全 文 ：［收稿日期］ 20100511(005)
［基金项目］ 广西自然科学基金项目(桂科自 0542100)
［第一作者］ 阎莉，医学硕士，讲师，研究方向为中药、民族药的活性成分筛选和研发，Tel:13878868617，E-mail:mimaotoo@ 163. com
［通讯作者］ * 郑作文，Tel:13877173116，E-mail:zzw_nn@ 163. com
广西藤茶双氢杨梅树皮素对小鼠肝细胞凋亡的影响
阎莉1，卫智权2，郑作文1* ，郝二伟1
(1. 广西中医学院，南宁 530001;2. 广西医科大学，南宁 530021)
［摘要］ 目的:探讨藤茶双氢杨梅树皮素(Vine tea dihydromyricetin，VTD)对撤除苯巴比妥钠(sodium Phenobarbital，SP)
诱导的小鼠肝细胞凋亡的影响，揭示其抗肝损伤作用的机制。方法:采用撤除 SP 诱导肝细胞凋亡的小鼠模型，予以高、低剂量
VTD(200，50 mg·kg － 1)ig，并设置正常对照、SP 不撤对照及 SP 撤除模型组。以 HE 染色镜检观察肝组织病理形态变化，以流式
细胞术、细胞原位 TUNEL 法检测肝细胞凋亡率，评估 VTD 对肝细胞凋亡的影响。结果:HE 染色镜检可见正常对照组与 SP 不
撤对照组肝组织形态大致正常，SP 撤除模型组与 VTD 高、低剂量组均见不同程度肝细胞凋亡。流式细胞术分析、细胞原位
TUNEL 法检测结果显示，VTD 低剂量组肝细胞凋亡率分别为 17. 7%，2. 9%，均显著低于 SP 撤除模型组(分别为 27. 4%，
4. 5%)，差异具有统计学意义(P < 0. 01)。VTD 高剂量组肝细胞凋亡率与 SP 撤除模型组比较其差异无统计学意义。结论:50
mg·kg － 1·d － 1的 VTD ig 可显著抑制 SP 撤除诱导的小鼠肝细胞凋亡，提示抑制肝细胞凋亡可能为 VTD 肝保护作用的机制之一。
［关键词］ 藤茶;双氢杨梅树皮素;肝细胞凋亡
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1005-9903(2010)16-0102-03
Effects of Dihydromyricetin from Guangxi Vine Tea on
Hepatocelluar Apoptosis in Mice
YAN Li1，WEI Zhi-quan2，ZHENG Zuo-wen1* ，HAO Er-wei1
(1. Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001，China;
2. Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)
［Abstract］ Objective:To study the inhibitory effect of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata
(Hand-Mazz)W. T. Wang (Vine tea dihydromyricetin，VTD)on hepatocyte apoptosis induced by the cessation of
phenobarbital sodium (SP) injection treatment in mice，and to explore its mechanism of hepatoprotective effect.
Method:The mouse model with hepatocellular apoptosis induced by removing SP was established. The mice were
randomly divided into blanks，negative controls，positive controls and test groups. Test groups of mice were given
intragastric gavage of 200，50 mg·kg － 1 VTD. Hepatic apoptosis was detected by flow cytometry，terminal
deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end(TUNEL)，and pathological changes in the liver tissue were observed
after HE staining. Result:The histopathological analysis of the liver showed normal liver morphology in blanks and
negative controls，and varying degrees of liver cell apoptosis in positive controls and low-and high-dose VTD groups.
The outcome from flow cytometry and TUNEL showed hepatocelluar apoptosis rate in low dose of VTD group were
17. 7%，2. 9% respectively. All of these values were lower than those in positive controls (P < 0. 01). Conclusion:
The mouse hepatocellular apoptosis induced by removing SP can be markedly inhibited by treating with VTD in 50
mg·kg － 1，and it might be one of the hepatoprotective mechanisms for VTD to inhibit the hepatocelluar apoptosis.
［Key words］ vine tea;dihydromyricetin;hepatocelluar apoptosis
·201·
第 16 卷第 16 期
2010 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 16
Nov.，2010
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2010.16.041
藤茶系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄
Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W. T. wang 的
嫩茎叶［1］。全株药用，味甘、淡，性凉，具有清热解
毒、祛风湿、强筋骨等功效［2］，为瑶族民间常用的草
药之一。多项药理学研究表明，藤茶有保护肝脏、抑
制人乙型肝炎病毒等作用［3-4］。本实验首次采用撤除
苯巴比妥钠(Sodium phenobarbital，SP)诱导肝细胞凋
亡的小鼠模型，探讨藤茶双氢杨梅树皮素(Vine tea
dihydromyrcetin，VTD)对肝细胞凋亡的影响，以进一
步揭示其肝保护作用的机制。
1 材料
1. 1 药物 VTD 由广西中医学院抗病毒实验中心
提供，纯度 > 90%，批号 20080910。
1. 2 动物 SPF 级昆明小鼠，体重 18 ～ 22 g，雌雄
各半。由广西壮族自治区药品检验所提供，许可证
号 SCXK 桂 2003-0003。
1. 3 试剂 注射用 SP(上海新亚药业有限公司，批
号 061204)，细胞凋亡 PI 染色试剂盒(南京凯基生
物科技发展有限公司)，RNA 酶 (美国 Sigma)，
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(Roche 公司)，其余试
剂均为国产分析纯。
2 方法
2. 1 动物分组及处理 50 只小鼠分为 5 组，每组
10 只，分别为正常对照组，细胞凋亡阴性对照组(SP
不撤除对照组，即阴性组)，细胞凋亡模型组(SP 撤
除对照组，即模型组)和 VTD 高、低剂量组(200，50
mg·kg － 1)。正常组、阴性组动物分别 ip 无菌生理盐
水和 0. 5% SP 80 mg·kg － 1，1 次 / d，连续 7 d;阳性组
和 VTD 各给药组动物均 ip 0. 5% SP 80 mg·kg － 1，1
次 / d，连续 6 d 后停药。给药组动物撤除 SP 后立即
ig 给高、低剂量的 VTD，给药容积为 20 mL·kg － 1，1
次 /6 h，共给药 6 次。撤除 SP 后 36 h 将所有小鼠脱
颈椎处死，取肝组织备检。
2. 2 HE 染色镜检 取肝组织，中性福尔马林固定，
石蜡包埋、切片，HE 染色，光镜下随机选取 10 个高
倍视野(× 400)，观察肝组织病理形态变化。
2. 3 流式细胞术分析 取小鼠肝组织，分离肝细
胞，用 PBS 洗涤细胞一次，离心(2 000 r·min － 1，5
min)，收集并调整细胞密度为 1 × 106 /mL － 1;细胞加
9 倍体积的 70%冰乙醇，于 － 20 ℃固定至少 12 h;
离心收集细胞后，用 PBS 洗涤细胞以除去乙醇，细胞
重悬于 500 μL PBS 中;加入 RNA 酶，使其终浓度为
0. 25 g·L － 1，37 ℃反应 30 min;加入 5 μL PI 室温避
光染色 30 min，于流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2. 4 TUNEL 法检测 按照 Roche Applied Science
公司 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作步骤
进行。光镜下观察，凋亡细胞胞核呈棕黄色或棕褐
色，核固缩或染色质边集。细胞核呈黄色或棕黄色
为阳性细胞(即凋亡细胞)。随机观察 10 个高倍视
野(× 400)中阳性细胞数和总细胞数，阳性细胞数占
总细胞数的比例即为肝细胞凋亡率。
2. 5 统计学处理 所有数据均以 SPSS for Windows
11. 0 统计软件包处理，计量资料以 珋x ± s 表示，各组
间均值比较采用方差分析，以 P < 0. 05 为差异有统
计学意义。
3 结果
3. 1 肝组织变化 光镜下可见正常组和阴性组肝
小叶结构大致正常，肝索肝窦较清晰，个别切片可见
肝细胞有轻、中度浊肿变性，肝细胞间散在个别淋巴
细胞浸润，无坏死。模型组肝小叶结构尚可辩认，肝
索肝窦结构不清，大部分肝细胞中、重度浊肿变性，
以中度为主，有散在灶状淋巴细胞浸润和点状坏死，
汇管区较多炎症细胞浸润，可见细胞核染色质浓缩、
边集呈新月体样，胞质明显嗜酸性，有或没有胞质的
浓缩的凋亡细胞。VTD 高剂量组肝小叶结构欠清，肝
细胞轻、中度浊肿变性，以中度浊肿变性为主，少部分
重度浊肿变性，肝细胞间散在淋巴细胞浸润，无坏死，
汇管区少量炎细胞浸润，凋亡细胞可见。VTD 低剂量
组肝小叶结构大致正常，大部分肝索肝窦结构较清
晰，肝细胞部分轻度浊肿变性，少量中度浊肿变性，肝
细胞间散在淋巴细胞浸润，无坏死，汇管区少量炎细
胞浸润，可见少量的凋亡细胞。结果见图 1。
图 1 藤茶双氢杨梅树皮素对撤除苯巴比妥钠诱导肝细胞凋亡小鼠肝脏病理变化的影响(HE 染色，× 200)
A.正常组;B. SP 不撤除组;C.撤除 SP 组;D.撤除 SP + VTD 200 mg·kg － 1;E.撤除 SP + VTD 50 mg·kg － 1
·301·
第 16 卷第 16 期
2010 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 16
Nov.，2010
3. 2 肝细胞凋亡率 流式细胞仪分析表明，SP 撤
除模型组凋亡率明显高于正常组及阴性组(P <
0. 01)，提示 SP 撤除凋亡模型复制成功。与 SP 撤除
模型组相比较，VTD 低剂量组肝细胞凋亡率降低，差
异有统计学意义(P < 0. 01)，VTD 高剂量组肝细胞
凋亡率虽低于 SP 撤除模型组，但差异无统计学意
义。提示 VTD 能降低 SP 撤除引起的肝细胞凋亡，
特别是在给药剂量为 50 mg·kg － 1时效果显著。结果
见表 1。
表 1 流式细胞术检测肝细胞凋亡率(珋x ± s，n = 10)
组别 剂量 /mg·kg － 1 凋亡率 /%
正常对照 － 11. 8 ± 5. 661)
SP 不撤除 － 16. 9 ± 5. 571)
SP 撤除 － 27. 4 ± 7. 54
VTD 200 22. 2 ± 8. 64
50 17. 7 ± 9. 181)
注:与 SP 撤除组比较1)P < 0. 01 (表 2 同)。
3. 3 细胞原位 TUNEL 法检测肝细胞凋亡率 模型
组可见单个散在分布的凋亡细胞。正常组、阴性组
及 VTD 低剂量组则无明显凋亡现象，凋亡细胞数与
模型组比较，差异有统计学意义(P < 0. 01)。VTD
高剂量组仍有散在凋亡小体，凋亡细胞数与模型组
比较，差异无统计学意义。结果见表 2。
表 2 细胞原位 TUNEL 法检测细胞凋亡率(珋x ± s，n = 10)
组别 剂量 /mg·kg － 1 凋亡率 /%
正常对照 － 2. 2 ± 1. 931)
SP 不撤除 － 2. 5 ± 0. 971)
SP 撤除 － 4. 5 ± 1. 27
VTD 200 4. 0 ± 0. 94
50 2. 9 ± 0. 991)
4 讨论
肝细胞凋亡异常增多是多种肝脏疾病的重要发
病机制之一，其直接后果是肝细胞数量减少，肝功能
受损［5-8］。因此，抑制肝细胞凋亡异常增多也是研究
肝细胞保护药物时常用的重要作用靶点与考察药物
保护肝细胞能力的指标之一。以体外细胞培养方法
研究肝细胞凋亡存在一些固有缺陷，如细胞的膜蛋
白改变、缺乏细胞间以及细胞与间质间相互作用、细
胞反应性变化等，与机体发生急慢性肝病时在整体
环境中发生的肝细胞凋亡存在较大差别，降低了研
究结果的可信性。与之相比较，采用整体动物模型
则能够更好地模拟急慢性肝病时肝细胞凋亡的情
况，故本研究采用了苯巴比妥撤除诱导的肝细胞凋
亡小鼠模型。苯巴比妥能够明显加强肝细胞增殖，
停药后肝细胞增殖迅速减少，并伴随典型的肝细胞
凋亡过程［8］。本研究也表明该模型稳定性好，重复
性强，是研究肝细胞凋亡的较好的整体动物模型。
藤茶在广西民间常用于治疗各种肝病，VTD 是藤
茶的主要有效成分，已经证实 VTD 具有抑制乙肝病
毒、减轻肝脏组织学损伤、保护肝功能等作用。本研
究结果显示，VTD 以 50 mg·kg － 1剂量给药时能够显著
抑制苯巴比妥撤除诱导的小鼠肝细胞凋亡，提示抑制
肝细胞凋亡可能是 VTD 减轻肝脏组织学损伤、保护
肝功能等药理效应的重要机制之一;而在 200 mg·
kg － 1剂量给药时则未能观察到类似的结果，提示 VTD
的给药剂量与其抑制肝细胞凋亡的作用之间的关系
不是简单的线性关系，可能只是在某个剂量范围之内
VTD 才具有我们期望的药理效应。鉴于肝细胞凋亡
在肝脏组织学损伤机制中的重要性，而 VTD 可能只
是在某个剂量范围之内发挥减轻肝脏组织学损伤、保
护肝细胞的药理效应，因而应当进行更为深入的量效
关系研究以及 VTD 抑制肝细胞凋亡机制研究以揭示
二者之间的复杂关系。当然，如果延长苯巴比妥撤除
后 VTD 干预时间，也许对于明确是否存在这样的非
线性量效关系更为有利，毕竟较短的药物干预时间可
能无法充分反映药物对机体的长期影响。
［参考文献］
［1］ 中国科学院植物研究所 . 中国高等植物图鉴(二册)补
编［M］.北京:科学出版社，1983:349.
［2］ 广西植物研究所 . 广西药用植物名录［M］. 南宁:广西
民族出版社，1974:202.
［3］ 钟正贤，覃洁萍，周桂芬，等 .广西藤茶总黄酮保肝作用
的实验研究［J］.广西科学，2002，9(1):57.
［4］ 郑作文 .藤茶总黄酮在 2. 2. 1. 5 细胞培养中对乙型肝
炎病毒 HBsAg、HBeAg 和 HBV-DNA 的抑制作用［J］.
山东中医杂志，2003，22(9):561.
［5］ 王俊学，王国俊，蔡雄，等 .氧化苦参碱及甘草甜素对小
鼠肝细胞凋亡的影响［J］.第二军医大学学报，1999，20
(4):222.
［6］ 李平，陈东鸿，程建峰，等.地塞米松及甘草酸对小鼠肝细
胞凋亡的影响［J］.中国药理学通报，1999，15(2):143.
［7］ 陈东鸿，李平，程建峰，等 .柴胡及甘草酸对小鼠肝细胞
凋亡的影响［J］. 第四军医大学学报，1998，19(3):
279.
［8］ Schulte H R，Timmermann T I，Barthl G，et al. DNA
synthesi apoptosis and phenotypic expression as
determinants of growth of atered foci in rat liver during
phenobarbital promotion［J］. Cancer Res，1990，50:5127.
［责任编辑 聂淑琴］
·401·
第 16 卷第 16 期
2010 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 16
Nov.，2010