全 文 :网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.0958.002.html
doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.002
·论 著·
甜瓜蒂中葫芦素提取工艺初探
及其含量测定*
魏 榕1,伍忠军1,杨玛丽2,肖 翠1,曹小华1,阳 泰3,刘 进3△
1.成都医学院 生物医学系(成都 610500);2.成都医学院 检验医学院(成都 610500);3.成都医学院 科研实验中心(成都 610500)
【摘要】 目的 比较65%乙醇和无水乙醇回流提取法从甜瓜蒂中提取葫芦素的效率;同时比较甜瓜蒂纤维和
甜瓜蒂粉末中葫芦素含量的差异。方法 分别采用65%乙醇和无水乙醇加热回流法制备甜瓜蒂粉末提取液;采用
无水乙醇加热回流法制备甜瓜蒂纤维提取液。通过 HPLC测定提取液中葫芦素B、E和I的浓度。结果 甜瓜蒂
粉末采用无水乙醇制备的提取液中葫芦素B、E浓度均高于65%乙醇制备的提取液中葫芦素B、E浓度,差异有统
计学意义(P<0.05);但葫芦素I浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。甜瓜蒂纤维采用无水乙醇制备的提取
液中也含有较高浓度的葫芦素B、E、I。结论 采用乙醇加热回流法从甜瓜蒂中提取葫芦素,无水乙醇提取效率高
于65%乙醇。甜瓜蒂粉末中葫芦素含量虽高于甜瓜蒂纤维,但甜瓜蒂纤维中仍有较高含量的葫芦素,不应当作废
弃物处理。
【关键词】 甜瓜蒂;葫芦素;提取工艺
【中图分类号】 R284.2 【文献标志码】 A
Preliminary Study on the Extraction Process of Cucurbitacin from Cucumis Melo Pedicle and its Content Determination
Wei Rong1,Wu ZhongJun1,Yang Mali2,Xiao Cui1,Cao Xiaohua1,Yang Tai3,Liu Jin3△.1.School of
Biomedical Sciences,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;2.School of Medical Laboratory
Sciences,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;3.Center for Scientific Research,Chengdu
Medical College,Chengdu610500,China
【Abstract】 Objective To study and compare the extraction process of cucurbitacin from dry Cucumis melo
pedicle by the heating reflux method with 65%ethanol and anhydrous ethanol and compare the cucurbitacin content
of fibers and powders of Cucumis melo pedicle.Methods The powder extraction solution of Cucumis melo pedicle
was prepared by the heating reflux method with 65% ethanol and anhydrous ethanol,and the fiber extraction
solution was prepared by the heating reflux method with anhydrous ethanol. High Performance Liquid
Chromatography(HPLC)method was adopted to assay the concentration of cucurbitacin B,E and I in the
extraction solution.Results The concentration of cucurbitacin B and E in the extraction solution obtained by
anhydrous ethanol was significantly higher than in the extraction solution obtained by 65%ethanol(P<0.05),but
there was no significant difference in the concentration of cucurbitacin I between the two groups(P>0.05).The
fibers of Cucumis melo pedicle contained the relatively high concentrations of cucurbitacin B,E and I.Conclusion
Anhydrous ethanol is more effective in the heating reflux method than 65%ethanol in extracting the cucurbitacin.
The content of cucurbitacin in powders of Cucumis melo pedicle is much higher than in its fibers,but the fibers
should not be discarded as waste since it contains the relatively high concentration of cucurbitacin.
【Key words】 Cucumis melo pedicle;Cucurbitacin;Extraction process
*基金项目:国家自然科学基金资助项目(No:81201668);四川省教
育厅基金资助项目(No:15ZB0234);四川省大学生创新创业训练计
划资助项目(No:201413705032)
△通信作者:刘进,E-mail:jinliu19871987@163.com
葫芦素是一类从葫芦科植物中分离得到的四环
三萜类化合物,类型有葫芦素 A、B、C、D、E、F和I
等。植物次生代谢产物研究[1]表明,植物产生葫芦
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素B和E后,可通过代谢葫芦素B和E产生其他类
型葫芦素。甜瓜蒂为葫芦科甜瓜属植物甜瓜
Cucumis melo L.的果梗,是提取、制备葫芦素类化
合物的重要原料[2]。从甜瓜蒂中提取葫芦素,主要
采用乙醇提取法,有研究[3]比较了55%、75%以及
95%乙醇,最后优选55%乙醇用于甜瓜蒂中葫芦素
提取。亦有研究[4]报道优选65%乙醇提取甜瓜蒂
中葫芦素B。在一定范围内,含水量大虽可提高产
品的一次性提取率,但会降低提取物的纯度[5]。因
此,本研究着重比较65%乙醇浓度和无水乙醇回流
提取法提取甜瓜蒂中葫芦素的效率。但目前大多研
究[6-7]仅报道了甜瓜蒂粗粉在甜瓜蒂提取工艺中的
使用,未见报道甜瓜蒂纤维中葫芦素含量的测定。
本研究将测定甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维中葫芦素含
量,以判断甜瓜蒂纤维是否可以作为提取原料使用。
甜瓜蒂中葫芦素主要含有葫芦素B、E[2],因此,
本研究将通过测定提取物中葫芦素B和E的含量
来比较提取效率。另外葫芦素I被认为具有更强的
抗肿瘤活性,本研究同时测定了葫芦素I的含量,以
了解葫芦素I是否也是决定中药甜瓜蒂药效的关键
组分。
1 仪器与试药
1.1 仪器
美国 Waters2695液相色谱仪;瑞士Buchi公司
R210型旋转蒸发仪;梅特勒托利多 ME104分析天
平;Milipore A10超纯水机。
1.2 试药
甜瓜蒂药材(产地:山东省莱西市马连庄镇),经
成都医学院生药学教研室游元元教授鉴定为葫芦科
植物甜瓜的干燥果蒂;葫芦素B对照品(纯度 ≥
98.67%)购于成都曼思特科技有限公司,批号:
MUST-16022208;葫芦素E对照品(纯度 ≥95%)
购于成都曼思特科技有限公司,批号:MUST-
12092801;葫 芦 素 I(纯 度 ≥ 98%)购 于 美 国
Cayman Chemical公司;乙醇(分析纯,成都市科龙
化工试剂厂),甲醇(色谱纯,美国赛默飞公司)。
2 方法
2.1 色谱条件
C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,日本
Kromasil公司);流动相:甲醇-水(65∶35,V/V);流
速:0.8mL/min;检测波长230nm;柱温30℃;进
样量5μL。在此色谱条件下,供试品中葫芦素I、B、
E的保留时间分别为8.5、11.5、13.2min,与相邻色
谱峰的分离度均>1.5,理论塔板数按葫芦素I、B、E
计算分别不低于8 935、10 767、10 351(图1A-1B)。
2.2 供试品溶液的制备
使用粉碎机破碎甜瓜蒂,得甜瓜蒂粉末和甜瓜
蒂纤维。称取25g甜瓜蒂粉末和25g甜瓜蒂纤维,
浸泡于250mL无水乙醇,另称取25g甜瓜蒂粉末
浸泡于250mL 65%乙醇中。80℃水浴加热回流提
取,重复提取3次,每次1h,将3次的提取液合并转
移至500mL容量瓶,加入无水乙醇定容至500mL。
2.3 对照品溶液的制备
称取2.2mg葫芦素B、1.3mg葫芦素 E和
2.5mg葫芦素I,分别加入10mL容量瓶中使用甲
醇定容。对照品溶液中葫芦素B、E、I溶液浓度分
别为:220、130、250μg/mL。
2.4 线性关系考察
精密移取2.5mL葫芦素I、2.5mL葫芦素B
和0.125mL葫芦素E对照品溶液于10mL容量瓶
中,加入甲醇定容。混合对照品中葫芦素I、B、E浓
度分别为:62.5、55.0、1.6μg/mL。液相色谱仪自
动进样1、2、4、8、16、20μL,测定峰面积,以进样量
(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标。作葫芦素I、B、E
的标准曲线,分别得回归方程:^y=18 318x-27.6,
r=0.9 995;^y=1 533.6x+23.9;r=0.9 997;^y=
1 533.2x-2.8,r=0.9 998;葫芦素B、E、I的进样
量分别在0.065~1.300、0.055~1.100、0.002~
0.032μg,范围内线性良好。
2.5 精密度试验
取混合对照品溶液,按2.1色谱条件,单次进样
5μL,重复进样5次。葫芦素B、E、I峰面积的RSD
分别为1.49%、1.39%、1.58% (n=5),说明仪器精
密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一供试品溶液,室温放置,于0、4、8、10、
12h,按2.1色谱条件单次进样5μL。供试品中葫
芦素B、E、I峰面积 RSD分别为1.63%、1.46%、
1.52% (n=5),结果表明供试品溶液在室温12h
内稳定。
2.7 重复性试验
取同一供试品溶液,按2.1色谱条件单次进样
5μL,重复进样5次。葫芦素B、E、I的峰面积RSD
分别为1.37%、1.52%、1.47% (n=5),结果表明方
法的重复性良好。
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图1 葫芦素对照品和甜瓜蒂无水乙醇提取物供试品的HPLC色谱图
注:A.葫芦素I、B、E 3种对照品混合溶液;B.甜瓜蒂无水乙醇提取物供试品溶液;1-葫芦素I;2-葫芦素B;3-葫芦素E
2.8 加样回收率试验
称取6份已测定含量的供试品适量置于10mL
容量瓶,加入混合对照品溶液5mL,使用甲醇定容。
按2.1色谱条件单次进样5μL,测定葫芦素B、E、I
峰面积并计算含量。葫芦素B、E、I的平均回收率
分别为101.82%、104.53%、99.07%,RSD分别为
1.42%、1.71%、1.58%(n=6)。
2.9 统计学方法
使用SPSS 14.0统计软件进行数据处理,定量
资料以均数±标准差(珚x±s)描述,葫芦素含量差异
比较采用 Student′s-t检验。检验水准α设定为
0.05。
3 结果
3.1 不同乙醇浓度加热回流提取甜瓜蒂中葫芦素
的效率比较
采用65%乙醇和无水乙醇作为提取液对甜瓜
蒂粉末进行加热回流提取,HPLC测定提取液中葫
芦素B、E、I浓度,提取操作重复3次。结果表明,
采用无水乙醇制备的甜瓜蒂提取液中葫芦素B、E
的浓度均高于65%乙醇的提取液,差异有统计学意
义(P<0.05),但葫芦素I的浓度比较,差异无统计
学意义(P>0.05)(表1)。
表1 65%乙醇和无水乙醇提取液中葫芦素
浓度比较(珔x±s,μg/mL,n=3)
提取方法 葫芦素B 葫芦素E 葫芦素I
65%乙醇 334.6±5.9 13.8±1.6 252.6±7.5
无水乙醇 430.0±10.1 26.9±2.1 273.2±8.5
P 0.009 0.026 0.095
3.2 甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维中葫芦素B、E、I含
量比较
采用无水乙醇加热回流分别提取甜瓜蒂粉末和
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甜瓜蒂纤维,HPLC测定两种提取液中葫芦素B、E、
I浓度,计算甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维中葫芦素含
量,提取操作重复3次,结果表明,每克甜瓜蒂粉末
中葫芦素B、E、I含量均高于甜瓜蒂纤维,差异有统
计学意义(P<0.05)(表2)。
表2 甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纤维葫芦素含量比较(珔x±s,mg/g,n=3)
甜瓜蒂组分 葫芦素B 葫芦素E 葫芦素I
甜瓜蒂粉末 8.600±0.202 0.538±0.043 5.464±0.169
甜瓜蒂纤维 4.036±0.113 0.271±0.028 2.616±0.093
P 0.002 0.018 0.001
4 讨论
本研究表明,无水乙醇加热回流提取比65%乙
醇加热回流从甜瓜蒂中提取葫芦素效率更高。既往
研究[4-5]也有比较55%、75%、95%乙醇以及不同料
液比对葫芦素B提取效率的影响,但提取物中含有
的水分影响了下一步的保存或纯化工作。无水乙醇
回流提取液中葫芦素主要成分葫芦素B和E含量
均高于65%乙醇,且最终产物中水份少,便于乙醇
回收和纯化工作。
甜瓜蒂提取首先需将甜瓜蒂粉碎,但甜瓜蒂是
甜瓜的梗部,含有大量纤维。以往研究[6-7]报道仅使
用甜瓜蒂粉末,而未将甜瓜蒂纤维作为原料使用。
本研究表明:尽管甜瓜蒂纤维中葫芦素含量低于甜
瓜蒂粉末,但甜瓜蒂纤维中依然有较高含量的葫芦
素,甜瓜蒂提取工艺中产生的大量纤维不应作为废
弃物丢弃。
葫芦素I被认为具有更强大的抗肿瘤活性,葫
芦素I可以通过激活 RhoA/ROCK 途径和抑制
LIM激酶,抑制肌动蛋白和磷酸肌球蛋白Ⅱ共聚体
的形成,影响细胞的迁移和分裂,诱导细胞发生凋
亡[8]。葫芦素I还可以下调 Aurora kinase A、
Aurora kinase B和Survivin表达,阻滞细胞周期在
G2/M[9];同时还能抑制STAT3磷酸化抑制肿瘤细
胞增殖[10]。既往研究忽视了甜瓜蒂中葫芦素I的
含量测定,本研究测定结果表明甜瓜蒂中有较高含
量的葫芦素I。葫芦素I可能也是决定中药甜瓜蒂
药效的关键组分,其含量和生物活性应该引起重视。
综上所述,本研究证实了无水乙醇加热回流提
取甜瓜蒂中葫芦素的效率高于65%乙醇,同时还发
现甜瓜蒂纤维中也有较高含量葫芦素,可作为提取
原料使用;通过对比葫芦素I标准品,发现甜瓜蒂也
有较高含量的葫芦素I。但液相色谱的结果并不能
确定被测物质的结构,因此在未来的研究中还需要
通过高效液相与质谱联用进一步确认。
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