全 文 ：欧李仁蛋白多肽的制备
张 玲，*王晓闻
（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）
摘要：以欧李仁蛋白为底物，采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶进行分步复合酶解，以水解度为指标，确
定其分步复合酶解的条件。结果表明，碱性蛋白酶的最适条件为底物质量分数5%，酶添加量为1.5%（基于底物蛋
白质的质量），温度50℃，pH值10；中性蛋白酶添加量为5%，温度40℃，pH值7；酸性蛋白酶添加量5%，温度
50℃，pH值5。分别水解30 min，经这3种酶酶解后其多肽质量浓度可达27.566 1 mg/mL。
关键词：欧李仁蛋白；多肽；酶解；水解度
中图分类号：TQ931 文献标志码：A doi：10.3969/jissn.1671-9646（X）.2011.10.010
PreparationofPeptidesDerivedfromCerasusHumilisKernelProtein
ZhangLing， *WangXiaowen
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agriculture University，Taigu，Shanxi 030801，China）
Abstract：Using Cerasus Humilis Kernel protein as substrate，the substrate is hydrolyzed by Alcalase，Neutrase and acid
proteinase in turn，the effects of substrate concentration，enzyme concentration and time of enzymatic hydrolysis on hydrolysis
degree in Cerasus Humilis Kernel protein are studied in this paper．The optimal conditions of hydrolysis are obtained by
experiment as follows：substrate concentration 5%，Alcalase enzyme concentration 1.5% of substrate，pH 10，temperature
50℃，Neutrase proteinase concentration 5%，pH 7，temperature 40℃，acid proteinase concentration 5%，pH 5，
temperature 50℃ .The substrate is hydrolyzed for 30 min respectively in optimum conditions of these enzymes.The
concentration of peptide is up to 27.566 1 mg/mL after hydrolysis of these three enzymes.
Keywords：Cerasus Humilis Kernel protein；proteinase；peptides；hydrolysis
欧李（Prunus humilis bunge） 又名钙果，为蔷薇
科樱桃属的一种极矮的野生灌木果树的果实。欧李
中维生素、矿物质及蛋白质的营养成分丰富，尤其
是钙含量在所有经济型水果中最高，故又叫钙果。
据测定，果实中钙的质量分数可达到70 mg/100 g鲜
果，因此有绿色的“天然钙粉”的美誉[1]。欧李主要
分布在我国的山西、辽宁、内蒙古、河北等省
（区），是果药兼用的野生树种，原产于我国三北地
区。其茎叶、果实、根皮具有很高的经济利用和药
用价值[2]。欧李果仁中饱和脂肪酸质量分数较低，蛋
白质质量分数可达26.7%，远高于杏仁、扁桃仁、核
桃中蛋白的质量分数，其所含人体必需氨基酸占总
氨基酸的24%[3]。欧李仁中优质蛋白质含量丰富，是
制备活性多肽的极好原料，而且生物活性多肽作为
食品，不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，
还能起到调节人体生理功能的作用。近年来，科学
研究发现生物体内存在多种具有生理活性的多肽物
质，它们具有不同的结构和功能活性。人体摄入的
蛋白质经酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。
几乎所有细胞都受多肽调节，它具有调节机体生理
功能和为机体提供营养的双重功效[4]。人们已从包括
人、植物、动物在内的各种生物体中分离出各类活
性多肽，并且对多肽的性质、制备方法、分离纯化
方法、鉴定技术、功能活性及应用等方面进行了大
量的研究，并取得了一定的成效。因此活性多肽的
开发越来越受到世界各国的关注。但由于多肽研究
水平仍处于初级阶段，技术水平有待提高，这极大
限制了蛋白质资源的有效利用。因此，进一步研究
活性多肽的制备方法，明确其保健功能的作用机理，
开发出有价值的保健功能食品，对提高各种来源蛋
白质深加工的转化率和利用率具有重要的现实意义，
同时也为综合利用蛋白质资源提供了一条有效途径。
收稿日期：2010-05-12
作者简介：张 玲（1982- ），女，山西人，在读硕士，研究方向：食品营养与安全。
*为通讯作者：王晓闻，女，教授，在职博士，研究方向：食品营养与安全。
文章编号：1671-9646（2011） 10-0041-05
第10期（总第259期） 农产品加工·学刊 No.10
2011年10月 Academic Periodical of Farm Products Processing Oct.
农产品加工·学刊 2011年第10期
本研究用榨油后的欧李仁粕为原料进行蛋白的
提取，然后利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白
酶对欧李仁蛋白进行分步复合酶解，确定其酶解条
件，为进一步的工业生产和科学研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
欧李仁粕，山西农业大学果园提供；蛋白酶，
北京奥博星生物技术有限责任公司提供；其他试剂
均为分析纯。
1.2 主要仪器
电热恒温水浴锅，北京化玻联仪器有限公司提供；
78—1 型磁力加热搅拌器，杭州仪表电机厂产品；
LG—2.4A低温高速离心机，北京医用离心机厂产品；
pHS—3C型酸度计，上海虹艺仪器仪表有限公司提供。
1.3 水解度的测定
采用甲醛滴定法[5]。甲醛可与游离氨基结合，形
成 -NH-CH2O ，-N（CH2-OH）2等羟甲基衍生物，
使 -NH3+上的 H+游离出来，这样就可用碱滴定
-NH3+释放出的H+，测出氨基氮，从而计算游离氨
基的含量。
取酶解液5 mL，加入60 mL蒸馏水置于100 mL
烧杯中。开动磁力搅拌器，用浓度0.1 mol/L的氢氧
化钠标准溶液滴定至 pH 值为 8.20 时，停止搅拌，
记录此时消耗氢氧化钠的体积数 V0。加入中性甲醛
20 mL，用磁力搅拌器混合均匀，继续滴定至pH值
9.2，记下加入甲醛后消耗的氢氧化钠溶液体积V，
同时做空白试验。水解度计算公式为：
DH值=[0.1×（V-V0）]/(7.8×m×ω) .
式中：m——5 mL酶解液中的底物的质量，g；
ω——底物蛋白质的质量分数，%；
0.1——标准氢氧化钠溶液浓度，mol/L；
7.8——1 g蛋白质中肽键的摩尔数，mmol/g。
1.4 多肽含量的测定
采用双缩脲法[9-10]。用酪蛋白作为标准绘制标准
曲线，根据标准曲线确定试样中的肽质量浓度。称取
酪蛋白标准物 0.500 0 g，溶解定容至 100 mL，即
5 mg/mL，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，
1.4，1.6，1.8 mL标准溶液于试管中放置30 min后，
在波长540 nm处比色。根据光密度值与多肽质量浓
度绘制标准曲线。
多肽标准曲线见图1。
1.5 酶解液多肽浓度的测定
分别吸取2 mL不同稀释度的酶解液，然后加入
4 mL双缩脲试剂，混合摇匀后，在室温的条件下放
置30 min 后，进行光密度测定，同时做空白试验。
酶解液多肽质量浓度是根据光密度值在标准曲线查
得的质量，再乘以稀释倍数得出。
1.6 欧李仁肽的制备
本试验中的材料为欧李仁粕，在制取多肽前需
要提取欧李仁蛋白，故用碱提酸沉法对材料进行蛋
白的提取[6-8]。具体提取方法如下：
欧李仁粕粉碎后用5倍水分散，用1 mol/L的标
准NaOH溶液调pH值至9.5，搅拌30 min并保持其
pH值不变，以4 000 r/min离心20 min，取上清液，
用浓度1 mol/L盐酸调pH值为4，沉淀出蛋白。室
温下以4 000 r/min离心20 min，沉淀用蒸馏水分散
并调pH值至7，冷冻干燥得蛋白。对所得蛋白进行
酶解，制备欧李仁多肽。具体方法如下：
欧李仁蛋白溶液 →预处理 →调节pH值→碱性蛋白酶水
解→灭酶 →中性蛋白酶水解→灭酶→酸性蛋白酶水解→灭
酶→ 离心分离→欧李仁肽液。
2 试验方法
本试验采用单因素方法，确定其酶解条件。
2.1 碱性蛋白酶最佳底物浓度的确定
让碱性蛋白酶先在最适条件下水解，而后再依
次加入中性蛋白酶、酸性蛋白酶，因此，只需确定
碱性蛋白酶的最适底物浓度。按酶产品说明在碱性
蛋白酶的最适温度50℃，pH值10下，配制4份底
物质量分数分别为3%，5%，7%，9%的欧李仁蛋白
溶液，然后调节这4种溶液的pH值至10，并加入
0.5% （基于底物蛋白质） 碱性 蛋 白 酶 ， 在
50℃下各自水解1 h，测定水解度DH。
2.2 碱性蛋白酶最适添加量的确定
分别配制上述2.1确定的底物浓度的欧李仁蛋白
溶液4份，调节pH值至10，分别加入0.5%，1.0%，
1.5%和2.0%（基于底物蛋白质） 的碱性蛋白酶，在
50℃下水解1 h，测定水解度，水解过程不控制水
解液pH值。
2.3 碱性蛋白酶水解过程中DH，pH值的变化
配制上述 2.1 确定的底物浓度的欧李仁蛋白溶
液，调节pH值为10，酶添加量为试验确定的最适
添加量，在50℃下水解，每隔 10 min 记录水解过
程中的DH值和pH值的变化。
图1 酪蛋白标准曲线
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2.4 中性蛋白酶最适添加量
分别配制上述2.1确定的底物质量分数的欧李仁
蛋白溶液，分别加入1%，3%，5%，7%（基于底物
蛋白质） 的中性蛋白酶，调pH值为7，在40℃水
解1 h，测定水解度。
2.5 中性蛋白酶水解过程中DH值和pH值的变化
配制上述 2.1 确定的底物浓度的欧李仁蛋白溶
液，调节pH值为7，酶添加量为试验确定的最适添
加量，在40℃下水解，每隔10 min记录水解过程中
的DH值和pH值的变化。
2.6 酸性蛋白酶最适添加量
分别配置上述2.1确定的底物质量分数的欧李仁
蛋白溶液，分别加入1%，3%，5%，7%（基于底物
蛋白质） 的酸性蛋白酶，调pH值为5，在50℃水
解1 h，测定水解度。
2.7 酸性蛋白酶水解过程中DH值和pH值的变化
配制上述 2.1 确定的底物浓度的欧李仁蛋白溶
液，调节pH值为5，酶添加量为试验确定的最适添
加量，在50℃下水解，每隔10 min记录水解过程中
的DH值和pH值的变化。
3 结果与分析
3.1 碱性蛋白酶最适底物质量浓度的确定
底物质量浓度对Alcalase 碱性蛋白酶水解效果的
影响见图2。
由图 2 可知，当底物质量浓度为 5 mg/mL 时，
欧李仁蛋白经碱性蛋白酶水解1 h后的水解度最大。
当底物质量浓度减小时，水解度也随着下降；而当
底物质量浓度增大时，其水解度下降，这是因为较
高的底物质量浓度通常产生一种相对较黏的浆液会
限制酶的扩散，从而影响酶的水解。故确定底物质
量浓度为5 mg/mL。
3.2 酶最适添加量的确定
3.2.1 碱性蛋白酶最适添加量的确定
碱性蛋白酶质量分数对水解度的影响见图3。
图3 碱性蛋白酶添加量对水解度的影响
由图3可知，随酶质量分数的增多，其水解度
呈上升趋势，当酶的质量分数增到1.5%时水解度达
到10.2%，之后当再增加酶量时其水解度没有明显变
化。因为酶量已经达到饱和，故确定最适酶最适质
量分数为1.5%。
3.2.2 中性蛋白酶最适添加量的确定
中性蛋白酶质量分数对水解度影响见图4。
图4 中性蛋白酶质量分数对水解度影响
由图4可知，随着酶量的增加，其水解度也在
逐渐增大，当添加量达 5%时，水解度几乎不再变
化，因此确定其添加量为5%。
3.2.3 酸性蛋白酶最适添加量的确定
碱性蛋白酶质量分数对水解度的影响见图5。
图5 碱性蛋白酶质量分数对水解度的影响
张 玲，等：欧李仁蛋白多肽的制备
图2 底物质量浓度对Alcalase 碱性蛋白酶水解效果的影响
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农产品加工·学刊 2011年第10期
由图5 得知，随酶的增加水解度也在增大，当
酶量为5%时，水解度达到最大，当再增加酶量时，
其水解度不再增加，故选5%为最适质量分数。
3.3 各种酶水解过程中DH值和pH值的变化
3.3.1 碱性蛋白酶水解过程中DH，pH值的变化
碱性蛋白酶水解过程中水解度的变化见图6，碱
性蛋白酶水解过程中pH值的变化见图7。
图6 碱性蛋白酶水解过程中水解度的变化
图7 碱性蛋白酶水解过程中pH值的变化
由图6和图7可知，欧李仁蛋白在碱性蛋白酶作
用下，随时间的延长其水解度增加，尤其是在水解初
期，水解度的增加迅速，几乎是直线上升。水解
20 min后水解度就达到9.82%，之后的反应较慢，水
解度几乎不再变化。原因跟水解过程中溶液的pH值
的变化分不开，碱性蛋白酶的最佳pH值作用范围是
8~10，水解30 min后，溶液的pH值下降到了 7.4，
这样碱性蛋白酶的活力就必然会降低，最终完全受
抑制。
3.3.2 中性蛋白酶水解过程中DH值和pH值的变化
中性蛋白酶水解过程中水解度的变化见图8，中
性蛋白酶水解过程中pH值的变化见图9。
由图8和图9可知，中性蛋白酶水解过程中DH值
和pH值的变化比较平稳。但也是水解初期30 min之
内水解速度快，30min以后水解度没有太大变化。其
pH值从7下降到6。溶液pH值的下降逐渐偏离了酶
的最适范围，酶活受到抑制，从而影响了水解度。
图8 中性蛋白酶水解过程中水解度的变化
图9 中性蛋白酶水解过程中pH值的变化
3.3.3 酸性蛋白酶水解过程中DH值和pH值的变化
酸性蛋白酶水解过程中水解度的变化见图 10，
酸性蛋白酶水解过程中pH值的变化见图11。
图10 酸性蛋白酶水解过程中水解度的变化
从图 10 和图 11 可知，酸性酸性蛋白酶在前
30 min水解度呈上升趋势，到30 min时水解度迅速
增达到 9.17%，之后水解度反而有下降的趋势，其
pH值有缓慢增大的趋势，但变化范围较小。其原因
可能是因为溶液的pH值接近欧李仁蛋白的等电点，
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2011年第10期
蛋白质分子会沉淀，从而影响其水解。
从这3种中酶水解欧李仁蛋白的过程中水解度
的变化可知酶水解的初期酶解反应相当迅速，水解
度的快速增大都是发生在前30 min之内，这是由于
酶解初期其pH值的变化还在酶反应最适pH值范围
内，而随时间的延长酶反应过程中pH值逐渐下降以
致偏离了酶的最适范围，水解度增加缓慢。故综合
考虑，本试验选取这3种酶的水解时间都为30 min。
4 结论
本试验采用分步复合酶解，确定最适底物质量
分数为5%，碱性蛋白酶质量分数为 1.5% （基于底
物）。在50℃，pH值10下水解30 min后灭酶，然
后添加5%的中性蛋白酶；在40℃，pH值7下继续
水解30 min后灭酶，最后再添加5%的酸性蛋白酶；
在50℃，pH值5下再水解30 min灭酶。最后经这
3种酶水解后的欧李仁蛋白酶解液其多肽质量浓度可
达27.566 1 mg/mL。
5 讨论
现在，国内报道的多肽制备多为单酶和双酶法
水解，这类方法酶水解度较低，多肽得率也低。因
此，复合酶解制备多肽是工业化发展的趋势，但多
酶复合工艺作用条件复杂，影响因素较多。比如，
不同的酶其反应条件不同，不同蛋白酶对底物蛋白
水解所得的酶解物的种类和生物活性都是不同的[11]。
碱性蛋白酶对酶解羧端疏水性氨基酸有较强的专一
性。Adamson研究发现[12]，碱性蛋白酶Alcalase 可以
裂解酪蛋白中的Glu，Met，Leu，Tyr，Lys 和Gln 的
羧端肽键，而中性蛋白酶 AS1.398 水解羧基端是
Tyr，Phe，Trp 等芳香族疏水性氨基酸的肽键。本试
验选用3种酶对欧李仁蛋白进行分步复合酶解，旨
在得到多种类的小分子肽片段。
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