全 文 ：《食品工业》2013 年第34卷第 10期 11
藤壶活性肽的制备分离及抗氧化作用研究
胡文婷1,2，邓世明2，张凯3
1. 海南大学 海洋学院 热带生物资源教育部重点实验室（海口 570228）；
2. 海南大学 海洋学院 海洋生物实验教学中心（海口 570228）；3. 海南通用康力制药有限公司（海口 570311）
摘 要 研究藤壶肉酶解制备活性多肽的工艺条件及多肽的抗氧化性能。比较风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋
白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解藤壶肉的效果, 筛选出碱性蛋白酶Alcalase作为理想水解酶; 用正交试验对该酶的
水解条件进行优化, 最终工艺条件为温度60 ℃, pH 8.5, 时间75 min, 加酶量1 000 U/g; 对最佳条件下水解条件得到的
酶解物进行超滤, 分子量小于3 kDa的组分体外抗氧化作用最好; 该组分经Sephadex G-25柱层析分离得5个组分, 抗
氧化活性主要集中在组分E和组分D。
关键词 藤壶; 酶解; 活性肽; 抗氧化
Preparation and Anti-oxidant Research of Polypeptide from Barnacle
Hu Wen-ting1,2, Deng Shi-ming2, Zhang Kai3
1. The Ministry of Education, Key Laboratory for Tropical Biological Resources, College of Marine Scienc,
Hainan University (Haikou 570228); 2. Experiment Teaching Center of Marine Biology, College of Marine
Scienc, Hainan University (Haikou 570228); 3. General&Kangli Pharmaceutical Co. (Haikou 570311)
Abstract The purpose of this study was to investigate the optimal processing conditions and antioxidant activity of the barnacle
hydrolysates, which produced by 5 different hydrolytic enzymes. According to the antioxidant activity of barnacle hydrolysates,
alcalase, whose hydrolysates had higher scavenging activity, had been chosen to be the ideal hydrolytic enzymes from the 5 applied
enzymes such as fl avourzyme, neutral protease, alcalase, papain, pepsin. Furthermore, the optimal hydrolysis of alcalase was
determined with orthogonal design L9(3
4). The result showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were temperature 60 ℃,
time duration 75 min, pH 8.5, 1 000 U/g of amounts of enzyme. The fraction with molecular weights under 3 kDa after ultra fi ltration
showed high antioxidative activities in vitro. It was fractionized on Sephadex G-25 column, resulting in 5 elution peaks, and
antioxidative peptides mainly in fraction E and fraction D.
Keywords barnacle; enzymatic hydrolysis; bioactive peptides; anti-oxidant
藤壶隶属于甲壳纲，藤壶科，是一种在海域中附
生性极强的生物，生长速度极快，对渔船作业、贝类
养殖等均造成危害，因此常将其当作为污损生物清
除。然而其包裹在钙质壳中的软体部分肉质鲜美，蛋
白质含量较高[1]，具有很高的开发利用价值。日本已
将其引入人工养殖，现今已发展成年养殖产量达十多
万吨以上的产业[2]。近年来许多研究表明，蛋白质酶
解有助于改善其理化和功能特性，尤其是海洋生物来
总的来说，通过本试验证明红蚂蚁提取物能够抑制番
茄叶霉菌、玉米禾谷菌（禾谷镰刀菌）、玉米弯孢霉
菌的生长，但不能起杀菌作用。这3种供试霉菌对提
取物的敏感程度从大到小依次为番茄叶霉菌、玉米弯
孢霉菌、玉米禾谷菌。
在抑制真菌试验操作过程中发现，空白对照常常
被空气中细菌或其它菌种污染，而处理组却很少发生
这种现象，因而可以认为长白山红蚂蚁提取物对除霉
菌以外的其它菌种也可能存在抑制作用。
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工艺技术
《食品工业》2013 年第34卷第 10 期 12
源的蛋白酶解后得到的小肽类物质，往往功能特异、
结构新颖[3]。本研究以海南省北部海域常见的鳞笠藤
壶为原料，采用生物技术手段，对藤壶肉进行蛋白酶
水解并初步分离，得到了具有抗氧化作用的活性小
肽。得到的藤壶活性肽可作为一种功能性食品进行开
发利用，为合理、高效地开发藤壶，变害为利提供了
理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试验材料
鳞笠藤壶：采自海南省北部海区，去壳后取软
体部分；碱性蛋白酶（Alca la se）、风味蛋白酶
（Flavourzyme）、中性蛋白酶（Neutrase）：丹麦
Novo公司；胃蛋白酶（Pepsin）：国药集团化学试剂
有限公司；木瓜蛋白酶（Papain）、1,1-二苯基-2-苦
基苯肼（DPPH）：Sigma；Sephadex G-25：Pharmacia公
司；邻苯三酚、番红花红：进口分装；H2O2、FeSO4
等：国产分析纯。
1.2 主要仪器设备
HICATHI 20PR-52D 高速冷冻离心机，752型分
光光度计，FJ-200 高速分散均质机，SHA-C 水浴恒
温振荡器，PHS-3C 精密PH计，CAV214C 分析天平，
TDU-1200 冷冻干燥机，MSC300 超滤杯。
1.3 试验方法
1.3.1 蛋白质水解液制备
取一定量藤壶肉，加入3倍体积的蒸馏水，用高
速组织捣碎机匀浆，转移到锥形瓶中，调pH后加入一
定量的蛋白酶，放入恒温水槽恒温水解一定时间，反
应中持续滴加浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液维持反应
体系pH，取出酶解液后沸水浴5 min。冷却后离心
（5 000 r/min，30 min），上清液冷藏或冻干备用。
1.3.2 抗氧化活性测定
羟自由基清除活性的测定参照陈学勤等[4]的方
法。超氧阴离子清除活性的测定参照MARKLUND等[5]
的方法。DPPH自由基清除活性的测定参照XIE等[6]的
方法。脂质过氧化反应的抑制作用参照秦卫东等[7]的
方法。
1.3.3 超滤膜分离
将500 g藤壶肉用最佳酶解条件进行酶解，上清液
稀释5倍后，先经过双层滤纸布氏抽滤，将酶解液通
过3 kDa，5 kDa，10 kDa的3种膜进行超滤，得到4种
不同分子量的酶解液，试验采用超滤杯设备，板式膜
组件，膜材料为亲水性聚醚砜膜。
1.3.4 凝胶过滤层析
将样品用超纯水溶解后上样于Sephadex G-25凝胶
过滤柱（柱规格16 mm×600 mm），用10%乙醇以流
速0.5 mL/min洗脱，每10 min收集l管，紫外检测仪测
其波长280 nm处的吸光度。
2 结果与分析
2.1 酶制剂的选择
取藤壶肉5.0 g加水15 mL，分别加入1 000 U/g的碱
性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木
瓜蛋白酶，在适宜的酶解条件下进行酶解。然后测定
每一种酶在不同酶解时间的酶解物稀释2倍后测定对
羟自由基的清除率。未经酶解的藤壶肉匀浆上清液本
身对羟自由基的清除率为31.7%。
表1 选用的蛋白酶的适宜酶解条件
酶类 pH 温度/℃
中性蛋白酶 7.0 45
碱性蛋白酶 8.0 55
胃蛋白酶 2.0 37
木瓜蛋白酶 6.5 65
风味蛋白酶 5.5 50
以羟自由基清除率作为评价标准，各蛋白酶的水
解效果见图1，对羟自由基清除率最大的是采用碱性
蛋白酶水解90 min时的水解物，为66.27%。各酶水解
物由于水解时间不同，清除自由基的能力出现交叉现
象，随着酶解时间的增加，各蛋白酶水解产物对羟自
由基的清除能力总体趋势表现为先上升后下降。这可
能是由于蛋白酶作用位点的位置及多少不同造成的。
由于碱性蛋白酶在含有同样酶活单位的条件下，水解
时间较短时水解物对羟自由基的清除能力即可达到较
高水平，水解效率最好，并且需要时间最短，适宜工
业化生产，因此选其作为酶解藤壶肉的酶源。
图1 不同酶及酶解时间酶解物对羟自由基的清除
作用
2.2 酶解条件优化
在确定了酶种类和预处理条件的基础上，按照碱
性蛋白酶的酶解因数（见表2）进行L9(34)正交试验。
试验结果表明（见表3），碱性蛋白酶Alcalase酶解
物对羟自由基清除作用最强的酶解条件为A3B3C1D2，
即温度60 ℃，pH 8.5，时间75 min，加酶量1 000 U/
g。极差分析表明，影响酶解物羟自由基清除作用的
各因素排列顺序为：C＞B＞A＞D，即酶解时间影响
最大，加酶量影响最小。因正交试验表中无此条件，
所以对此条件下酶解物的清除效果进行了测定，清除
率为79.28%。
2.3 超滤分离
用3 kDa，5 kDa，10 kDa的3种膜进行超滤，得到
＞10 kDa，10 kDa～5 kDa，5 kDa～3 kDa和＜3 kDa 4
基金项目: 教育部“长江学者和创新团队发展计划
创新团队”（IRT1123）, 海南大学青年基金项目
（qnjj1153）
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种不同分子量的酶解液，即组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分
Ⅲ、组分Ⅳ。冻干后分别用蒸馏水稀释为10 mg/mL，
进而进行体外抗氧化性测定。
2.4 体外抗氧化能力
由图2可知，羟自由基清除能力、超氧阴离子清
除能力和抑制脂质过氧化能力均为组分Ⅳ最高分别
为82.91%，73.62%，64.48%，DPPH自由基清除能力
组分Ⅲ最高，为55.62%，组分Ⅳ仅次于组分Ⅲ，为
50.35%。而组分Ⅲ对超氧阴离子和羟自由基的清除能
力远低于组分Ⅳ。综合分析表明，组分Ⅳ抗氧化能力
最强，是主要的抗氧化肽。
表2 因素和水平排列
水平 因素A 温度/℃ B pH C 时间/min D 加酶量/U·g-1
1 50 7.5 75 600
2 55 8.0 90 1 000
3 60 8.5 105 1 400
表3 正交设计及结果
试验号 A B C D 清除率/%
1 1 1 1 1 69.24
2 1 2 2 2 64.72
3 1 3 3 3 65.38
4 2 1 2 3 62.56
5 2 2 3 4 61.24
6 2 3 1 2 72.13
7 3 1 3 2 63.25
8 3 2 1 3 74.86
9 3 3 2 1 67.33
K1 66.447 65.017 72.007 65.937
K2 65.310 66.940 64.870 66.700
K3 68.480 68.280 63.290 67.600
R 3.170 3.263 8.787 1.663
图2 碱性蛋白酶水解液各组分的抗氧化能力
2.5 凝胶柱层析
将超滤得到的组分Ⅳ经Sephadex G-25柱层析分
离，结果见图3，可以看出，经超滤后的藤壶肉酶解
液组分Ⅳ，经洗脱后出现5个峰，分别为A，B，C，
D，E。对每个峰分别收集、冷冻干燥后测定其清除
羟自由基活性，其中E 组分的活性最高为86.31%，其
次为D 组分的活性72.57%，A组分活性为52.46%，B
组分的活性为34.86%，C组分几乎没有活性。由此可
知，经3 kDa滤膜超滤后的肽抗氧化活性主要存在于D
峰和E峰。Sephadex G-25的分离范围是1～5 kDa，从
各峰的保留时间推测，具有抗氧化活性的主要是一些
分子量较小的肽，并且D峰和E峰的峰形较宽，因此
可能是由多种类型结构相近的肽组成。
图3 Sephadex G-25凝胶过滤曲线
3 结论
1) 试验选用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白
酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶对藤壶软体部分进行酶法
水解，结果表明碱性蛋白酶的水解效果最佳，可以获
得具有较高抗氧化能力的酶解物。采用正交试验方法
确定了碱性蛋白酶水解藤壶肉蛋白质制备抗氧化肽的
最佳水解条件，即温度60 ℃，pH 8.5，时间75 min，
加酶量1 000 U/g。
2) 经过上述条件处理后的水解液经3 kDa，5
kDa，10 kDa的3种膜进行超滤处理后，对清除羟自由
基、超氧阴离子、DPPH自由基的能力和抑制脂质过
氧化能力进行评测，抗氧化活性主要存在于分子量
＜3 kDa的超滤液中。用Sephadex G-50进行分离，E峰
和D峰的活性较强，抗氧化肽主要集中在小分子量范
围内。
3) 试验提出的工艺，充分利用了海洋污损生物藤
壶中的蛋白质资源，变害为利制备出高质量的蛋白质
水解物，具有清除自由基、抗氧化的能力，为藤壶的
深入开发应用提供了新的思路和理论依据。
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