全 文 ：第1期
收稿日期:2007-08-10;修回2007-10-06
基金项目:广东省科技攻关项目(2006B35502008);仲恺农业技术学院大学生创新基金资助
作者简介:刘展眉(1963-),女,副教授,在职博士生,主要从事天然产物化学研究,(电子信箱)liuzhanm@21cn.com。
用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等有效成分
刘展眉, 何洁萍, 钟雪莲
(仲恺农业技术学院化学与化工系,广东 广州 510225)
摘 要:利用聚酰胺柱层析法,用3倍床体积的60%的乙醇洗脱,可以较有效地从喜树果中提取白桦脂酸,这是一种简单、易行、环
保、有效的提取白桦脂酸的方法,是目前有效提取白桦脂酸的最简单的方法,本方法还能同时分离提取喜树碱,羟基喜树碱等有效成分。
关键词:聚酰胺柱层析; 白桦脂酸; 羟基喜树碱; 喜树碱
中图分类号:X383 文献标识码:A 文章编号:1003-6504(2008)01-0139-03
BetulinicAcidandTheirActiveAbstractedfromCamptotheca
AcuminatabyEnvironmentalMethod
LIUZhan-mei, HEJie-ping, ZHONGXue-lian
(DepartmentofChemicalEngineering,ZhongkaiUniversityofAgricultureandTechnology,Guangzhou510225,China)
Abstracts:Polyamidewith60%alcoholtoabstractbetulinicacidfromCamptothecaAcuminatabycolumnchromatography
isasimple,easyandenvironmentalefectivemethod.Themethodcanabstractandseparatecamptothecinandhydroxycamp-
tothecinaswel.
Keywords:columnchromatography;betulinicacid;camptothecin;hydroxycamptothecin
喜树 (CamptothecaacuminateDecaisne,简称
CPT),珙桐科(Nyssaceae)喜树属(Camptotheca)多年
生植物,落叶大乔木。1966年美国的MonroeE.wal
从喜树的皮中分离出喜树碱,经肿瘤试验证明这种色
氨酸一萜烯类生物碱具有抗癌活性,从而引起人们的
广泛关注。喜树果中已经发现有20多种有特殊药效
的化合物,其中白桦脂酸是一种三萜类化合物,具有
抗肿瘤细胞增长的作用,并且在抗艾滋病方面还有许
多新的作用机制,这使白桦脂酸成为很有开发前景的
药物,引起了人们的广泛关注[1]。Franoise等发现一些
新的桦木酸的X-氨基链烷酸衍生物具有抗艾滋病的
作用,它可以抑制在CEM4和MT-4细胞中的HIV-1
发生细胞病变,并且不会影响到 HIV-1逆转录酶或
蛋白酶的活性,这是目前所发现的其他抗艾滋病药物
不具备的药理活性,因此具有重要意义。
目前白桦脂酸的制备方法主要有三个途径:
(1)直接提取法。其中CarcacheBlancoZiziphusspina
等是目前此途径的主要的代表[2],主要是从其他植物
的树叶树枝中提取,原料消耗量大,成本高,所得到的
白桦脂酸杂质含量会比较高,且不易除去。
(2)一步合成法。一步合成法是将桦木醇的提取
和桦木酸的制备同步进行,它通过将植物浸软而使提
取和转化在一步内完成,可以用氯仿、二氯甲烷、二乙
基醚、四氢呋喃、丙酮、吡啶和 DMF等有机溶剂来提
取桦木醇,同时将硝酸铁、硝酸铜、硝酸铬、硝酸锌等
氧化剂附着在硅胶、氧化铝、胶岭石K-10等固体载体
上对提取物进行氧化,最后得到白桦脂酸。此法所制
得的混合物产品杂质的种类和含量很多,给分离纯化
带来困难,从而导致产率下降。
(3)半合成法。这种方法是从植物中提取出桦木
醇,然后由桦木醇经过一系列化学反应制得桦木酸。
由于桦木醇在植物中的含量比桦木酸高,并且经过化
学合成的方法制得的桦木酸产率较高,分离提纯也比
较容易,所以这种方法得到广泛的应用。但这种方法
反应路线较长,反应条件苛刻,有异构体的产生,不适
于大规模生产。
本文首次探讨了利用聚酰胺提取方法初步确定
了用聚酰胺提取白桦脂酸的有效方法,并且能同时分
离提取喜树碱,羟基喜树碱等有效成分。这对于充分
利用我国喜树资源有重要意义。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1 材料
喜树的干种子,实验所用的聚酰胺由南开大学
EnvironmentalScience&Technology
第31卷 第1期
2008年1月
Vol.31 NO.1
Jan. 2008
第31卷
化工厂和台州市路桥四甲生化塑料厂提供,乙醇、
甲醇(分析纯和高效液相色谱纯)、磷酸和三乙胺
(分析纯)。
1.1.2实验仪器
SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵、旋转蒸发器 RE-
52AA、UV-1型三用紫外分 析仪、LQC·DECA×P液
相色谱-质谱连用仪,带电喷雾离子源;大气压化学电
离源,质量范围 50~2000μ,Thermo Finnign公司(美
国) ,北京分析仪器厂 SY-5000高效液相色谱仪 ,
C18柱。
1.2方法与实验
1.2.1实验预处理
解吸液:乙醇:水=3:2;展开剂:乙醇:水=3:
2;试样的预处理:称取 500g喜树果粉碎并用工业乙
醇浸泡过面,浸泡5d,过滤后得澄清浸出液。聚酰胺的
预处理:取250mL的聚酰胺置于500mL的大烧杯中,
加入95%的优质工业乙醇至300mL,在电热套中煮沸
0.5h后取出,离心除去剩余的乙醇,再次加入 95%的
优质工业乙醇至300mL再煮沸 0.5h,即可离心除去
剩余乙醇装入层析柱。湿法装柱。
1.2.2聚酰胺柱的吸附与解吸
(1)吸附:对粉碎的喜果浸泡得出的清液浓缩,
用旋转蒸发器对其进行浓缩,浓缩至 150~200mL左
右,避光低温保存,取大约 5mL浓缩液上聚酰胺柱,
缓慢加入使其充分渗透进入聚酰胺柱中,液面与聚
酰胺齐平。
(2)解吸:浓缩液被聚酰胺充分吸收后,用60%的
乙醇解吸(刚开始解吸液逐滴加入,浓缩液被充分吸
收后可以增大加入量) ,用三角瓶分段收集并编号,每
瓶收集约50mL,收集的过柱液用旋转蒸发器浓缩至溶
液约1mL左右,最后解吸液的用量大约为3倍床体积。
1.2.3试样的检测
(1)聚酰胺薄膜层析检测:聚酰胺薄膜、展开剂
60%乙醇。
(2)HPLC色谱条件:色谱柱为ZorbaxC18柱(4.6mm×
150mm) ,流动相为[V甲醇:V磷酸 0.025mol/L=55:45(混
合后用三乙胺调 pH3.0～3.2)]:甲醇=9:1,检测波长
360nm,流速0.8mL/min,柱温25℃。
(3)LC-ESI-MS检测:离子化源:(±)ESI;加热毛
细管温度:300℃;氮气(N2)流速:30流量单位(arbitrary
units);辅助气(N2)流速:30流量单位(arbitrary units);
喷雾电压:4kV。同时采用一级全扫描质谱及 MS/MS
两种方式检测,扫描范围150~550,MS/MS的相对碰
撞能为30%。
1.2.4分离方法
分段收集解吸液洗脱出的组分,经薄板初步检测
进行分类后再通过HPLC、LC-ESI-MS检测、选择性
离子流色谱(SIM)检测进行进一步的测定,证实此洗
脱方法能较好分离喜树果中有效成分。
2 结果与讨论
2.1聚酰胺柱浓缩液的初步检测及分类
用玻璃毛细管吸取少量从聚酰胺柱中洗出的浓
缩液点板(点板注意:点板要等第一滴干了后再点第
二滴),一块板点三个样,用乙醇:水=3:2(体积比)
的展开剂进行展开层析,展层完毕取出聚酰胺薄膜,
于阴凉通风处自然干燥,待展开剂完全挥发后,在紫
外灯下观察(波长为 254nm),根据荧光点不同高度进
行初步的分类,见表1。
从表1可看出,在聚酰胺薄板上可先后看到5种
荧光色斑,5种色斑之间达到一定的分离,其中亮黄色
荧光在聚酰胺薄板上显现较慢,并且不需UV-1型三
用紫外分 析仪也可观察其斑点。
UV-1型三用紫外分析仪下观察的照片组,见图
1,图1是部分试样的聚酰胺薄板在UV-1型三用紫
外分析仪下观察的照片,图1(a)是 14-28号试样,即
“□”标记的物质;图 1(b)是 29~44号试样,即“□”
“◎”“△”标记的物质;图 1(c)是 45~67号试样,即
“△”“○”标记的物质;图 1(d)是 65~91号试样,即
“○”标记的物质。
表1 各分段收集液荧光标记
Table 1 The fluorescent sign in diffierent samples collected in stages
编号 14~28 29~44 45~47 48~64 65~91
☆ 黄绿色 √
□ 紫蓝色 √ √
◎ 亮黄色 √ √
△ 蓝紫色 √ √ √
○ 紫白色 √ √
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2.2 白桦脂酸的确定
通过 LC-ESI-MS法对 65~91组样品检测:65~
91组物质的试样的LC-ESI-MS图。
图 2是 65~91试样纯化物的 HPLC-ESI-MS检
测谱图,该样品中主要含有分子量分别为455.6,456.9
的物质,纯度高。物质通过与文献分子量的对比,初步
认为是白桦脂酸。
用HPLC色谱法检测45~47组试样,以喜树碱标
准品对照,可确定 45~47组试样为喜树碱,且证明该
分离方法分离效果好,目标产物纯度高。
聚酰胺薄板层析检测,初步判定 65~91组样品
(即“○”)结晶含有少量羟基喜树碱。
用 LC-ESI-MS选择性离子扫描方式(SIM)测定
65~91组样品结晶(即“○”),确定含有羟基喜树碱。
2.3 分离工艺
喜树果粉碎→喜树果粉→浸滤液→浓缩液→滤
液→上聚酰胺柱→解吸液洗脱 →分成5段→旋转蒸
发仪蒸发浓缩初步检测→固形物→纯化→HPLC、
LC-ESI-MS检测、选择性离子流色谱(SIM)检测→
分段物重结晶→喜树碱[△(蓝紫荧光)]、白桦脂酸及
羟基喜树碱[○(紫白荧光)]。
3 结论
目前提取白桦脂酸及喜树碱的方法中所使用的
试剂大多数都是毒性较大的药品,如氯仿,石油醚,甲
醇等,其过程繁琐或设备要求高以至生产成本高。利
用聚酰胺柱层析法从喜树果中提取白桦脂酸及喜树
碱等有效成分,所需设备简单,用乙醇洗脱使整个提
取分离过程环保(全过程只需要用60%乙醇)、解吸剂
用量少(3BV可以洗脱出所有物质,物质分段明显)、
简单易行,乙醇可循环使用,从而大大降低了成本而
且适用于较大规模的制备,具有较高的实用价值。
本实验的聚酰胺柱层析分离法对白桦脂酸及喜
树碱的分离效果好,而且对其他有效成分的分离作用
也很明显,本实验有较高的实际意义。
[参考文献]
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