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(2007-11-06收稿)
基金项目:北京市自然科学基金资助项目(7072042)作者简介:吕颖坚(1983-),女,硕士研究生 ,研究方向为药物毒理学。＊通讯作者:张宝旭(1959-),男 ,教授 ,主要研究方向为毒理学;Tel:010-82801527, E-mail:bxzhang@hjmu.edu.cn。
五指毛桃水提物对二甲基甲酰胺所致
小鼠急性肝损伤的保护作用
吕颖坚 ,贾凤兰 ,阮　明 ,张宝旭＊
(北京大学公共卫生学院毒理系 ,北京 100083)
　　摘要　目的:探讨五指毛桃水提物对二甲基甲酰胺(DMF)所致小鼠急性肝损伤的保护作用。 方法:雌性
C57BL/6小鼠 25只 , 雄性 ICR小鼠 35只 ,各随机分成 5组:正常对照组 、DMF组 、五指毛桃低 、中 、高剂量组。五指
毛桃各组每天分别灌胃给予五指毛桃水提物 100、200、300g生药 /kg,共 5 d, 第 4d给药 30min后 ,除正常对照组外
各组小鼠腹腔注射 DMF造模。染毒 48 h后 , 测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)和
乳酸脱氢酶(LDH)的活性 , 并以光镜观察肝脏组织病理变化。结果:C57BL/6和 ICR小鼠各剂量组血清中 ALT、
AST和 LDH活性与模型组比较显著降低 ,肝脏组织病理损伤明显减轻。结论:五指毛桃对 DMF引起的小鼠急性肝
损伤具有明显的保护作用。
关键词　五指毛桃;二甲基甲酰胺(DMF);急性肝损伤
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4450(2008)09-1364-05
TheHepatoprotectiveEfectofAqueousExtractsfromFicushirtaon
N, N-DimethylformamideInducedAcuteLiverInjuryinMice
LVYing-jian, JIAFeng-lan, RUANMing, ZHANGBao-xu
(PekingUniversityHealthScienceCenter, Beijing100083, China)
Abstract　Objective:ToinvestigatetheefectofaqueousextractfromFicushirtaonN, N-Dimethylformamide(DMF)induced
liverinjuryinmice.Methods:C57BL/6 miceandICRmicewererandomlydividedinto5 groups:negativecontrolgroup, positivecon-
trolgroupandthreetreatedgroupsrespectively.Treatedgroupswereadministeredorallywith100, 200, 300 g/kgFicushirtaaqueous
·1364· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 9期 2008年 9月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.09.028
extractperdayrespectivelyfor5 days.Onthe4thday, 2.3 g/kgDMFwasgivenbyintraperitonealinjectiontoallC57BL/6 miceex-
ceptnegativecontrolgroup, whileforICR, DMFwasadministrationata2.75g/kgdose.48hafterDMFinjection, serumsampleswere
colectedtodeterminetheactivitiesofALT, ASTandLDH andthepathologicalchangesoflivertissuewereanalyzedunder
microscope.Results:Comparedwiththepositivecontrol, theactivitiesofALT, ASTandLDHweresignificantlyreducedandtheliver
injuryobviouslyattenuatedintreatedgroups.Conclusion:TheaqueousextractofFicushirtahasanobviousprotectiveefectagainst
DMF-inducedacuteliverinjuryinmice.
Keywords　Ficushirta;N, N-Dimethylformamide(DMF);Acuteliverinjury
　　二 甲基 甲酰 胺 (N, N-Dimethylformamide,
DMF), 是一种良好的溶剂 , 分子式为 CH3CON
(CH3)2 ,无色 ,带鱼腥味 。DMF广泛应用于仿皮制
造等行业 , 亦用于有机合成 、染料 、制药 、石油提炼
和树脂等领域[ 1] 。 DMF属于低毒物质 ,以蒸汽形式
扩散 ,通过呼吸道吸入和皮肤吸收而致中毒 ,以皮肤
吸收为主。侵入机体后 ,主要靶器官为肝脏 [ 2, 3] ,主
要表现为血清 AST和 ALT活性增高 、胆固醇增多 、
碱性磷酸酶活性增高和胆碱酯酶活性轻度增高 、肝
细胞脂肪变性和坏死 。在作业工人中常有肝脏损害
和胃肠道刺激症状 [ 4-6] 。 《职业性急性二甲基甲酰
胺中毒诊断标准 GBZ85-2002》中指出 DMF中毒尚
无特效解毒药物 ,治疗原则主要为对症治疗 ,保护肝
脏 。故开发能够拮抗 DMF所致肝脏损伤的药物显
得尤为重要 。
五指毛桃为桑科植物粗叶榕的根 ,是我国华南
地区常用药材 ,味辛 、甘 ,性平 ,具健脾益气 、化湿舒
筋之功效 ,有抗炎 、增强免疫力等药理活性 [ 7] ,在华
南地区还是一种常用的煲汤食材 。本课题组在抗
DMF毒性药物筛选中发现 ,五指毛桃提取物具有较
好的抗 DMF所致小鼠急性肝损伤作用 ,有进一步研
究开发的价值。
1　材料和方法
1.1　实验动物　SPF级雌性健康 C57BL/6小鼠
25只 ,体重 18 ～ 22 g;SPF级雄性健康 ICR小鼠 35
只 ,体重 22 ～ 24g,由北京大学医学部实验动物中心
提供(SYXK(京)2002-0002)。适应性饲养 3 d,动
物室和实验室温度为(23±2)℃,自动通风 ,明暗周
期 12h/12 h,自由摄食饮水。
1.2　药品与仪器　五指毛桃 1000 g,购自广州南
北行中药饮片有限公司 ,批号:070306B102,用 10倍
量蒸馏水煎煮 4次 ,合并滤液浓缩至 100 ml,即得
10 g生药 /ml的五指毛桃水提物;DMF, 购自 AC-
ROS公司 ,批号:A018522301,用生理盐水配制;甲
醛溶液 ,购自北京化学试剂公司 ,批号:040322,用
PBS配成 10%的福尔马林溶液;HITACHI-7170A型
全自动生化分析仪;日本 Nikon公司 E400显微镜系
统及 DXM1200F型摄像系统。
1.3　动物分组及处理　C57BL/6小鼠 25只 ,随机
分为 5组:正常对照组 、DMF组 、五指毛桃水提物
低 、中 、高剂量组(100、200、300 g/kg)。每组 5只。
ICR小鼠 35只 ,分组方法同上。五指毛桃水提物各
组每天固定上午 9∶00 ～ 10∶00按上述剂量分别灌
胃 ,正常对照组和 DMF组给等体积生理盐水 ,连续
给药 4 d, 最后一次给药 0.5 h后 , C57BL/6小鼠
DMF组及五指毛桃水提物各组腹腔注射 DMF2.3
g/kg, ICR小鼠 DMF组及五指毛桃水提物各组腹腔
注射给予 DMF2.75 g/kg。正常对照组给予等量的
生理盐水 。DMF染毒 48h后 ,所有小鼠内眦静脉取
血 ,常规分离血清 ,用于 ALT、AST和 LDH的检测。
颈椎脱臼处死 ,立即分离肝脏 ,称重 ,肉眼观察肝脏
大体变化 。取肝左叶置福尔马林溶液中固定 ,常规
病理切片 , HE染色 ,肝组织损伤程度分为 4级 , 0级
(-):肝组织结构正常 ,无明显变性 、坏死及炎症细
胞浸润;1级(+):肝小叶结构尚正常 ,可见明显的
混浊肿胀 、气球样变或脂肪变性 ,散在点状坏死;2
级(++):肝小叶结构不清 ,可见明显的灶状坏死 ,
伴有炎症细胞浸润;3级(+++):肝小叶结构不清 ,
可见明显的片状坏死 ,伴有炎症细胞浸润。摄像系
统拍照后用 photoshop7.0对病理图片进行对坏死
和变性组织面积所占比例进行半定量分析。在每只
小鼠肝脏的同样位置均取一片作病理检查 。在 200
倍显微镜下每片切片均随机选取 10个视野摄像 ,用
photoshop7.0对每张图片进行分析处理 ,计算每只
小鼠肝脏切片损伤面积的比例 ,进而计算出每组损
伤面积占总面积的比例 ,并对结果进行统计学处理。
1.4　生化分析 　使用 HITACHI-7170A自动分析
仪分析血清中 ALT、AST和 LDH活性 (由北京大学
第三医院检验科测定)。
1.5　统计学处理 　实验数据以 x±s表示 , 用
SPSS13.0软件包采用单因素方差分析进行各组间
统计学分析 , P<0.05认为差异有统计学意义 。
2　结果
2.1　各组小鼠体重 、肝重和肝体比的变化　与正
常对照组比较 , C57BL/6小鼠 DMF组体重有所下
降 ,肝重变化不明显 ,肝体比增加。 ICR小鼠 DMF
·1365·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 9期 2008年 9月
组体重 、肝重及肝体比没明显变化 。 C57BL/6小鼠
和 ICR小鼠的各剂量组与各自 DMF组比较 ,体重 ,
肝脏重量和肝体比变化不明显 ,差别不具统计学意
义 。
2.2　五指毛桃水提物对 DMF中毒小鼠血清转氨
酶的影响 　与正常对照组比较 , C57BL/6小鼠和
ICR小鼠的 DMF组血清 ALT、AST、LDH活性明显
升高 , 差异具有统计学意义。与 DMF组比较 ,
C57BL/6小鼠和ICR小鼠五指毛桃各组血清 ALT、
　表 1　五指毛桃水提物对 DMF组小鼠血清转氨酶的影响
组别 ALT(IU/L) AST(IU/L) LDH(IU/L)
C57BL/6小鼠
正常对照组 　50±13 157±35 770±157
DMF组 2386±620## 1477±418## 2032±428##
DMF+五指毛桃水提物 100g/kg 1112±395＊ 662±265＊ 1384±255＊
DMF+五指毛桃水提物 200g/kg 　89±35＊＊ 256±121＊＊ 979±163＊＊
DMF+五指毛桃水提物 300g/kg 　67±5＊＊ 162±4＊＊ 833±64＊＊
ICR小鼠
正常对照组 　49±15 119±17 1806±339
DMF组 7039±1841## 1584±180## 9436±2416##
DMF+五指毛桃水提物 100g/kg 3467±2199 634±270＊ 7242±2886
DMF+五指毛桃水提物 200g/kg 147±118＊＊ 118±19＊＊ 1247±156＊＊
DMF+五指毛桃水提物 300g/kg 　61±17＊＊ 　99±12＊＊ 1227±156＊＊
　　注:与正常对照组比较 , #P< 0.05, ##P< 0.01;与模型组比
较 , ＊P<0.05, ＊＊P< 0.01。表 3同
AST和 LDH活性均明显降低 ,差异具有统计学意
义。且酶活性随剂量增大而降低 ,具有剂量-效应关
系(表 1)。
2.3　对小鼠肝脏组织病例变化的影响
2.3.1　肝组织病理观察:形态学观察:正常对照组
小鼠肝脏颜色暗红 ,被膜光滑 ,有光泽 ,富有弹性;
C57BL/6小鼠和 ICR小鼠的 DMF组肝脏大体颜色
略黄 ,均出现灰黄色点状坏死灶 ,分布尚均匀 ,无光
泽 ,质地稍脆 , 个别肝脏可见明显小片状淤血;
C57BL/6小鼠和 ICR小鼠五指毛桃各组病变减轻 ,
且随着剂量增大逐渐接近正常:低剂量组坏死灶比
DMF组减少;中剂量组略有水肿 ,质地柔软 ,几乎不
见坏死灶;高剂量组与正常对照组相比 ,已没有明显
差异 。组织学观察:正常对照组(图 1A,图 2A):肝
小叶结构清晰 ,胞核大而清晰 ,胞质丰富 ,含有团块
嗜碱质 ,肝细胞无变性 、坏死 ,无炎症细胞浸润。肝
细胞索围绕中央静脉呈放射状排列整齐 ,肝血窦正
常;DMF组(图 1 B,图 2 B):C57BL/6小鼠与 ICR
小鼠均见广泛存在的肝脏小叶中央静脉周围的肝细
胞不同程度的变性与坏死 ,坏死呈凝固性 , 胞核固
缩或已溶解破碎 ,伴中性粒细胞 、单核细胞等炎性细
胞浸润。肝细胞索正常形态破坏 。中间带可见细胞
空泡样变;五指毛桃各组(图 1 C-E,图 2C-E):肝细
胞坏死 、变性及炎性细胞浸润程度均减轻。病变主
要为中央静脉周围肝细胞肿大伴有空泡及脂肪样
变 ,胞浆疏松。随着五指毛桃水提物剂量的增加 ,肝
细胞变性 、肿大的情况逐渐减轻 ,肝细胞索形态逐渐
恢复 ,高剂量组已接近正常表现(表 2)。
图 1　五指毛桃水提物对 C57BL/6小鼠病理变化的影响(HE;×200)
A.正常对照组　B.DMF组　C.五指毛桃水提物 100 g/kg组　D.五指毛桃水提物 200 g/kg组　E.五指毛桃水提物
300g/kg组
·1366· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 9期 2008年 9月
图 2　五指毛桃水提物对 ICR小鼠病理变化的影响(HE;×200)
A.正常对照组　B.DMF组　C.五指毛桃水提物 100 g/kg组　D.五指毛桃水提物 200 g/kg组　E.五指毛桃水提物
300g/kg组
　表 2　　　五指毛桃水提物对 DMF组小鼠组织病理学的影响
组别 组织损伤分级- + ++ +++
C57BL/6小鼠
正常对照组 5 0 0 0
DMF组 0 0 0 5
DMF+五指毛桃水提物 100 g/kg 0 0 4 1
DMF+五指毛桃水提物 200 g/kg 3 2 0 0
DMF+五指毛桃水提物 300 g/kg 4 1 0 0
ICR小鼠
正常对照组 7 0 0 0
DMF组 0 0 0 7
DMF+五指毛桃水提物 100 g/kg 0 0 4 3
DMF+五指毛桃水提物 200 g/kg 4 3 0 0
DMF+五指毛桃水提物 300 g/kg 6 1 0 0
2.3.2　肝组织病理图象处理定量分析结果:数据
表明 ,损伤面积随剂量增加而减少 。ICR小鼠各剂
量之间以及各剂量组与 DMF组之间的效应差异具
有统计学意义。 C57BL/6小鼠各剂量组与 DMF组
之间的效应差异具有统计学意义 ,中 、高剂量组与低
剂量组之间的效应差异有统计学意义 ,但高 、中剂量
组之间的差异没统计学意义 。与 DMF组比较 ,
C57BL/6小鼠和 ICR小鼠各剂量组的肝病理损伤
范围均减小 ,存在量效关系(表 3)。
3　讨论
本研究结果表明 , DMF在 C57BL/6小鼠及 ICR
小鼠中均能引起血清 ALT、AST及 LDH活性的明显
　表 3　 肝组织病理图象处理定量分析结果
组别 损伤面积比例(%)
C57BL/6小鼠
正常对照组 　　 0
DMF组 60.41±10.47
DMF+五指毛桃水提物 100 g/kg 51.11±13.59＊＊
DMF+五指毛桃水提物 200 g/kg 37.15±15.40＊＊
DMF+五指毛桃水提物 300 g/kg 19.40±9.01＊＊
ICR小鼠
正常对照组 　　 0
DMF组 66.20±11.35
DMF+五指毛桃水提物 100 g/kg 53.28±14.51＊＊
DMF+五指毛桃水提物 200 g/kg 17.73±8.46＊＊
DMF+五指毛桃水提物 300 g/kg 17.65±8.32＊＊
升高 ,肝细胞明显变性坏死 ,可引起小鼠严重的急性
肝损伤。本课题组成功建立急性 DMF肝损伤模型 ,
为筛选拮抗 DMF肝损伤药物奠定了坚实的基础。
　　五指毛桃水提物能明显降低 DMF所致小鼠肝
损伤后血清 ALT、AST和 LDH活性急剧升高;减轻
肝细胞变性 、坏死及炎症浸润等病变 ,且在两种小鼠
中均能取得相似的效果 ,表明其保护作用具有普遍
性 ,且这种保护作用存在量效关系。在 ICR小鼠 ,
中 、高剂量效果差异无统计学意义 ,已经接近正常水
平。五指毛桃水提物对 DMF所致的小鼠急性肝损
伤有明显的保护作用 ,作为针对 DMF肝毒性的保肝
药物具有良好的开发前景。五指毛桃在广东地区还
是一种常用的煲汤食材 ,故亦具有保健食品开发前
·1367·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 9期 2008年 9月
景 。但目前五指毛桃抗 DMF肝损伤的药效物质基
础尚不十分明确 , 且无质量控制方法。有研究表明
五指毛桃水煎剂主要活性成分补骨脂素 ,能够显著
降低由可卡因引起的小鼠血清 ALT、AST及 LDH升
高 [ 8] 。其抗 DMF作用的活性物质有待进一步研究
确定 ,以期找到其发挥作用的活性物质 , 并对其进
行质量控制 , 为对其进一步开发利用提供依据。
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(2007-11-27收稿)
五行汤抗肿瘤及经钙离子介导的促肿瘤细胞凋亡作用
莫　非 1, 2 ,胡晶莹 2 ,甘　愉2 ,赵仰星 2 ,赵新泰 2＊
(1.复旦大学研究生院 ,上海 200032;2.上海市肿瘤研究所 , 上海 200032)
　　摘要　目的:明确五行汤的抗肿瘤作用并初步探讨其机制。方法:不同浓度五行汤处理培养肿瘤细胞 , MTT
检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测细胞 DNA变化;电镜观察细胞形态变化;特异
性荧光探针检测胞浆钙离子浓度变化。结果:五行汤对多种肿瘤细胞生长有较特异的抑制作用;五行汤处理后的
SGC-7901细胞经流式细胞仪检测出现亚二倍体峰 , 并呈时间-浓度依赖性;琼脂糖凝胶电泳呈现的 DNALadder;电
镜显示五行汤处理后的 SGC-7901细胞呈现凋亡特征;Fluo-3 AM染色荧光显微镜观察到胞浆钙离子浓度升高;胞
内钙离子拮抗剂 BaptaAM可以明显降低五行汤处理后 SGC-7901细胞的凋亡率 , 且对细胞的保护作用呈浓度依赖
性。结论:五行汤有较明确的抑制肿瘤细胞生长作用 , 可能通过钙离子介导的肿瘤细胞凋亡发挥作用。
关键词　五行汤;细胞凋亡;钙离子
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)09-1368-05
TheAnti-tumourEffectofWuxingSoupanditsMechanisminInducing
ApoptosisofTumourCelsMediatedbyCalcium
MOFei1, 2 , HUJing-ying2 , GANYu2 , ZHAOYang-xing2 , ZHAOXin-Tai2
(1.GraduateschoolofFudanUniversity, Shanghai200032, China;2.ShanghaiCancerInstitue, Shanghai200032, China)
Abstract　Objective:Toconfirmtheanti-cancereffectandmechanismofWuxingsoup.Methods:Inhibitionofcelulargrowthun-
derWuxingsouptreatmentwasobservedbyMTT;Apoptosiswasdetectedbygelelectrophoresis, transmissionelectronmicroscopyand
FACS;Theconcentrationofcalciumwasmeasuredbyfluorescenceprobe.Results:AfterSGC-7901cellbeingtreatedbyWuxingsoup,
itshowedthat:1)Wuxingsoupcouldspecificalyinhibitcancercellsproliferationinatimeanddosedependentmanner;2)Typical
apoptoticmorphologicalchangesandDNAladderofSGC-7901 cellswereobserved;3)calciuminhibitorBaptaAMcouldreducetheap-
optoticrateandprotectSGC-7901 cellsinadosedependentmanner.Conclusion:Wuxingsouphasanefectiveinhibitiononcancer
cels, andcaninduceSGC-7901 celstoapoptosisbycalcium.
Keywords　Wuxingsoup;Apoptosis;Calciumion
＊通讯作者:赵新泰 , Tel:021-64437025, E-mail:xtzhao@sci.shmu.edu.cn。
·1368· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 9期 2008年 9月