全 文 ：［收稿日期］ 20110211(003)
［第一作者］ 罗超，硕士研究生，研究方向:新药评价，Tel:020-
61648673，E-mail:luofish01@ 163. com
［通讯作者］ * 丘玉昌，博士，讲师，研究方向:新药评价，Tel:
020-61648591，E-mail:qiuyuchang@ yahoo． com． cn
石参总黄酮抗氧化活性研究
罗超，刘霭明，邢惟青，石光，曹莹，庞建新，丘玉昌 *
(南方医科大学药学院新药评价中心，广州 510515)
［摘要］ 目的:研究石参总黄酮的抗氧化活性。方法:采用 50%乙醇回流冷凝提取石参根，提取液分别用乙醚和乙酸乙
酯萃取，得到石参总黄酮。利用 2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐［2，2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-
sulphonate)，ABTS］法检测总抗氧化能力，采用分光光度法检测对 1，1-二苯基-2-苦味肼基(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazy，
DPPH)，羟基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)的清除作用及对脂质过氧化的抑制作用。结果:石参总黄酮在 20 ～ 100 mg·L － 1对
DPPH，ABTS +，·OH 和 NO 等自由基具有明显的清除作用，最大清除率分别达到 60. 89%，74. 87%，41. 77%，81. 01%;对脂质过
氧化亦有明显的抑制作用，最大抑制率达 41. 07%，并具有浓度依赖性。结论:石参总黄酮具有较好的清除自由基活性和抑制
脂质过氧化的作用。
［关键词］ 石参;总黄酮;自由基;脂质过氧化
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)13-0198-04
Antioxidant Effect of Flavonoids from Uraria crinita
LUO Chao，LIU Ai-ming，XING Wei-qing，SHI Guang，CAO Ying，PANG Jian-xin，QIU Yu-chang*
(Center for Preclinical Evaluation of New Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，
Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the radical scavenging effect of flavonoids from U． crinita． Method:
Flavonoids were obtained from U． crinita root by extraction with 50% ethanol，ether and ethyl acetate． Total
antioxidant activity was investigated by 2，2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)(ABTS)． The abilities of
scavenging 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy(DPPH)，·OH and NO，as well as the inhibitory effect of lipid peroxidation
were studied through ultraviolet spectrophotometry in vitro． Result:Flavonoids from U． crinita，ranging from 20-100
μg·mL － 1，sharply scavenged the DPPH，ABTS +，·OH，NO，and inhibited lipid peroxidation dose dependently．
Conclusion: Flavonoids from U． crinita shows potent ability in scavenging radicals and inhibiting lipid
peroxidation．
［Key words］ Uraria crinita;flavonoids;free radicals;lipid peroxidation
石参属蝶形花科狸尾豆属长穗猫尾射 Uraria
crinita(Linn)Desv． ex DC． 的全草或根，民间药用广
泛。《广西中药志》中记载:其味甘，性温，无毒;归肺、
胃二经;行气止痛，逐瘀化痰，治心胃气痛，痰饮咳嗽。
对咳嗽、肺痛、吐血、咳血、尿血、脱肛、子宫下垂、肿
毒、胃炎及十二指肠溃疡等均有一定疗效［1］。目前对
于石参药理作用的报道较少。本研究对石参总黄酮
进行提取分离，并检测其体外抗自由基活性。
1 材料
1. 1 石参 石参购自广州市清平中药材市场，由本
校中医药学院中药鉴定教研室刘传明副教授鉴定为
蝶形花科狸尾豆属植物石参 Uraria crinita Desv，取
其根，洗净，太阳光下晒干，研磨成粉末备用。
1. 2 试剂 1，1-二苯 基-2-苦 味 肼 基 (DPPH)
·891·
第 17 卷第 13 期
2011 年 7 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 13
Jul．，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.13.075
STBB0510，2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)
二铵盐(ABTS)批号 30931-67-0，Sigma-Aldrich 公
司)，维生素 E(Sigma-Aldrich 公司)，维生素 C(分析
纯，批号 20101101-1，广州化学试剂厂)，芦丁对照品
(中国药品生物制品检定所，批号 100080-200707)，
其他化学试剂均为分析纯。
1. 3 仪器 紫外-可见分光光度计(上海欣茂仪器
有限公司)，恒温水浴锅、旋转蒸发仪(巩义市予华
仪器有限公司)，单道微量可调移液器、eppendorf 八
道可调移液器(德国 eppendorf 公司)，赛多利斯电子
天平(德国 Sartorius)。
2 方法
2. 1 石参中总黄酮的提取 采用溶剂萃取方法［2］，
称取粉碎后的石参粉末 500 g，按 1 ∶ 10(g·mL － 1)料
液比加入 50%乙醇溶液，冷凝回流提取 2 h，过滤，
滤渣按上述操作重复提取 2 次(各 1 h)，合并滤液，
减压浓缩至近干，用 1 L 水溶解，过滤，滤液用乙醚
萃取 3 次，母液再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯部
分，减压浓缩至 100 mL，即得石参总黄酮。
2. 2 石参黄酮类化合物样品浓度的测定
2. 2. 1 芦丁标准曲线的制备 采用 NaNO2-A1
(NO3)3 -NaOH 显色体系进行显色分析
［3］。准确称
取 10. 0 mg 芦丁对照品，用 60% 乙醇溶解，定容至
100 mL 量瓶，得 100 mg·L － 1的储备液。分别取此储
备液 0. 00，2. 00，4. 00，6. 00，8. 00，10. 00 mL 置于 25
mL 量瓶中，用 60% 的乙醇稀释至 12. 5 mL;加 0. 7
mL 5%的 NaNO2 溶液摇匀，放置 5 min;加入 0. 7 mL
10% AI(NO3)3 溶液摇匀，放 6 min 后，再加 5 mL l
mol·L － 1的 NaOH 溶液混匀，用 60% 的乙醇溶液定
容。放置 10 min 后，以相应试剂为空白，测 510 nm
处吸光度(A)，平行 3 次。以 A 为纵坐标，浓度为横
坐标，绘制标准曲线。
2. 2. 2 石参总黄酮浓度的测定 取 2. 1 所得提取
液 1 mL，用 60%乙醇定容至 50 mL 得储备液，分别
取此储备液 2. 00，4. 00，6. 00 mL 于 25 mL 量瓶中，
按 2. 2. 1 项下 NaNO2-A1(NO3)3 -NaOH 显色体系方
法进行操作，510 nm 处测定 A，平行 3 次。根据芦丁
标准曲线计算样品黄酮的含量。
2. 3 石参总黄酮抗氧化活性的测定
2. 3. 1 对 DPPH·清除活性的测定 参照文献［4］
方法并做改进，精取 DPPH 对照品 40 mg，加 10 mL
95%乙醇，配制成 0. 4%的 DPPH 母液，避光保存，临
用前稀释成 0. 04%。以 60%乙醇溶液将石参提取液
依次稀释成含黄酮量 20，40，60，80，100 mg·L － 1梯度。
样品管中加入 0. 5 mL 不同浓度的石参提取液与 2. 5
mL 的 0. 04% DPPH 溶液;以 95%乙醇代替 DPPH 溶
液为对照，以蒸馏水代替石参提取液作空白。以上 3
组置于 28 ℃水浴 30 min 后，用0. 5 mL蒸馏水和 2. 5
mL 95%的乙醇调零，于 517 nm 处测定 A，平行 3 次。
用同样浓度系列的 Vit C 溶液作阳性对照，用以下公
式计算对 DPPH 清除率:
DPPH 自 由 基 清 除 率 = ［A空白 － (A样品 －
A对照)］/A空白 × 100%
A空白:蒸馏水 0. 5 mL + DPPH 2. 5 mL 的吸光度
A样品:供试液 0. 5 mL + DPPH 2. 5 mL 的吸光度
A对照:供试液 0. 5 mL + 95%乙醇 2. 5 mL 的吸光度
2. 3. 2 对 ABTS +清除活性的测定 参照文献［5］
方法，将 7 mmol·L － 1的 ABTS 与 2. 45 mmol·L － 1的过
硫酸钾溶液等体积混合，室温避光放置 16 h，成
ABTS +储备液。临用前用无水乙醇稀释至吸光度为
2. 00 + 0. 10，得 ABTS +工作液。取 3 mL ABTS +工作
液与 0. 3 mL 不同浓度石参提取液混匀(提取液的配
制同 2. 3. 1)，室温反应 6 min 后迅速于 734 nm 处测
定 A，平行 3 次。用同样浓度系列的 Vit C 溶液作阳
性对照，根据以下公式计算 ABTS +清除率:
ABTS +清除率 =［1 －(A样品 － A对照)/A空白］ × 100%
A样品:供试液 0. 3 mL + ABTS
+ 3. 0 mL 的吸光度
A对照:供试液 0. 3 mL + 95%乙醇 3. 0 mL 的吸光度
A空白:95%乙醇 0. 3 mL + ABTS
+ 3. 0 mL 的吸光度
2. 3. 3 对·OH 自由基清除活性的测定 采用
Fenton 反应进行测定。每管以 1. 5 mL 的邻二氮菲
(5 mmol·L － 1)与 4 mL 磷酸盐缓冲液(0. 75 mol·
L － 1，pH 7. 4)和 1 mL FeSO4(7. 5 mol·L
－ 1)溶液混
合，再加入 1 mL 2% H2O2 溶液，以 H2O 代替 H2O2
为空白，样品管加入 2. 5 mL 不同浓度石参提取液
(提取液的配制同 2. 3. 1)，空白与损伤管以 H2O 代
替，混匀后 37 ℃，孵育 60 min，536 nm 测定 A，平行 3
次。用同样浓度系列的 Vit C 溶液作阳性对照，根据
以下公式计算·OH 清除率:
清除率(d)=(A样品 － A损伤)/(A空白 － A损伤)
A样品:1. 5 mL 邻二氮菲 + 4 mL 磷酸盐缓冲液 + 1 mL
FeSO4 + 2. 5 mL 样品溶液 + 1 mL H2O2 的吸光度
A空白:1. 5 mL 邻二氮菲 + 4 mL 磷酸盐缓冲液 + 1 mL
FeSO4 + 3. 5 mL H2O 的吸光度
A空白:1. 5 mL 邻二氮菲 + 4 mL 磷酸盐缓冲液 + 1 mL
·991·
罗超，等:石参总黄酮抗氧化活性研究
FeSO4 + 2. 5 mL H2O + 1 mL H2O2 的吸光度
2. 3. 4 对 NO 清除活性的测定 利用 Beyotime 公
司 NO 检测试剂盒中的 NO 检测系统略做改进。在
0. 5 mL 硝普钠(25 mmol·L － 1)中，加入 2 mL 不同浓
度的石参提取液(提取液的配制同 2. 3. 1)，用 0. 5
mL 蒸馏水代替硝普钠为对照，以 2 mL 蒸馏水代替
样品溶液为空白，25 ℃下放置 90 min 后，加入 1. 5
mL 的 Griess 试剂，540 nm 处以蒸馏水调零测定吸
光度，平行 3 次，用同样浓度系列的 Vit C 溶液作阳
性对照，根据以下公式计算各种样品对 NO 的清
除率:
NO 清除率 =［A空白 －(A样品 － A对照)」/A空白 × 100%
A空白:0. 5 mL 的硝普钠 + 2 mL 双蒸水的吸光度
A样品:0. 5 mL 的硝普钠 + 2 mL 药物溶液的吸光度
A对照:0. 5 mL 双蒸水 + 2 mL 药物溶液的吸光度
表 1 石参总黄酮与 Vit C 对 DPPH，ABTS + ，·OH，NO 的清除率(珋x ± s，n = 3) %
组别 药物
质量浓度 /mg·L － 1
20 40 60 80 100
对 DPPH 清除率 石参提取物 17. 59 ± 0. 231) 30. 70 ± 0. 191) 42. 78 ± 0. 101) 51. 77 ± 0. 261) 60. 89 ± 0. 191)
Vit C 15. 86 ± 0. 07 33. 14 ± 0. 16 47. 87 ± 0. 12 64. 44 ± 0. 14 66. 32 ± 0. 07
对 ABTS + 清除率 石参提取物 25. 31 ± 0. 061) 43. 58 ± 0. 081) 55. 36 ± 0. 081) 69. 00 ± 0. 06 74. 87 ± 0. 081)
Vit C 14. 81 ± 0. 04 34. 10 ± 0. 12 50. 41 ± 0. 16 68. 72 ± 0. 06 87. 34 ± 0. 04
对·OH 清除率 石参提取物 10. 46 ± 0. 181) 19. 14 ± 0. 401) 26. 45 ± 0. 351) 38. 59 ± 0. 141) 41. 77 ± 0. 411)
Vit C 1. 43 ± 0. 42 5. 68 ± 0. 37 13. 19 ± 0. 39 15. 34 ± 0. 38 17. 22 ± 0. 25
对 NO 清除率 石参提取物 22. 23 ± 4. 07 20. 89 ± 7. 911) 29. 60 ± 6. 401) 81. 01 ± 9. 61 64. 81 ± 1. 741)
Vit C 24. 26 ± 7. 34 55. 52 ± 6. 48 67. 56 ± 2. 21 85. 50 ± 1. 56 87. 72 ± 2. 59
注:与组内等浓度 Vit C 比较1)P ＜ 0. 01。
2. 3. 5 对脂质过氧化的抑制作用 参照文献［6］
方法，在 10 mL 具塞试管中加入 2 mL 不同浓度的石
参提取液(提取液的配制同 2. 3. 1)，再加入 2 mL 亚
油酸溶液(2. 5%)、4 mL 的磷酸盐缓冲液(50 mol·
L － 1，pH 7. 0)和 2 mL 蒸馏水;对照管用 2 mL 乙醇代
替样品液，所有的试管避光，于 40 ℃水浴锅中进行
加速氧化试验，于 24 h 后取样。用 FTC 法测量样品
液的抗氧化性，取出 0. 3 mL 培养液，分别加入 4. 1
mL 75%乙醇和 0. 3 mL 30%的硫氰酸按溶液，再加
入 0. 3 mL 0. 02 mol·L － 1氯化亚铁溶液(含 3. 5%
HCl)，准确反应 3 min，于 500 nm 处测定形成红色化
合物的吸光度，平行 3 次，用同样浓度系列的 Vit E
溶液作阳性对照，根据以下公式计算各种样品对亚
油酸过氧化的抑制率:
过氧化抑制率 =［1 －(A样品 /A空白)］× 100%
A样品:加入中药提取液后在 24 h 的吸光度
A空白:空白在 24 h 的吸光度
2. 4 统计学分析 实验数据均采用 SPSS 13. 0 统
计软件进行两独立样本 t 检验，结果用 珋x ± s 表示，用
Origin Pro 6. 0 作图。P ＜ 0. 05 有统计学意义。
3 结果
3. 1 石参总黄酮浓度的测定 芦丁质量浓度 10 ～
50 mg·L － 1与其吸光度呈良好的线性关系，在此范围
内的线性回归方程为:Y = 0. 0111X － 0. 008(R2 =
0. 9992)。按此回归方程算得石参提取液中黄酮为
5 g·L － 1。
3. 2 石参总黄酮抗氧化活性
3. 2. 1 对 DPPH 清除活性 如表 1 所示，在 20 ～
100 mg·L － 1，石参总黄酮对 DPPH 自由基有明显的
清除作用，呈现明显的量效关系。石参总黄酮各组
浓度均与 Vit C 组有显著性差异(P ＜ 0. 01)，黄酮浓
度在 100 mg·L － 1时清除率为(60. 89 ± 0. 19)%，稍
弱于 Vit C。
3. 2. 2 对 ABTS +清除活性 如表 1 示，在 20 ～ 100
mg·L － 1，石参总黄酮对 ABTS +自由基有明显清除作
用，呈现明显的量效关系，总黄酮浓度在 100 mg·L － 1
时 清 除 率 为 74. 87% ± 0. 08%。在 较 低 浓 度
(20 ～ 60 mg·L － 1)时，其清除 ABTS + 自由基的能力
略高于 Vit C，且组间差异显著(P ＜ 0. 01)，在较高浓
度(100 mg·L － 1)时其清除 ABTS + 自由基的能力比
Vit C 略低，并有显著性差异(P ＜ 0. 01)。
3. 2. 3 对·OH 自由基清除活性 如表1示，在 20 ～
100 mg·L － 1，石参总黄酮对·OH 自由基有明显的清
除作用，呈现明显的量效关系，其作用强于 Vit C
(P ＜ 0. 01)。总黄酮在 100 mg·L － 1 时清除率为
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2011 年 7 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 13
Jul．，2011
41. 77% ± 0. 41%。
3. 2. 4 对 NO 清除活性 如表 1 所示，在 20 ～ 100
mg·L － 1石参总黄酮对 NO 自由基有一定的清除作
用，呈现明显的量效关系，总黄酮在 80 mg·L － 1时清
除率为 81. 01% ± 9. 61%，在 100 mg·L － 1时清除率
反而下降。表 1 也显示，石参总黄酮清除 NO 的能
力均比 Vit C 略低。40，60，100 mg·L － 1石参总黄酮
与 Vit C 对 NO 的清除率有显著性差异(P ＜ 0. 01)。
3. 2. 5 对脂质过氧化的抑制作用 如表 2 所示，在
20 ～ 100 mg·L － 1，石参总黄酮对脂质过氧化有明显
的抑制作用，呈现明显的量效关系。总黄酮在 100
mg·L － 1时抑制率为 41. 07% ± 0. 10%，石参总黄酮
在 20，40，80，100 mg·L － 1时对脂质过氧化的抑制能
力高于 Vit E(P ＜ 0. 01)。
表 2 石参总黄酮与 Vit E 对脂质过氧化的抑制率(珋x ± s，n = 3) %
药物
质量浓度 /mg·L － 1
20 40 60 80 100
石参提取物 24. 77 ± 0. 101) 25. 64 ± 0. 051) 26. 95 ± 0. 04 31. 43 ± 0. 091) 41. 07 ± 0. 101)
Vit E 21. 73 ± 0. 12 22. 07 ± 0. 12 27. 15 ± 0. 10 23. 98 ± 0. 12 25. 35 ± 0. 15
注:与组内等浓度 Vit E 比较1)P ＜ 0. 01。
4 讨论
当机体内自由基产生过多或机体清除自由基能
力下降时，这些自由基对 DNA、蛋白质和脂质等生
物大分子产生氧化损伤作用，引起机体组织器官发
生各种病变［7］。·OH 可以损伤 DNA 的碱基和糖基，
导致基因的变异［8］，也可以对蛋白质的氨基酸侧链
残基进行修饰，影响蛋白质的功能［9］。此外，·OH
和 NO 使得机体脂质过氧化，损伤机体内各种生物
膜，修饰脂蛋白，引起心血管疾病或肿瘤［10-11］。增强
机体清除自由基的能力，可以预防和治疗与自由基
相关的疾病。
DPPH 法是目前常用的检测化合物清除自由基
活性的试验方法，而通过 ABTS 法能对化合物的总
抗氧化能力进行检测。本研究结果显示，在 20 ～
100 mg·L － 1 石参总黄酮能明显清除 DPPH 和
ABTS +，对·OH 和 NO 也具有较好的清除能力，并且
能明显抑制脂质过氧化，表明石参总黄酮具有较好的
抗氧化能力，具有进一步开发利用的价值。
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［责任编辑 聂淑琴］
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罗超，等:石参总黄酮抗氧化活性研究