全 文 ：obvious differences between both of them． Methods:Using xylene-induced ear edema in mice and carrageenan-induced paw edema in mice，
acetic acid-induced writhing test mode in mice，and the method of pentobarbital sodium induced-sleep assistting Mongolian medicine，the
effects of anti-inflammatory，analgesic and sedative were observed with the Gardenia fine powder and ultrafine powder． Ｒesults:Gardenia ul-
tramicro(1． 2g /kg)can significantly reduce the xylene-induced ear edema in mice(inhibition rate:81． 12%)and carrageenan carrageenan
paw edema in mice，and the results significantly higher than the fine powder (2． 4g /kg，inhibition rate of ear edema:50． 27%) ;The ultrami-
cro powder(2． 4g /kg)and the fine powder could significantly reduce mouse writhing(analgesic percent:42． 86%，27． 14%)and The ultrami-
cro powder(2． 4g /kg)can prolong the incubation period significantly(5min) ，but the fine powder is not obvious(3． 8min) ;All the groups of
ultramicro powder and fine powder can increase the percentage of mice felling asleep remarkably on subthreshold dose of pentobarbital sodi-
um． And the ultrafine powder is more obvious than fine powder when it＇s dose is same as the the latter or is 1 /2，1 /4 of the latter． Conclu-
sion:The Gardenia ultrafine powder and the fine have significant anti-inflammatory，analgesic，sedative effect，and the effect of the Gardenia
ultrafine powder group was more pronounced than the fine powder group at the same dose even the former was 1 /2，1 /4 of the latter．
Key words Gardenia(栀子) ;ultramicro powder;fine powder;anti-inflammatory;analgesic;sedation
五指毛桃水提物对免疫抑制小鼠细胞免疫的影响
*
杨 杰1，3，卫东锋2，王文潇3，程卫东1＊＊
(1 南方医科大学中医药学院，广州 510515;2 中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700;
3兰州大学基础医学院，兰州 730000)
摘 要 目的:研究五指毛桃水提物对免疫抑制小鼠细胞免疫的影响。方法:取小鼠 50 只，随机分为生理盐水对照组、环磷
酰胺模型组、五指毛桃水提物组(6． 6 g /kg、4． 4 g /kg、2． 2 g /kg) ，通过腹腔注射环磷酰胺制备免疫功能低下小鼠模型，连续灌胃给药
14d后，测定各组小鼠的脾脏指数、巨噬细胞吞噬功能、T淋巴细胞的增殖能力和杀伤活性、T细胞亚群比例及血清 IL-1 、INF-γ的含
量。结果:五指毛桃水提物组(6． 6 g /kg、4． 4 g /kg)可明显提高环磷酰胺免疫抑制小鼠的脾脏指数，明显增强巨噬细胞吞噬功能、T
淋巴细胞的增殖能力和杀伤活性，增加 T细胞亚群数量及 IL-1 、INF-γ的含量。结论:五指毛桃水提物能够提高免疫抑制小鼠的免
疫功能，其机制与调节机体细胞免疫作用相关。
关键词 五指毛桃;细胞免疫;白细胞介素 1β;Ⅱ型干扰素
五指毛桃为桑科榕属植物粗叶榕 Ficus hirta Vahl． 的干燥
根，常用作黄芪的替代品，故又称南芪。五指毛桃也是一种
药食两用的植物［1］，现代药理学研究表明，五指毛桃提取物能
够增强醋酸泼尼松诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能，提高小鼠
的抗应激能力［2］，为了进一步研究五指毛桃水提物增强机体免
疫力的作用机制，本实验观察了五指毛桃水提液对环磷酰胺诱
导的免疫抑制小鼠细胞免疫的影响，为五指毛桃在中医临床及
医药产品中的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 五指毛桃由南方医科大学中医药学院中药方
剂教研室程卫东教授提供。使用前将药材加入 10 倍量蒸馏水
浸泡 1． 5 h，进行煎煮，第 1 次煎 1． 5 h，第 2 次煎 1 h，第 3 次煎
0． 5 h，合并 3 次滤物，然后将药物浓缩至 4g 生药 /ml，放置 4℃
冰箱中备用。
1． 2 动物 昆明种小鼠，体质量 18 ～ 22 g，雌雄各半，清洁级，
购自兰州大学医学动物实验中心，许可证号 SCXK(甘)2009-
0004。K562 细胞株，由兰州大学实验中心提供。
1． 3 试剂 环磷酰胺粉针剂为上海华联制药公司产品，批号
20100202。EZ-SepTMMOUSE1X淋巴细胞分离物、小鼠白细胞
介素 1β(IL-1 )、Ⅱ型干扰素(INF-γ)ELISA试剂盒购于深圳达
科为生物技术有限公司;ＲPMI-1640 培养基购自恒生生物工程
有限公司;刀豆蛋白 A(Concanavalin A，ConA)、MTT为美国 sig-
ma公司生产;小鼠乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)酶
联免疫分析试剂盒购于甘肃鹏程生物科技发展有限公司;FT-
TC-抗小鼠 CD3、PE /Cy5-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠 CD8 单克隆抗
体为 Bio-legend产品;NP40 为上海碧云天公司产品。
1． 4 仪器 流式细胞仪(美国贝克曼 COULTEＲ 公司，型号
Epics XL) ;680 型酶联仪(美国 Bio-Ｒad 公司) ;超纯水机(艾科
浦，型号 AF2-0502-U) ;CO2 细胞培养箱(日本 SANYO公司)。
1． 5 方法 小鼠 50 只经适应性饲养 1 周后随机分为 5 组:生
理盐水对照组、环磷酰胺组、五指毛桃高、中、低剂量组。除对照
组外其余各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺 50 mg /kg，连续 7d，制
备免疫抑制小鼠模型［3］。造模成功后，五指毛桃各组给药剂量
参照文献［4］方法，将药物的临床使用剂量通过剂量折算表换算
为小鼠的给药剂量，即五指毛桃高、中、低剂量组分别按 6． 6、4．
4、2． 2 g (生药)/kg给小鼠灌胃，对照组与模型组灌服等量生理
盐水，每日 1 次，连续 14d。
111中药药理与临床 2015;31(6)
* 基金项目:国家自然科学基金面上项目(81373806) ;甘肃省中医药管理局普通课题(GZK －2012 － 43) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2015.06.033
1． 5． 1 脾脏指数测定 末次给药后次日，称取小鼠体重，眼
球摘除取血后处死小鼠，无菌取胸腺和脾脏，称取胸腺和脾脏
质量，计算小鼠胸腺和脾脏脏器指数。
1． 5． 2 巨噬细胞吞噬功能测定 在用药的第 13、14 天，各组
小鼠腹腔注射 6%的无菌淀粉肉汤 1 ml /只，1h 后，眼眶静脉丛
采血处死小鼠，腹腔注入 2 ml ＲPMI-1640 培养物，轻揉腹部
5min后打开腹腔，用毛细吸管收集腹腔液，离心洗涤 2 次，用
1ml完全 ＲPMI-1640 培养物重悬，调整细胞浓度为 2 × 106 个 /
mL，混匀后取细胞悬液 100 μl置于 96 孔细胞板中，置 37℃，5%
CO2 培养箱中孵育。2h 后取出，弃上清，每孔加入 100 μl 0．
073%中性红溶液，继续培养。同样条件下作用 3h之后，再用不
含小牛血清的 ＲPMI-1640 培养物清洗 3 遍，加入细胞裂解液
(无水乙醇∶ 0． 1mol /L 冰乙酸 = 1:1)100 μl /孔，放置 4℃冰箱
过夜，在酶标仪 540 nm处测光密度 D(λ)值。
1． 5． 3 脾脏淋巴细胞悬液的制备及脾淋巴细胞增殖反应的测
定 按 EZ-SepTMMOUSE1X 淋巴细胞分离物说明书操作:将
200 目尼龙网平铺于装有 4 mL EZ-SepTMMOUSE1X淋巴细胞分
离物(使用前平衡至室温并摇匀)的无菌组织培养皿内。将无
菌条件下摘取的脾脏置于尼龙网中，用一个 10 ml 无菌注射器
内芯研压脾脏，使分散出来的单个细胞透过尼龙网进入淋巴细
胞分离液中。将淋巴细胞分离液立即转移到 15 ml 离心管，加
盖放置，最后各加入 200 μl 1640 培养液，形成界面。2500 rpm
离心 30min后淋巴细胞在 1640 培养液下面覆盖。吸出淋巴细
胞，置于 15 ml 离心管，再加入 10 ml1640 培养液，吹打混匀，
1000 rpm离心 10 min，倾去上清，加入 1 ml1640 培养液。细胞
计数后调整至实验所需浓度。将制备的脾淋巴细胞悬液调整
细胞浓度为 1 × 107 个 /ml，加入 96 孔培养板中，每孔 100 μl。
每个样本设 6 个复孔，其中 3 孔各加 ConA(终浓度为 5 μg /ml)
100 μl，另外 3 孔不加 ConA，并用完全 ＲPMI-1640 做空白对照。
置 37℃，5%CO2培养箱内培养 68 h后取出，加入终浓度为 5 g /L
的 MTT10 μl /孔，继续培养 4 h。培养结束后，每孔加入 100 μl
10%的 SDS，混匀，37℃放置过夜，于酶标仪 570 nm波长处测定
每孔的 D(λ)值，按如下公式计算刺激指数:刺激指数 = D(λ)
实验孔 /D(λ)对照孔。
1． 5． 4 脾淋巴细胞杀伤活性测定 取制备好的脾淋巴细胞悬
液，调整细胞浓度至 5 × 106 个 /ml 了。实验前 24h 将 K562 细
胞(靶细胞)传代培养洗涤后，与脾淋巴细胞共同培养 22h，LDH
测定严格按 ELISA试剂盒说明书进行操作，在酶标仪 450 nm波
长处测定各实验孔的 D(λ)值，按如下公式计算脾淋巴细胞杀
伤活计算公式如下:杀伤活性 = (反应孔 D(λ)－自然释放孔 D
(λ) ) (最大释放孔 D(λ)－自然释放孔 D(λ) )× 100%。
1． 5． 5 T淋巴细胞亚群比例的测定 将制备好的脾细胞悬液
调整细胞浓度至 1 × 107 个 /ml，分别取细胞悬液 100 μl(含 1 ×
106 个细胞) ，加 FITC-抗小鼠 CD3 1 μl、PE /Cy5-抗小鼠 CD4 1．
25 μl、PE-抗小鼠 CD8 1． 25 μl，轻轻旋转混合，4℃冰箱避光孵
育 30 min，PBS洗涤细胞 1 次，2300 rpm 离心 5 min，去上清，于
沉淀细胞内加 500 μl PBS，轻轻吹打混匀，上流式细胞仪进行检
测。
1． 5． 6 血清 IL-1β和 INF-γ含量的测定 各组小鼠采集眼眶
静脉丛血液后，放置 3 h，使血清充分析出，1500 rpm 离心 10
min，收集血清。血清中 IL-1β 和 INF-γ 含量严格按 IL-1β 和
INF-γ试剂盒说明书进行操作，在酶标仪 450 nm 波长处测定各
孔的 D(λ)值并绘制标准曲线，以 ng /L为单位，计算其含量。
2 结果
2． 1 五指毛桃水提物对免疫抑制小鼠胸腺和脾脏指数的影响
与对照组比较，环磷酰胺组小鼠的胸腺和脾脏指数显著降低。
与环磷酰胺组比较，五指毛桃水提物 6． 6g /kg 剂量组能显著提
高环磷酰胺免疫抑制小鼠的胸腺指数。与环磷酰胺组比较，五
指毛桃水提物 6． 6g /kg、4． 4 g /kg剂量组能够明显提高环磷酰胺
免疫抑制小鼠的脾脏指数，且 6． 6g /kg剂量组的作用效果较强，
见表 1。
表 1 五指毛桃水提物对小鼠胸腺和脾脏指数的影响(珋x ± s)
组别
鼠数
(只)
剂量
(g /kg)
胸腺指数
(mg /g)
脾脏指数
(mg /g)
空白对照 10 1． 17 ± 0． 07＊＊ 5． 32 ± 0． 53＊＊
环磷酰胺 9 0． 65 ± 0． 05 2． 71 ± 0． 13
五指毛桃 10 6． 6 0． 95 ± 0． 06＊＊ 4． 92 ± 0． 29＊＊
五指毛桃 9 4． 4 0． 84 ± 0． 09 4． 03 ± 0． 21*
五指毛桃 10 2． 2 0． 70 ± 0． 04 3． 54 ± 0． 18
与环磷酰胺组比较 * P ＜0． 05，＊＊ P ＜0． 01 (下同)
2． 2 五指毛桃水提物对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 与对
照组比较，环磷酰胺组巨噬细胞吞噬功能明显降低。与环磷酰
胺组比较，五指毛桃水提物 6． 6g /kg、4． 4 g /kg 剂量组均能明显
改善环磷酰胺诱导的小鼠巨噬细胞吞噬功能的降低，且 4． 4g /
kg剂量组的作用效果较好，见表 2。
表 2 五指毛桃水提物对巨噬细胞吞噬功能的影响(珋x ± s)
组别
鼠数
(只)
剂量
(g /kg)
吞噬中性红
D(λ)540nm
空白对照 10 1． 52 ± 0． 14＊＊
环磷酰胺 9 0． 78 ± 0． 04
五指毛桃 10 6． 6 1． 14 ± 0． 05*
五指毛桃 9 4． 4 1． 27 ± 0． 06＊＊
五指毛桃 10 2． 2 0． 92 ± 0． 04
2． 3 五指毛桃水提物对脾淋巴细胞增殖功能和杀伤活性的影
响 与对照组比较，环磷酰胺组脾淋巴细胞增殖功能和杀伤活
性显著降低。与环磷酰胺组比较，五指毛桃水提物 6． 6g /kg、4．
4g /kg剂量组均能明显提高环磷酰胺免疫抑制小鼠的脾淋巴细
胞增殖能力，且 4． 4g /kg剂量组的作用效果较好;五指毛桃水提
物 6． 6g /kg、4． 4g /kg剂量组均能显著提高环磷酰胺免疫抑制小
鼠的脾淋巴细胞杀伤活性，且二者相比无显著性差异，见表 3。
表 3 五指毛桃水提物对脾淋巴细胞增殖功能和和杀伤活性的影
响(珋x ± s)
组别
鼠数
(只)
剂量
(mg /g)
淋巴细胞增殖功能
刺激指数
杀伤活性
(%)
空白对照 10 1． 33 ± 0． 05＊＊ 20． 13 ± 1． 08＊＊
环磷酰胺 9 1． 06 ± 0． 05 7． 52 ± 0． 33
五指毛桃 10 6． 6 1． 15 ± 0． 02* 17． 65 ± 0． 66＊＊
五指毛桃 9 4． 4 1． 28 ± 0． 03＊＊ 15． 42 ± 0． 71＊＊
五指毛桃 10 2． 2 1． 09 ± 0． 03 10． 17 ± 0． 45
2． 4 五指毛桃水提物对 T淋巴细胞亚群的影响 与对照组比
较，环磷酰胺组小鼠 CD4 +和 CD8 + T 淋巴细胞均显著减少，且
CD8 + T淋巴细胞的下降趋势更为明显，以至 CD4 +和 CD8 + T淋
巴细胞比值增加。与环磷酰胺组比较，五指毛桃水提物 6． 6g /
kg、4． 4g /kg剂量组的 CD4 +和 CD8 + T 淋巴细胞亚群数量均有
不同程度的增加，且 4． 4g /kg剂量组的作用效果较明显，见表 4。
211 中药药理与临床 2015;31(6)
表 4 五指毛桃水提物对免疫抑制小鼠 T细胞亚群的影响(珋x ± s)
组别
鼠数
(只)
剂量
(g /kg)
CD4 +
(%)
CD8 +
(%)
CD4 + /CD8 +
空白对照 10 38． 61 ± 1． 02＊＊ 27． 74 ± 1． 16＊＊ 1． 41 ± 0． 07＊＊
环磷酰胺 9 32． 15 ± 0． 93 13． 65 ± 0． 92 2． 47 ± 0． 21
五指毛桃 10 6． 6 35． 12 ± 0． 85 * 22． 65 ± 0． 68＊＊ 1． 56 ± 0． 03＊＊
五指毛桃 9 4． 4 36． 81 ± 0． 92＊＊ 25． 55 ± 1． 10＊＊ 1． 45 ± 0． 04＊＊
五指毛桃 10 2． 2 33． 73 ± 0． 91 16． 27 ± 0． 81 2． 10 ± 0． 06
2． 5 五指毛桃水提物对血清 IL-1 和 INF-γ含量的影响 与对
照组比较，环磷酰胺组血清 IL-1 显著减少，INF-γ 水平显著降
低。与环磷酰胺组比较，五指毛桃水提物 6． 6g /kg、4． 4g /kg 剂
量组均能明显增加环磷酰胺免疫抑制小鼠的血清 IL-1 含量及
血清 INF-γ水平，且 4． 4g /kg剂量组的作用效果较好，见表 5。
表 5 五指毛桃水提物对巨噬细胞诱生 IL-1 和血清 INF-γ 的影响
(珋x ± s)
组别
鼠数
(只)
剂量
(g /kg)
IL-1
(ng /L)
INF-γ
(ng /L)
空白对照 10 120． 3 ± 5． 4＊＊ 524． 6 ± 12． 3＊＊
环磷酰胺 9 69． 5 ± 2． 2 356． 8 ± 12． 1
五指毛桃 10 6． 6 103． 1 ± 3． 8＊＊ 398． 8 ± 11． 7*
五指毛桃 9 4． 4 112． 2 ± 3． 3＊＊ 411． 9 ± 11． 4＊＊
五指毛桃 10 2． 2 87． 2 ± 3． 1 363． 5 ± 16． 4
3 讨论
近年来对五指毛桃的研究不断深入，除具有补气健脾、镇
咳平喘等作用外，已有研究证明五指毛桃还可升高环磷酰胺所
致的免疫功能低下小鼠模型的胸腺、脾脏指数及血清溶血素水
平［5，6］，但对其作用的细胞机制尚不清楚。因此，研究五指毛桃
水提物对免疫抑制小鼠细胞免疫的影响，可为中医临床用药提
供理论依据。
本实验免疫抑制模型的建立采用对小鼠腹腔注射环磷酰
胺的方法，此法为免疫性实验研究的常用方法。试剂环磷酰胺
是一种细胞毒性烷化剂，常用于一些肿瘤和自身免疫系统疾病
的治疗［7］，在细胞水平上可干扰 DNA 和 ＲNA 的功能，抑制
DNA合成。本实验注射环磷酰胺后，各项免疫指标均有所下
降，表明造模成功。胸腺和脾脏是人体重要的外周免疫器官，其
质量受免疫细胞增殖和分化的影响，因此胸腺和脾脏指数的高
低与机体免疫功能的强弱密切相关。本实验五指毛桃水提物
可不同程度地提高小鼠胸腺和脾脏指数，说明五指毛桃可保护
免疫器官，具有免疫增强作用，同时相对高剂量的五指毛桃水
提物对胸腺和脾脏的作用效果较好。
巨噬细胞和 T淋巴细胞都来源于骨髓的多能干细胞，是机
体参与免疫反应的重要细胞，其功能状态强弱与否直接影响免
疫应答的强弱程度。其中巨噬细胞在机体固有免疫(人体的第
一、二道免疫屏障)和适应性免疫功能中扮演着极其重要的角
色，具有吞噬、杀伤、递呈抗原，分泌生物活性物质、调控机体免
疫以及抑制肿瘤等多种功能。中性红法是检测巨噬细胞吞噬
功能的常用方法，其原理是通过测定巨噬细胞对中性红的吞噬
量来反映巨噬细胞的吞噬能力，具有简便、快速、经济、准确等优
点，是快速筛选巨噬细胞吞噬功能调节成分较为可靠的细胞模
型［8］。本实验中，五指毛桃水提物(6． 6 g /kg、4． 4 g /kg)能够明
显提高被环磷酰胺抑制的小鼠巨噬细胞吞噬功能，表现出良好
的促免疫作用。巨噬细胞除有非特异性吞噬多种抗原的作用
外还可分泌 IL-1 ［9］，IL-1 又以自分泌或旁分泌的形式作用于巨
噬细胞，参与固有免疫应答过程，故测定单核巨噬细胞吞噬能力
和血清 IL-1 水平可以反映机体固有免疫功能的强弱。本实验
中五指毛桃水提物能使免疫抑制小鼠 IL-1 水平明显增加，说明
五指毛桃能够影响巨噬细胞的分泌功能，从而增强机体的固有
免疫应答能力。CD4 +和 CD8 +是 T淋巴细胞的两个亚群，其中
CD4 + T淋巴细胞表型多样、功能复杂，主要通过激活自身分泌
的细胞因子和趋化因子实现其免疫作用;CD8 + T淋巴细胞则直
接杀伤靶抗原，对被病毒感染的细胞以及肿瘤细胞有重要的杀
伤作用，是早期免疫反应的主要细胞［10］。两者相互协调和制
约，共同参与机体的免疫应答过程。INF-γ 是 Th1 淋巴细胞亚
群中的一种细胞，可促进 CD8 + T 淋巴细胞的增殖和分化及
CD4 + T淋巴细胞向 Th1 细胞的转化，还可活化巨噬细胞，从而
增强机体的免疫防御功能。有研究表明［11］，免疫力低下小鼠模
型的 CD4 +、CD8 +细胞水平和 INF-γ水平都低表达，本实验结果
与其相符，说明造模成功。五指毛桃水提物(6． 6 g /kg、4． 4 g /
kg)作用于此模型后 CD4 +、CD8 +的数量和 INF-γ的水平明显上
调，说明五指毛桃水提物能使免疫抑制小鼠 T 淋巴细胞亚群的
数量有不同程度的提高，从而恢复机体的免疫平衡状态。
本研究结果表明，五指毛桃水提物可明显提高免疫抑制小
鼠机体的免疫力，其机制与调节细胞免疫能力相关。在临床免
疫系统疾病治疗方面可以将五指毛桃列入免疫调节类药物行
列，为医药领域开发和利用中药五指毛桃的资源提供科学依据。
但其能否在复方中很好地发挥细胞免疫调节作用以及在人体
中发挥该作用的有效剂量仍需要进一步探索及证实。
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311中药药理与临床 2015;31(6)
Effects of aqueous extract of Ficus hirta on cellular immunity in immunosuppressed mice
Yang Jie1，3，Wei Dongfeng2，Wang Wenxiao3，Cheng Weidong1
(1 Institute of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515;2 Institute of Basic Ｒesearch in Clinical
Medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700;3 School of Basic Medical Science，Lanzhou 730000)
Objective:To study the effects of aqueous extracts of Ficus hirta on cellular immunity in immunosuppressed mice． Methods:Fifty Kun-
ming mice of clean grade were randomized into five groups with 10 in each group，including control group，cyclophosphamide model group
and Ficus hirta with 6． 6g /kg，4． 4g /kg and 2． 2g /kg groups． The immunosuppression mice models were induced by cyclophosphamide． The
mice were treated for sequential 14 days． The spleen index，phagocytosis of the macrophage，the proliferation ability and killing activity of T
cells，the ratio of T lymphocyte subgroup and content of IL-1 and INF-γ of serum were determined． Ｒesults:Aqueous extracts of Ficus hirta
groups(6． 6g /kg and 4． 4g /kg)can significantly increase the spleen index，phagocytosis of the macrophage，proliferation ability and kill ac-
tivity of T cells，quantity of T lymphocyte subgroup and the content of IL-1β and INF-γ (P ＜ 0． 01 or P ＜ 0． 05)． Conclusion:The improve-
ment of aqueous extracts of Ficus hirta immune function may be involved in moderation of cellular immune function in immunosuppression
mice．
Key words Ficus hirta (五指毛桃) ;immunosuppressive mice;cellular immunity;IL-1 ;INF-γ
miＲ-7 介导加味四君子汤含药血清抑制 B16 恶性黑色素瘤细胞侵袭
和相关蛋白 MMP2 和 MMP9 表达的影响*
周昕欣1，2，杨关林2＊＊
(1辽宁中医药大学附属第二医院皮肤科，沈阳 110034;2辽宁中医药大学，沈阳 110101)
摘 要 目的:研究 miＲ-7 是否介导加味四君子汤含药血清对恶性黑色素瘤细胞 B16 迁移侵袭及其相关机制的研究。方法:
37℃、5%CO2 的恒温培养箱中培养 B16 恶性黑色素瘤细胞，收集对数期细胞，等效剂量为 9． 22 g /kg的加味四君子汤终浓度 10%的
小鼠含药血清，作用 24 h。实验分为空白对照组、血清对照组、转染阴性对照组、miＲ-7 模拟物组和 miＲ-7 抑制物组，每组含 5 个样
本数，应用 Ｒeal- time PCＲ法检测 miＲ-7 模拟物和 miＲ-7 抑制物的转染效率、应用 Transwell实验检测 B16 细胞侵袭能力，应用 Ｒeal-
time PCＲ和Western Blot方法检测基质金属蛋白酶(metalloprotease，MMP)2 和 9 基因的 mＲNA和蛋白的表达。结果:miＲ-7 模拟物
和 miＲ-7 抑制物成功转染到 B16 恶性黑色素瘤细胞中，与空白对照组、血清对照组和阴性对照组相比，miＲ-7 模拟物组(Ｒelative
Conc值为 8． 47 ± 0． 28)和 miＲ-7 抑制物组(Ｒelative Conc值为 0． 19 ± 0． 01)分别显著升高和显著降低 miＲ-7 表达;与空白对照组和
血清对照组及阴性对照组相比，miＲ-7 模拟物组的细胞的侵袭能力显著降低，miＲ-7 抑制物组的细胞的迁移侵袭能力显著升高;与
空白对照组和血清对照组及阴性对照组相比，miＲ-7 模拟物组 MMP2 和 MMP9mＲNA 和蛋白表达水平显著降低，miＲ-7 抑制物组
MMP2 和 MMP9mＲNA和蛋白表达水平显著升高。结论:miＲ-7 介导加味四君子汤含药血清抑制 B16 恶性黑色素瘤细胞迁移侵袭过
程，并且能够显著降低与 B16 恶性黑色素瘤细胞侵袭相关的蛋白 MMP2 和 MMP9 表达，提示 miＲ-7 可能是加味四君子汤抗恶性黑
色素瘤的重要分子之一。
关键词 加味四君子汤;miＲ-7;侵袭;MMP;B16 恶性黑色素瘤细胞
在前期工作中，我们已证实加味四君子汤含药血清抑制
B16 恶性黑色素瘤细胞增殖，促进 B16 恶性黑色素瘤细胞的凋
亡［1］，miＲ-7 介导此过程［2］;我们的前期工作同样证明加味四君
子汤含药血清能显著降低 B16 恶性黑色素瘤细胞侵袭，并且能
够显著降低与 B16 恶性黑色素瘤细胞侵袭相关的蛋白 MMP2
和 MMP9 表达［3］，那么此过程是否同样由 miＲ-7 介导，引起课
题组的兴趣，根据文献和我们的前期工作基础，我们推测 miＲ-7
介导加味四君子汤含药血清抑制 B16 恶性黑色素瘤细胞侵袭
和相关蛋白 MMP2 和 MMP9 表达，为此本研究首先建立体外
B16恶性黑色素细胞瘤模型，利用血清药理学方法给药，分别转
染 miＲ-7 模拟物和 miＲ-7 抑制物到 B16 恶性黑色素瘤细胞，
Ｒeal-time PCＲ法检测转染效率、细胞划痕实验、Transwell 实验
检测 B16 细胞迁移侵袭能力，应用 Western Blot 方法检测与细
胞迁移侵袭相关 MMP2 和 MMP9 蛋白的表达。
411 中药药理与临床 2015;31(6)
* 基金项目:辽宁省科技计划项目(NO． 2013226012) ;中国博士后科学基金面上项目(NO． 2014M551120) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2015.06.034