全 文 ：收稿日期:2015 － 09 － 03;修回日期:2016 － 06 － 24
基金项目:贵州省民族中兽药与生态畜牧业人才基地项目(黔
人领发［2013］15 号);贵州省高层次人才科研条件特助经费项
目(黔人领发［2012］3 号);贵州省铜仁市科技局科研计划项目
(铜仁市研［2012］62 号)
作者简介:韩建军(1979 － )，男，副教授，硕士，研究方向为
中药资源的开发与利用，hjjat123@ 163． com．
酶解法辅助提取地锦草中槲皮素
的工艺优选
韩建军1，2，宁 娜1，2，王德珍3，邹宗尧3
(1．铜仁职业技术学院 药学院，贵州 铜仁 554300;2．贵州省中兽药工程研究红心，
贵州 铜仁 554300;3．西南大学 药学院，重庆 400715)
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:B 文章编号:1004 － 7034(2016)10 － 0202 － 05
关键词:地锦草;槲皮素;酶解工艺;纤维素酶;回流法;响应面法
摘 要:为了研究酶解法辅助提取地锦草中槲皮素的工艺，试验采用 Box － Behnken 试验设计和响应
面法研究了纤维素酶用量、酶解温度、酶解 pH值、酶解时间对槲皮素得率的影响。结果表明:最佳酶
解提取工艺条件为纤维素酶用量 0． 6%、酶解温度 50 ℃、酶解 pH值 4． 5、酶解时间 45 min。在该酶解
条件下，槲皮素得率为 1． 87 mg /g，与理论预测值(1． 88 mg /g)的相对误差仅为 0． 63%。说明通过
Box － Behnken试验设计和响应面法得到的优化工艺参数比较准确，具有实用性。
地锦草为大戟科植物地锦(Euphorbia humifusa
Willd．)或斑地锦(Euphorbia maculata L．)的干燥全
草，其性平，味辛，具清热解毒、凉血止血之功效，主治
跌扑损伤、痈肿恶创等症［1］。地锦草含有黄酮类［2］、
鞣质［3］、三萜类［4］等化学成分，其中槲皮素是地锦草
药材的质控成分［1］。药理研究表明，槲皮素具有抗
炎［5］、抗氧化［6］、抗抑郁［7］等活性。
目前，已经报道的地锦草中槲皮素的提取方法主
要以传统的回流法［8 － 10］为主。酶解辅助提取法是指
在传统溶剂法的基础上，利用生物酶进行水解或降解
以破坏植物细胞壁的结构，降低溶剂传质阻力，加速
有效成分释放的一种提取方法，该方法具有反应条件
温和、提取效率高、条件易控等特点［11］。目前，已有
研究将酶解辅助提取法与常规回流法结合应用到钩
藤中钩藤碱［12］、透骨草中总黄酮［13］、远志中总皂
苷［14］等的提取。酶解辅助提取法在地锦草槲皮素提
取中的应用尚未见报道。因此，本试验对酶解提取槲
皮素的主要影响因素进行研究，通过响应面优化法得
到酶解辅助回流提取地锦草槲皮素的最佳工艺条件，
为槲皮素的工业化提取及相关药物的开发提供技术
支撑。
1 材料
1． 1 主要试剂
地锦草，购自成都荷花池中药材市场，经铜仁职
业技术学院药学院梁玉勇教授鉴定为大戟科植物地
锦的干燥全草;槲皮素对照品，购自中国食品药品鉴
定研究院;纤维素酶，购自宁夏夏盛实业集团有限公
司，酶活力为 11 000 U /g;水为重蒸水，甲醇为色谱
纯，其他试剂均为分析纯。
1． 2 主要仪器
高效液相色谱仪(型号为 LC － 20AT) ，购自日本
岛津公司;超声清洗机(型号为 KS － 600D) ，购自宁
波科生仪器厂;电子天平(型号为 AB － 135S) ，购自
德国梅特勒公司;旋转蒸发器(型号为 ＲE － 2000A)，
购自上海亚荣生化仪器厂;酸度计(型号为 PHS －
25) ，购自杭州亚美电子仪器厂;电热恒温水浴锅(型
号为 HH －6A)，购自北京科伟永鑫实验仪器设备厂。
2 方法
2． 1 槲皮素含量的测定
2． 1． 1 色谱条件 色谱柱为 Kromasil － C18 柱
(4． 6 mm ×150． 0 mm，5 μm);流动相为甲醇 － 0． 4%
磷酸溶液(50 ∶ 50) ;流速为 1． 0 mL /min;柱温为
25 ℃;检测波长为 360 nm;进样量为 10 μL。
该色谱条件下理论塔板数以槲皮素峰计算不低
于 2 500。在该色谱条件下测定得到的槲皮素对照品
及地锦草药材的色谱图见图 1。
2． 1． 2 线性关系的考察 精密称定槲皮素对照品
13． 5 mg，置 50 mL 容量瓶中，用 80%甲醇定容至刻
度，摇匀即得槲皮素对照品储备液(0． 27 mg /mL)。
·202·
2016(10 上):202 － 206
DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2016.1808
图 1 槲皮素对照品和地锦草药材的 HPLC色谱分析
分别精确移取槲皮素对照品储备液 0． 2，0． 4，0． 8，
1． 6，3． 2 mL转移至 10 mL 容量瓶中，并用 80%甲醇
定容至刻度，摇匀。分别精密吸取所配制的系列浓度
的对照品溶液 10 μL注入高效液相色谱仪，按照上述
色谱条件测定峰面积，并以进样浓度(X)对峰面积(Y)
进行回归，得到线性回归方程为 Y = 8 404． 24X +
117． 75，Ｒ2 =0． 999 8，表明槲皮素在 5． 4 ～ 86． 4 μg /mL
浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2． 1． 3 供试品溶液的制备 称取 10 g 地锦草药材
粉末(过 40 目筛)，在一定条件下进行酶解预处理，
然后常规回流提取，即加入 6 倍量 50%乙醇回流提
取 1． 5 h，收集提取液，减压回收乙醇后真空干燥，即
得到干燥浸膏。精密称取干燥浸膏 0． 5 g，置具塞锥
形瓶中;精密加入 80%甲醇 50 mL，称定重量，超声处
理 20 min;放冷，再称定重量，用 80%甲醇补足减失
的重量，摇匀，滤过;精密量取续滤液 20 mL，精密加
入 25%盐酸 7 mL，置 85 ℃水浴中水解 30 min;取出
迅速冷却，并转移至 50 mL 容量瓶中;加入甲醇稀释
至刻度，摇匀、滤过;取续滤液采用 HPLC 法测定，并
根据测定结果计算槲皮素得率。计算公式:槲皮素得
率 =提取得到的槲皮素质量(mg)/地锦草药材质量
(g)。参照《中华人民共和国兽药典》［1］方法进行测
定，本试验中地锦草药材槲皮素含量为 2． 01 mg /g。
2． 2 单因素试验
2． 2． 1 纤维素酶用量对槲皮素得率的影响 准确称
取 10 g地锦草粉末，置装有 100 mL纯化水的锥形瓶
中，加入一定量的纤维素酶(0． 1%、0． 3%、0． 5%、
0． 7%、0． 9%) ，在酶解温度为 50 ℃、酶解 pH 值为
4． 5 的条件下酶解 50 min，过滤，向滤渣中加入一定
量乙醇，进行常规回流提取。
2． 2． 2 酶解温度对槲皮素得率的影响 准确称取
10 g地锦草粉末，置装有 100 mL纯化水的锥形瓶中，
在纤维素酶用量为 0． 5%、酶解 pH 值为 4． 5 及一定
酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)条件下酶解 50 min，
过滤，向滤渣中加入一定量乙醇，进行常规回流提取。
2． 2． 3 酶解 pH值对槲皮素得率的影响 准确称取
10 g地锦草粉末，置装有 100 mL纯化水的锥形瓶中，
在纤维素酶用量为 0． 5%、酶解温度为 50 ℃及一定
pH 值(3． 5，4． 0，4． 5，5． 0，5． 5)条件下酶解时间
50 min，过滤，向滤渣中加入一定量乙醇，进行常规回
流提取。
2． 2． 4 酶解时间对槲皮素得率的影响 准确称取
10 g地锦草粉末，置装有 100 mL纯化水的锥形瓶中，
在纤维素酶用量为 0． 5%、酶解温度为 50 ℃、酶解
pH值为 4． 5 的条件下酶解一定时间(10，30，50，70，
90 min)，过滤，向滤渣中加入一定量乙醇，进行常规
回流提取。
2． 3 响应面试验
根据单因素试验结果，以纤维素酶用量(X1)、酶
解温度(X2)、酶解 pH值(X3)和酶解时间(X4)4 个因
素为自变量，以槲皮素得率(Y)为响应值，选用四因
素三水平的 Box － Behnken试验设计对槲皮素提取工
艺参数进行优化，具体试验因素与水平设计见表 1。
表 1 响应面分析的因素与水平设计
水平
因素
纤维素酶用
量(X1)/%
酶解温度
(X2)/℃
酶解 pH值
(X3)
酶解时间
(X4)/min
－ 1 0． 3 45 4． 0 30
0 0． 5 50 4． 5 50
+ 1 0． 7 55 5． 0 70
3 结果与分析
3． 1 单因素试验
3． 1． 1 纤维素酶用量对槲皮素得率的影响 结果见
图 2。
由图 2 可知，槲皮素得率随着纤维素酶用量的增
加而升高。当纤维素酶用量超过 0． 5%时，槲皮素得
率呈下降趋势。这是由于随着纤维素酶用量的增加，
促进了纤维素酶对药材细胞壁的降解作用，从而增加
槲皮素的溶出，但当纤维素酶用量超过 0． 5%之后，
纤维素酶与底物结合的位点达到饱和，进一步增加酶
用量会阻碍槲皮素的溶出。因此，纤维素酶用量宜选
择 0． 5%左右。
3． 1． 2 酶解温度对槲皮素得率的影响 结果见图 3。
由图 3 可知，槲皮素得率随着酶解温度的升高而
升高。当酶解温度超过 50 ℃时，槲皮素得率呈下降
·302·
№． 10，2016
图 2 纤维素酶用量对槲皮素得率影响的结果
图 3 酶解温度对槲皮素得率影响的结果
趋势。这是由于随着温度的不断升高，纤维素酶活性
不断增大，但当温度过高即超过纤维素酶的最适温
度，则可以引起纤维素酶的失活。因此，酶解温度宜
选择 50 ℃左右。
3． 1． 3 酶解 pH值对槲皮素得率的影响 结果见图 4。
图 4 酶解 pH值对槲皮素得率影响的结果
由图 4 可知，当酶解 pH 值为 4． 5 时，槲皮素得
率达到最高。由于 pH 值过低或者过高都会影响纤
维素酶的活力，从而影响纤维素酶降解破坏植物细胞
壁的作用，最终影响槲皮素得率。因此，最佳酶解 pH
值宜选择 4． 5 左右。
3． 1． 4 酶解时间对槲皮素得率的影响 结果见图 5。
由图 5 可知，酶解时间在 10 ～ 50 min 时，槲皮素
得率随着酶解时间延长而升高。当酶解时间超过
图 5 酶解时间对槲皮素得率影响的结果
50 min时，槲皮素得率不再增加且趋于平缓。因此，
酶解时间宜选择 50 min左右。
3． 2 响应面优化试验
3． 2． 1 Box － Behnken试验设计方案 结果见表 2。
表 2 Box － Behnken试验设计方案及结果
试验号 X1 X2 X3 X4
槲皮素得率 /
(mg·g －1)
1 1 0 0 － 1 1． 75
2 0 0 0 0 1． 86
3 1 － 1 0 0 1． 65
4 1 0 － 1 0 1． 70
5 － 1 － 1 0 0 1． 76
6 0 － 1 0 － 1 1． 62
7 0 0 － 1 － 1 1． 64
8 0 0 0 0 1． 87
9 0 1 0 1 1． 48
10 － 1 0 1 0 1． 56
11 0 0 1 － 1 1． 69
12 0 1 0 － 1 1． 69
13 0 － 1 0 1 1． 65
14 0 0 0 0 1． 86
15 0 － 1 1 0 1． 68
16 － 1 0 0 1 1． 50
17 － 1 0 － 1 0 1． 60
18 1 0 0 1 1． 60
19 1 1 0 0 1． 76
20 － 1 0 0 － 1 1． 64
21 0 0 － 1 1 1． 52
22 0 1 1 0 1． 55
23 1 0 1 0 1． 72
24 0 1 － 1 0 1． 61
25 0 0 1 1 1． 61
26 0 － 1 － 1 0 1． 62
27 0 0 0 0 1． 89
28 0 0 0 0 1． 84
29 － 1 1 0 0 1． 31
3． 2． 2 模型的建立及显著性检验 利用 Design －
Expert 8． 0． 6 软件对表 2 中的数据进行二次线性回
·402·
总第 511 期
归拟合，槲皮素得率与 4 个变量之间的二次多项回归
模型为:Y = 1． 860 0 + 0． 067 0X1 － 0． 048 0X2 +
0． 010 0X3 － 0． 056 0X4 + 0． 140 0X1X2 +
0． 015 0X1X3 － 0． 002 5X1X4 － 0． 030 0X2X3 －
0． 060 0X2X4 + 0． 010 0X3X4 － 0． 110 0X1
2 －
0． 130 0X2
2 － 0． 120 0X3
2 － 0． 130 0X4
2。回归统计分
析结果见表 3。
由表 3 可知，所建立的模型极显著(P ＜
表 3 回归统计分析结果
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0． 470 00 14 0． 033 00 26． 26 ＜ 0． 000 1 极显著
X1 0． 055 00 1 0． 055 00 43． 18 ＜ 0． 000 1 极显著
X2 0． 028 00 1 0． 028 00 22． 14 0． 000 3 极显著
X3 0． 001 20 1 0． 001 20 0． 95 0． 346 8 不显著
X4 0． 037 00 1 0． 037 00 29． 54 ＜ 0． 000 1 极显著
X1X2 0． 078 00 1 0． 078 00 61． 91 ＜ 0． 000 1 极显著
X1X3 0． 000 90 1 0． 000 90 0． 71 0． 413 4 不显著
X1X4 0． 000 03 1 0． 000 03 0． 02 0． 890 3 不显著
X2X3 0． 003 60 1 0． 003 60 2． 84 0． 113 9 不显著
X2X4 0． 014 00 1 0． 014 00 11． 37 0． 004 6 极显著
X3X4 0． 000 40 1 0． 000 40 0． 32 0． 583 0 不显著
X1
2 0． 078 00 1 0． 078 00 61． 42 ＜ 0． 000 1 极显著
X2
2 0． 110 00 1 0． 110 00 87． 57 ＜ 0． 000 1 极显著
X3
2 0． 087 00 1 0． 087 00 68． 63 ＜ 0． 000 1 极显著
X4
2 0． 110 00 1 0． 110 00 85． 90 ＜ 0． 000 1 极显著
残差 0． 018 00 14 0． 001 27
失拟项 0． 016 00 10 0． 001 64 4． 97 0． 068 0 不显著
纯误差 0． 001 32 4 0． 000 33
总误差 0． 480 00 28
注:Ｒ2 = 0． 963 3，ＲAdj 2 = 0． 926 6。
0． 000 1)，失拟项不显著，模型的决定系数(Ｒ2)为
0． 963 3，调整决定系数(ＲAdj
2)为 0． 926 6，说明该模
型拟合度较好，试验误差小，可用于槲皮素提取试验
设计。各自变量对槲皮素得率影响的顺序为:X1 ＞ X4
＞ X2 ＞ X3。一次项中，X1、X2、X4 对槲皮素提取率影
响极显著;二次项中，X1
2、X2
2、X3
2、X4
2 对槲皮素提取
率的影响均极显著;交互项中，X1X2、X2X4 对槲皮素
得率的影响极显著。
3． 2． 3 响应面分析 响应面图可较直观地描绘各参
数相互作用对响应值的影响情况，响应曲面的坡度越
陡峭，表明因素交互作用对响应值的影响越显著。通
过 Design － Expert 8． 0． 6 软件分析试验数据得到各因
素交互作用的响应面，见图 6。
由图 6 可知，纤维素酶用量和酶解温度、酶解温
度和酶解时间之间的交互作用对槲皮素得率影响最
显著，与方差分析结果一致。
3． 2． 4 最佳提取工艺条件的确定 通过 Design －
Expert 8． 0． 6 软件对酶解法辅助提取地锦草中槲皮
素的提取工艺条件进行优化，得到最佳酶解工艺条件
为:纤维素酶用量 0． 57%、酶解温度 50． 23 ℃、酶解
pH值 4． 52、酶解时间 45． 44 min，该条件下槲皮素得
率为 1． 88 mg /g。但考虑到实际操作的便利，将上述
工艺条件修正为:纤维素酶用量 0． 6%、酶解温度
50 ℃、酶解 pH值 4． 5、酶解时间 45 min。在此条件
下进行 3 次平行试验，同时将该工艺与常规乙醇回流
提取工艺进行比较，结果发现，在常规乙醇回流提取
工艺条件中槲皮素平均得率仅为 1． 23 mg /g，而酶解
法辅助提取槲皮素平均得率为 1． 87 mg /g，试验结果
与模型预测相对误差仅为 0． 53%。由此可见，与常
规乙醇回流提取法相比，酶解预处理步骤有效提高了
地锦草中槲皮素得率，提高 52． 03%。由此说明，通
过响应面法优化得到的酶解法辅助提取地锦草中槲
皮素的工艺条件准确可靠，具有实际应用价值。
4 结论
通过单因素试验确定了纤维素酶用量、酶解温
度、酶解 pH 值和酶解时间对槲皮素得率的影响规
律，应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及两
两因素之间的相互作用进行了研究，建立了预测槲皮
素得率的二次多项式数学模型，并得到最佳酶解工艺
条件:纤维素酶用量 0． 6%、酶解温度 50 ℃、酶解 pH
值 4． 5、酶解时间 45 min。在此条件下，槲皮素得率 为 1． 87 mg /g，与模型预测值吻合。由此建立的模型
·502·
№． 10，2016
图 6 各因素交互作用对槲皮素得率影响的响应面分析结果
合理可靠，为进一步研究提供了参考。
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总第 511 期