原
培养基并用 PBS 清洗，加入 100μL JC － 1 工作液，
37℃继续培养 1.5h，弃去 JC－1 并用 PBS 清洗 2 遍，
换入新 PBS，在激发光波长 485nm，发射光波长 585、
538nm下，测定荧光强度。若 OD585 /OD538比值与对照
组相比降低，表明线粒体膜电位下降。
1.2.6 Western blot 蛋白检测 将对数生长期的
MKN－45 细胞接种于 60mm × 10mm 培养皿中，于
37℃、5% CO2 培养箱中培养。当细胞长满 80%时，
弃去培养基，每皿加入含不同浓度石参提取物(0、
10、20、30mg /mL)的无血清培养基处理。24h 后终止
培养，弃去原培养基，用 PBS 清洗 3 遍后吸干溶液，
向各培养皿中分别加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制
剂和氟化钠)100μL，10min 后刮取细胞碎片，冷冻离
心(4℃，15000r /min)10min，取上清液测蛋白浓度
(BCA法)，对样品进行不同程度稀释，使各样品浓度
一致。向各样品中加入蛋白电泳上样缓冲液，95℃
加热 5min，冷却混匀。
取 15μL各蛋白样品(3mg /mL)经 10%的 SDS－
PAGE进行分离，电泳条件:S1，80V，10min;S2，120v，
2h。然后将蛋白转印至 PVDF 膜上，用 5%脱脂乳室
温封闭 2h，用 1 × TBST 缓冲液清洗。将膜放入一抗
(1∶1000，V /V)，4℃孵育过夜。以 1 × TBST 缓冲液
清洗，加二抗(1 ∶1000，V /V)孵育 2.5h 后，1 × TBST
缓冲液清洗。最后使用 ECL 发光液荧光显色，
ChemiDox凝胶成像系统成像。
1.3 数据分析
实验数据用 Microsoft Excel 2003 处理，SPSS16.0
软件进行统计学分析，显著水平 p 设定为 0.05
(p ＜ 0.05)。
2 结果与分析
2.1 石参提取物抑制 MKN－45 细胞活性作用的
测定
图 1 显示，石参提取物处理 24h 后，低浓度
(10mg /mL)对 MKN－45 细胞活力无影响，而较高浓
度石参提取物(20、30mg /mL)可显著降低细胞活力，
细胞存活率分别为 49.12%和 52.81%，30mg /mL 处
理组的细胞活力稍高，但经统计学分析后表明二者
无显著性差异。
2.2 石参提取物诱导 MKN－45 细胞发生形态学
变化
如图 2 所示，对照组细胞呈绿色梭状，10mg /mL
石参提取物处理组与对照组相比细胞固缩变圆，20、
30mg /mL石参提取物处理组与对照组相比，细胞变
圆膨大，呈橘色、红色细胞数量增加，细胞发生凋亡
345
甚至死亡。
图 1 石参提取物抑制 MKN－45 细胞活性的作用
Fig.1 Inhibition effect of ECFE
on MKN－45 cells viability
注:采用 Duncan多重比较，不同的上标字母 a、b、c表示
差异显著(p ＜ 0.05)，图 3、图 4 同。
图 2 石参提取物对 MKN－45 细胞形态学的影响(× 200)
Fig.2 The effect of ECFE on morphology alteration
of MKN－45 cells(× 200)
注:A.对照，B.10mg /mL，C.20mg /mL，D.30mg /mL。
2.3 石参提取物降低 MKN－45 细胞线粒体膜电势
(ΔΨ)
线粒体膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆
事件［19］。由图 3 可知，10mg /mL 的石参提取物处理
组与对照组相比，即可显著地降低 MKN－45 细胞的
线粒体膜电位，而 20、30mg /mL的石参提取物更为明
显地引发细胞线粒体膜电位的降低。对照组与处理
组的 OD585 /OD538比值分别为 7.90、1.70、0.40、0.40。
图 3 石参提取物对 MKN－45 细胞线粒体膜电势的影响
Fig.3 The effect of ECFE on mitochondrial
membrane potential of MKN－45 cells
2.4 石参提取物通过线粒体途径诱导 MKN－45 细
胞凋亡
与对照组相比，10、20、30mg /mL 石参提取物可抑
制抗凋亡蛋白 Bcl－2 的表达，促进促凋亡蛋白 Bax 的
表达(图 4A)，进而引起线粒体膜的通透性的改变，细
胞色素 c 释放到胞浆中，caspase－3 蛋白被激活，将
PAＲP剪切为不同分子量的片段(图 4B)。其中
Bcl－2 /Bax的比值依次为 4.83、1.04、0.48、0.21(图 4C)。
图 4 石参提取物通过内源性通路诱导 MKN－45 细胞凋亡
Fig.4 MKN－45 cells apoptosis via
endogenous pathway induced by ECFE
3 结论与讨论
采用天然来源的抗癌成分诱导癌细胞凋亡已成
为防治癌症的重要措施之一。已证明在膳食中充足
的新鲜果蔬的摄入与胃癌的发病率呈显著的负相关
性［20］，其中发挥作用的主要有多糖类、黄酮类化合
物、醌类物质和生物碱等，在本实验中，石参提取物
富含多糖、酚类和黄酮类等功能性物质。另外，前期
研究揭示，石参提取物具有抗氧化活性，可清除自由
基，保护生物大分子［17］。因此，推测石参具有开发为
抗氧化及预防肿瘤的功能食品的潜力。
线粒体参与了细胞包括凋亡在内的多种死亡模
式［21］，是细胞凋亡的调控中心［22－23］。Bcl－2 家族在细
胞凋亡中起“主开关”的作用，而 Bcl－2 家族主要的
作用位点就在线粒体膜上［24］。本研究中发现石参提
取物可以通过抑制 Bcl－2 和促进 Bax的表达，使得线
粒体膜的通透性和完整性受到破坏，导致线粒体膜
电位急剧下降，促凋亡因子细胞色素 c 被释放到细
346
胞质中形成凋亡体，将 caspase － 3 蛋白激活，剪切
PAＲP，细胞凋亡的线粒体通路级联反应被激活，导
致了细胞凋亡。
综合以上实验结果，石参提取物能够显著抑制
人胃癌细胞 MKN－45 的活性，并通过线粒体途径诱
导细胞凋亡。该研究为石参防治某些与消化道有关
的疾病及功能性食品的开发提供了实验基础，为石
参这种天然山野菜的保护与开发利用提供了一定的
理论依据。然而，关于石参中具体为哪一种功能成
分在发挥主要作用，以及是否通过其他细胞通路发
挥作用尚不明确，还有待于进一步的研究。
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532－53.
( 上接第 307 页)
不同程度的相关性，油酸含量与亚油酸含量存在显
著负相关，但这两者所构成的不饱和脂肪酸总量相
对稳定，说明随着果实的成熟，油酸与亚油酸之间可
能存在一个转化的过程。
3.3 雅安红花油茶的产量与脂肪酸组成相关性不显
著，所以在品种选育时要兼顾这两个因素，选取产量
高且品质好的优良品种。
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